Procedure chirurgiche e metodologia per un modello preclinico murino di De Novo Metastasi del cancro del mammario

Sommario

Mancano modelli pre-clinici che valutano la terapia adiuvante che mirano alla metastasi del cancro al seno. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un modello murino di metastasi adenocarcinomi mammarie polmonari de novo , in cui le terapie somministrate nell'ambiente adiuvante (resezione chirurgica postale dei tumori primari) possono essere valutate per efficacia nell'effetto delle metastasi polmonari precedentemente seminate.

Abstract

Un aspetto limitante del tasso dei modelli murini transgenici di adenocarcinoma mammario è che il carico tumorale primario nel tessuto mammario definisce tipicamente gli endpoint dello studio. Pertanto, gli studi incentrati sul chiarimento dei meccanismi delle metastasi de novo in stadio avanzato sono compromessi, così come gli studi che esaminano l'efficacia delle terapie antitumorali mirate ai mediatori delle metastasi nel contesto adiuvante. Numerosi modelli murini di carcinoma mammario sono stati sviluppati attraverso l'espressione mirata di oncoproteine dominanti alle cellule epiteliali mammarie, producendo modelli che imitano in modo variabile i sottotipi di carcinoma mammario istopatologico e definito dal trascrittoma comuni nelle donne¹. Mentre molto è stato appreso riguardo alla biologia della cancerogenesi mammaria con questi modelli, la loro utilità nell'identificare le molecole che regolano la crescita delle metastasi in fase avanzata è compromessa poiché i topi vengono tipicamente soppressi in momenti precedenti a causa del significativo carico tumorale primario. Inoltre, poiché una percentuale significativa di donne con diagnosi di carcinoma mammario riceve una terapia adiuvante dopo la resezione chirurgica dei tumori primari e prima della presenza di malattia metastatica rilevabile, sono urgentemente necessari modelli preclinici di metastasi de novo come piattaforme per valutare nuove terapie volte a colpire i focolai metastatici. Per affrontare queste carenze, abbiamo sviluppato un modello murino di metastasi del cancro mammario de novo, in cui i tumori mammari primari vengono resecati chirurgicamente e i focolai metastatici si sviluppano successivamente in un periodo post-operatorio di 115 giorni. Questa lunga latenza fornisce un modello trattabile per identificare regolatori funzionalmente significativi della progressione metastatica nei topi privi di tumore primario, nonché un modello per valutare l'efficacia terapeutica preclinica di agenti volti a bloccare molecole funzionalmente significative che aiutano la sopravvivenza e la crescita del tumore metastatico.

Introduzione

Le donne dell'America settentrionale hanno un rischio di vita pari al ~ 12% per lo sviluppo del cancro al seno ² ; La maggioranza di questi individui avrà i tumori primari rimossi tramite chirurgia e, a seconda del sottotipo del cancro, riceverà terapia mirata, endocrina, chemioterapia e / o radioterapia nell'ambiente adiuvante ³ . Esempi includono, donne con diagnosi di cancro ormonale recettore-positivo che ricevono terapie anti-estrogeno e donne con tumori HER2-positivi che ricevono terapie con targeting HER2 con radiazioni / chemioterapia, mentre non sono disponibili terapie mirate per tumori negativi triplici ³ . Nonostante i progressi in radiazioni, chemioterapia, terapie personalizzate e ormonali che integrano la resezione chirurgica, la malattia si ripete nel 30-70% delle donne diagnosticate con la malattia di stadio II o III ⁴ , poiché le terapie sono in gran parte inefficaci nell'eradicazione della malattia metastatica negli organi distanti, Polmone, osso, bPioggia e / o fegato ⁵ . Ciò è particolarmente significativo in quanto quando si verifica una malattia metastatica in assenza di ricrescita tumorale primaria, ciò implica che le cellule maligne disseminate erano già probabilmente presenti negli organi secondari al momento della chirurgia definitiva. Quindi terapie in grado di sradicare o lenta crescita dei tumori metastatici sono urgentemente necessari.

Mentre i modelli de novo di cancro della carcinogenesi mammaria sono stati notevolmente informativi nei meccanismi rivelatori che regolano la progressione neoplastica ¹ , i modelli esistenti hanno anche diverse limitazioni. Uno di questi è il fatto che i modelli de novo transgenici sviluppano tipicamente tumori primari in molteplici ghiandole mammarie, in cui il carico tumorale primario limita la durata degli studi. Mentre la fuga di cellule tumorali primarie e la semina metastatica probabilmente si verificano all'inizio della progressione neoplastica in questi modelli, il sincero sviluppo di tumori metastatici si verifica in ritardo eN il modello del mouse e lo sfondo del ceppo, è spesso parzialmente penetrante ¹ . Ciò limita ulteriormente l'utilità dei modelli de novo per la scoperta di molecole che regolano la metastasi negli organi secondari e per la valutazione dell'efficacia preclinica dei terapeutici nell'ambiente adiuvante.

Per eludere queste limitazioni, abbiamo sviluppato un modello de novo autochthonous di metastasi del carcinoma mammario ai polmoni. Le femmine transgeniche parentali ( ovvero MMTV-PyMT sullo sfondo del ceppo FVB / n per gli studi qui descritti) che portano tumori mammari di tarda fase de novo sono invecchiati a ~ 100 giorni ⁶ , a quel punto i loro tumori primari sono resettati chirurgicamente e dissociati enzimaticamente in Sospensioni singole cellule. Le sospensioni (1 x 10 ⁶ cellule) sono a loro volta esplorate ortotropicamente in topi femmine singenici riceventi di 6-7 settimane, dove tumori mammari primari singoli si sviluppano in un periodo di 38-60 giorni ( Figura 1A). A una dimensione del tumore definita (172 a 450 mm ^3), topi riceventi sono anestetizzati e tumori primari sono chirurgicamente resecati tale che la ricrescita del tumore al sito chirurgico è minimizzato, coerente con la chirurgia nelle donne (figura complementare 1). Sullo sfondo del ceppo FVB / n, i topi sviluppano foci metastatiche rilevabili istologicamente nei polmoni con 45% di penetranza per ~ 115 giorni dopo la chirurgia ( Figura 1B ). Con questa lunga latenza di crescita tumorale metastatica, il modello è posizionato in modo univoco per la consegna di terapie adiuvante e per chiarire e valutare la biologia sottostante che influenza la progressione metastatica dopo la rimozione chirurgica dei tumori primari.

Protocollo

Gli animali utilizzati nel protocollo seguente sono coperti dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Oregon Health & Science, che è stato progettato per essere conforme alle normative vigenti in materia di benessere degli animali e della politica sanitaria pubblica (PHS).

Manutenzione delle condizioni sterili: devono essere utilizzati strumenti sterilizzati e tra i topi devono essere puliti con garza sterile, sciacquati in PBS e sterilizzati con disinfettante al 70% di etanolo per almeno 15 minuti. È necessario indossare un cappello chirurgico, una maschera facciale, un abito e guanti per gli interventi di sopravvivenza. La preparazione pre-operativa dell'animale per interventi di sopravvivenza è inclusa nel seguente protocollo. Fare riferimento alla tabella 1 per un elenco di reagenti e attrezzature.

1. Isolamento e preparazione di sospensioni di cellule singole da tumori primari del mammario

1. Anestetizzare i topi transgenici MMTV-PyMT (FVB / n) femmina donatrice di 100 giorni e mantenere sotto cOntinuosa sedazione somministrando 2% di isoflurano attraverso una maschera di anestesia. Confermare che il mouse sia correttamente anestetizzato con un riflesso a pinza assente.
2. In un ambiente sterile, i respirazione di tumori mammari primari da topi femmina transgenici MMTV-PyMT (FVB / n) di 100 giorni, separando il tumore mammario dalla pelle sovrapposta e dai tessuti adiposi circostanti e / o dai linfonodi usando forbici sterili. Eutanizzare i topi anestetizzati per dislocazione cervicale.
3. Con forbici sterili o un bisturi, sminuzzare tumori primari manualmente in piccoli pezzi (~ 1,0 millimetri ^3). Posizionare i tumori in 3,0 mg / mL collagenasi A e 4,0 U / mL DNasi I sciolti in DMEM. Utilizzare ~ 10 mL del suddetto mezzo di digestione per un tumore di diametro di 1,0 cm.
   1. Effettuare la digestione in una bottiglia sterile da 25 ml con una barra di stirata sterile a ~ 125 giri / min e 37 ° C per 40 min.
4. Fermare la digestione aggiungendo il siero fetale fetale (FBS) ad una diluizione finale del 10% e collocare l'intera miscela su wDove si mantiene.
5. Filtrare la sospensione tumorale digerita attraverso un filtro in nylon da 0,7 μm in un tubo conico da 50 ml e scartare qualsiasi tumore rimasto nel filtro. Centrifugare il surnatante a 300 xg a 4 ° C.
6. Resuspendere il pellet in 10 mL di DMEM per 1,0 cm di tumore e ri-filtrare attraverso un filtro in nylon da 0,7 μm. Conta concentrazione delle cellule, quindi centrifugare a 300 xg a 4 ° C.
7. Resuspendere il pellet nel 10% dimetilsolfossido con il 90% di FBS ad una concentrazione di 2 x 10 ⁷ cellule vive / mL. Conservare le sospensioni a cellule singole di intero tumore primario a -80 ° C.

2. Iniezione ortotopica del tumore mammario

1. Parzialmente scongelare le sospensioni tumorali primarie congelate a 37 ° C fino a quando il pellet congelato può essere rilasciato dal tubo criogenico in 20 mL di DMEM e contare le cellule. Centrifugare a 300 xg a 4 ° C e risospendere le cellule in 1: 1 DMEM: preparazione solubilizzata di membrana basale a fattore di crescita ridottaEstratto dal sarcoma del mouse di Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ad una concentrazione di 1 x 10 ⁷ cellule / ml (vedi tabella dei materiali ).
2. Mettere il lato ventrale femminile sinergico del ricevente anestetizzato e mantenere in sedazione continua somministrando 2% di isoflurano tramite una maschera di anestesia.
3. Sterilizzare il 4 ° sito di iniezione della ghiandola mammaria usando etanolo al 70% aerosolizzato e applicando Poly (vinilpirrolidone) -Iodina con un tampone sterile in cotone.
4. Iniettare 100 μL (1 x 10 ⁶ cellule vive dalle sospensioni tumorali primarie congelate) in senso inverso verso l'alto fino alla 4a ghiandola mammaria destra del 6- 10 settimane FVB / n femminile utilizzando una siringa da 29 g 0,3 ml di insulina.

3. Resezione chirurgica del tumore ortotopico del mammario

1. 38-60 giorni dopo l'iniezione delle cellule tumorali, eutanizzano i topi che non presentavano volumi tumorali ortotopici che vanno da 172 a 450 mm ³ in volume [lunghezza x (larghezza ² ) / 2] (circa il 75% dei topi iniettati).
2. Posizionare i topi anestetizzati visualizzando il lato ventrale appropriato del tumore fino alla sedazione continua somministrando 2% di isoflurano tramite una maschera di anestesia e confermare che il mouse è correttamente anestetizzato con un riflesso a pinza assente. Applicare unguento veterinario agli occhi per prevenire la secchezza durante la sedazione.
3. Spruzzare il 70% di etanolo per sterilizzare l'area chirurgica che circonda il tumore primario, quindi applicare Poly (vinilpirrolidone) -Iodina con un tampone sterile di cotone.
   NOTA: La rimozione dei capelli presso il sito chirurgico ha provocato estrazioni cutanee e / o infezioni per topi del ~ 5% e fu pertanto escluso da questo passaggio (dati non mostrati).
4. Come mostrato in Figura 1C , effettuare un'incisione iniziale della pelle usando forbici sbarrate medial-caudali al tumore.
5. Successivamente, fare un'escissione superiore della pelle ( Figura 1C ) mediale al tumore. Prestate attenzione alla necessità di cauterizzare qualsiasi vascolarizzazioneIl tumore posto sulla pelle prima di estendere l'incisione.
6. Continuare l'incisione della pelle lateralmente (posteriormente al tumore), quindi fare un'escisione superiore della pelle (laterale al tumore) e l'escissione mediale (superiore al tumore) ( Figura 1C ).
7. Dopo che la pelle è stata tagliata circonferenzialmente intorno al tumore ( Figura 1C ), sollevare la pelle sovrapposta attaccata al tumore utilizzando le pinze, mentre sbucchiando il tumore lontano dalla muscolatura della parete addominale e mantenendo intatte le ghiandole mammarie.
8. Identificare (per via smussa) e cauterizzare grandi vasi che attraversano i 4 ^° e 5 ^° ghiandola mammaria.
9. Excise circa la metà dei 4 ^° e 5 ^° ghiandole mammarie nel sito cauterizzazione per liberare il tumore, pelle sovrastante, e segmenti delle ghiandole mammarie (Figura 1C).
10. In caso di sanguinamento, identificare attivamente il sanguinamentoImbarcazioni e immediatamente cauterizzarle. Se si perde più di 250 μL di sangue, escludere il topo da studi e eutanizzarlo.
11. Chiudere i siti di escissione con le clip della ferita utilizzando un applicatore a clip ferito ( Figura 1C ).
    NOTA: Rimuovere le clip della ferita 10 giorni dopo l'intervento chirurgico con un rimontaggio della ferita.
12. Amministrare salina sterile calda subcutanea (4% del peso corporeo dell'animale) e mantenere l'animale caldo con una lampada di calore. Controllare gli animali ogni 5-10 minuti durante il recupero dall'anestesia.
    NOTA: L'amministrazione di bupivacaina o lidocaina ha aumentato la mortalità post-operatoria (dati non mostrati). I topi che mostravano segni di dolore (colpi, mancanza di spostamento, mancanza di sposo) sono stati eutanizzati 1 h dopo la chirurgia.
    1. Una volta che il mouse è completamente recuperato, restituirlo alla compagnia di altri topi.

4. Isolamento e trattamento di sangue e polmone per la citometria e l'istologia di flusso

1. All'inizio degli studi, preparare i topi per diverse valutazioni istopatologiche, se lo si desidera. 90 minuti prima dell'eutanasia, dare a ciascun topo un'iniezione intraperitoneale di bromodeossiridina (BrdU, 50 μg / g peso del mouse) a una concentrazione di 6,25 μg / μL in 1x PBS.
   NOTA: Le scorte congelate di bromodeossiridina sciolte vengono utilizzate entro un mese dalla preparazione.
2. 10 minuti prima dell'eutanasia, con il mouse anestetizzato, raccogliere il sangue retroorbitale (> 500 μL) utilizzando tubi capillari eparinizzati e successivamente trasferirli in tubi rivestiti con EDTA di potassio tenuto in ghiaccio.
3. Per rimuovere polmoni e restante tessuto mammario, fare un'incisione mediana con le forbici dal basso addome alla bocca per esporre la cavità toracica e peritoneali (Figura 2A), e staccare la pelle lateralmente per esporre anche i restanti right 4 ^° e 5 ^° mammaria ghiandole.
4. Accisa il residuo tessuto ghiandolare mammario e esamina iT per escludere la ricrescita tumorale primaria mediante la valutazione di un tessuto a base di paraffina (FFPE) fissato a forma di formalina a serie con la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E) ( Figura 1 supplementare ).
5. Per rimuovere i polmoni, aprire la parete addominale al diaframma con forbici, quindi eutanizzare l'animale tagliando l'aorta addominale per scaricare il sangue prima della perfusione dei polmoni ( Figura 2B -2C ).
6. Tagliare il diaframma lungo la gabbia toracica da un approccio addominale, assicurandosi di evitare il polmone e il cuore. Quindi esporre il torace tagliandone i lati laterali della gabbia toracica ( figura 2D ).
7. Usando un ago da 23 gauge su una siringa da 20 ml, perfezionare i polmoni con ~ 5,0 mL DPBS (~ 10 mL / min) attraverso il ventricolo destro del cuore fino a quando i polmoni diventano completamente bianchi ( Figura 2E -2F ). Immediatamente tagliare il cuore dalla vesse principaleCosì il sangue non ri-perfusa nel polmone.
8. Per i tessuti polmonari da fissare e lavorare per valutazioni istopatologiche, iniettare ~ 1,0 mL di formalina 10% a 4 ° C nel lato opposto alla trachea esposta fino ai polmoni usando un ago da 23 gauge ( Figura 2G - 2H ). Interrompere l'iniezione quando i polmoni sono completamente espandibili e riempiti con fissativo ( Figura 2I ).
9. I lobi polmonari di accisa dalla trachea e l'emersione fissano il tessuto polmonare in formalina neutra-tamponata per il successivo incorporamento di paraffina o il mezzo di congelamento OCT, secondo procedure istopatologiche standard.
10. Valutare quantitativamente l'onere metastatico nei polmoni mediante la sequenza seriale del tessuto polmonare FFPE e valutare le sezioni del microtomo (100 μm, tredici sezioni) mediante la colorazione H & E ( Figura 1B ).

Risultati

Più del 75% dei topi riceventi che ricevono 1 x 10 ⁶ cellule da tumori mammari primari derivati ​​da topi MMTV-PyMT, sviluppano singoli adenocarcinomi mammari che vanno da 172 a 450 mm ³ entro 38-60 giorni (dati non mostrati). I topi ammessi alla randomizzazione sono quindi iscritti in gruppi di studio dopo la resezione chirurgica dei tumori primari come mostrato ( Figura 1C ). La ricrescita tumorale primaria è stata identificata in men...

Discussione

Modifiche e risoluzione dei problemi:

Quando il tumore sbarrato dissezione dalla parete addominale, il tumore può rimanere aderente alla parete addominale. Questo è stato osservato in <5% di topi iniettati con tumore (dati non mostrati). Per i topi con tumori aderenti alla parete addominale, il topo deve essere eutanizzato in quanto la resezione è difficile senza ricrescita del tumore primario.

Limitazioni del modello / tecnica:

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescrizione
Collagenasi A	Roche	11088793001
DNasi I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 ml Flacone Pyrex	Sigma-Aldrich	CLS139525
Siero fetale bovino	Atlanta Bio	S11150
0.7 &; m filtro in nylon	Corning	352350
Provetta conica da 50 mL	VWR	89039-658
Dimetil solfossido	Sigma-Aldrich	D2650
Fattore di crescita ridotto Matrigel	BD	354230	Preparato di membrana basale solubilizzata a ridotto fattore di crescita estratto dal sarcoma del topo di Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)
Poli(vinilpirrolidone)... Complesso di iodio	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0,3 mL siringa da insulina	BD	324702
Kit cauterizzatore per piccoli vasi	FST	18000-00
Clip per ferite	Texas Scientific	205016
Applicatore di clip per ferite AutoClip	BD	427630
Dispositivo di rimozione della clip per ferite AutoClip	BD	427637
Bromodeossiuridina	Roche	10280879
Tubi capillari eparinizzati	Fisher	22362566
Provette per microtainer con EDTA dipotassico	Siringa BD	365974
20 mL	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-congelamento medio	VWR	25608930
Formalina, tamponata, 10% (tampone fosfato)	Fisher	SF100-4
ago da 23 g	Fisher	14-826-6B
FVB/n topo	Jackson Laboratories	001800