Articolo metodologico

3D Quantitative In Silico Modeling (q3DISM) di cerebrale amiloide-beta fagocitosi in roditori modelli di malattia di Alzheimer

DOI:

10.3791/54868

⸱

26 dicembre 2016

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California (USC)

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo sviluppato una metodologia per il 3D quantitativa in silico di modellazione (q3DISM) di cerebrale amiloide-β (Ap) fagocitosi da parte dei fagociti mononucleari in modelli di roditori della malattia di Alzheimer. Questo metodo può essere generalizzato per la quantificazione di praticamente qualsiasi evento fagocitaria in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuroinfiammazione è ormai riconosciuto come un importante fattore eziologico nella malattia neurodegenerativa. fagociti mononucleari sono cellule immunitarie innate responsabili della fagocitosi e la bonifica di detriti e detriti. Queste cellule sono macrofagi CNS residenti note come microglia, e fagociti mononucleari infiltrati dalla periferia. La microscopia ottica è stata generalmente utilizzati per la visualizzazione fagocitosi in roditori o campioni di cervello umano. Tuttavia, i metodi qualitativi non hanno fornito la prova definitiva di fagocitosi in vivo. Qui, descriviamo 3D quantitativa nella modellazione in silico (q3DISM), un metodo affidabile che permette una reale quantificazione 3D di amiloide-β (Ap) fagocitosi da parte dei fagociti mononucleari in modelli di roditori malattia di Alzheimer (AD). Il metodo consiste nel visualizzare fluorescente Ap incapsulato all'interno phagolysosomes nelle sezioni roditore cervello. Grandi serie di dati confocale z-dimensionale vengono poi ricostruite in 3D per la quantificazione di A &# 946; spazialmente colocalized all'interno del fagolisosoma. Dimostriamo l'applicazione di successo di q3DISM di topo e ratto cervello, ma questa metodologia può essere esteso a qualsiasi evento di fagocitosi in qualsiasi tessuto.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La malattia di Alzheimer (AD), la demenza legata all'età più comune 1, è caratterizzata da accumulo cerebrale amiloide-β (Ap) come placche "senili" beta-amiloide, neuroinfiammazione cronica di basso livello, tauopathy, perdita neuronale, e disturbi cognitivi 2 . In AD cervelli di pazienti, neuroinflammation è destinato dagli astrociti e fagociti mononucleari reattiva (indicato come microglia, anche se le loro centrali vs. origine periferica rimane poco chiaro) che circonda depositi Ap 3. Come le sentinelle del sistema immunitario innato del sistema nervoso centrale, microglia sono posizionati centralmente per cancellare il cervello Ap. Tuttavia, il reclutamento della microglia placche Ap è accompagnata da molto piccolo, all'occorrenza, Ap fagocitosi 4,5. Una ipotesi è che la microglia sono inizialmente neuroprotettivi da phagocytozing piccole assemblee di Ap. Tuttavia, alla fine queste cellule diventano neurotossico come opprimente fardello Ap e / o legate all'età d funzionaleecline, provoca microglia in un fenotipo proinfiammatoria disfunzionale, contribuendo alla neurotossicità e cognitivo declino 6.

Recenti studi genome-wide (GWAS Association) hanno identificato un gruppo di alleli di rischio AD appartenenti al nucleo innate percorsi immunitario 7 che modulano la fagocitosi 8-11. Di conseguenza, la risposta immunitaria alla deposizione di amiloide cerebrale è diventato un importante area di interesse, sia in termini di comprensione AD eziologia e per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici 12-14. Tuttavia, vi è la necessità vitale per metodologia per valutare fagocitosi Ap in vivo. Per rispondere a questa necessità insoddisfatte, abbiamo sviluppato 3D quantitativa in silico di modellazione (q3DISM) per consentire una vera quantificazione 3D cerebrale fagocitosi Ap dai fagociti mononucleari in modelli di roditori della malattia di Alzheimer-like.

Limitata solo dalla misura in cui esse ricapitolare malattia, modelli animali hannodimostrato prezioso per la comprensione AD pathoetiology e per la valutazione delle terapie sperimentali. A causa del fatto che le mutazioni nei geni presenilina (PS) e della proteina precursore dell'amiloide (APP) causano indipendentemente autosomica dominante dC, questi transgeni mutanti sono stati ampiamente utilizzati per generare modelli di roditori transgenici. Topi transgenici APP / PS1 coexpressing simultaneamente "svedese" mutante umano APP (APP SWE) e Δ esone 9 mutante presenilina umana 1 (PS1ΔE9) presente con accelerata amiloidosi cerebrale e neuroinfiammazione 15,16. Inoltre, abbiamo generato topi bi-transgenici coinjected con APP SWE e costrutti PS1ΔE9 (linea TgF344-AD, su uno sfondo di Fischer 344). A differenza dei modelli di topi transgenici di amiloidosi cerebrale, ratti TgF344-AD sviluppano amiloide cerebrale che precede tauopathy, perdita apoptotica di neuroni, e compromissione del comportamento 17.

In questo rapporto, si descrive un protocollo per immunostaining microglia, phagolysosomes e depositi Ap in sezioni del cervello di topi APP / PS1 e ratti TgF344-AD, e l'acquisizione di immagini di grandi dimensioni confocale z-dimensionale. Noi dettaglio nella generazione e l'analisi di veri ricostruzioni 3D di set di dati confocale che consentono la quantificazione di Ap assorbimento in phagolysosomes microgliali silico. Più in generale, la metodologia che we dettaglio qui può essere utilizzato per quantificare praticamente qualsiasi forma di fagocitosi in vivo.

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Protocollo

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Dichiarazione di etica della ricerca: Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali descritti nel presente documento sono stati approvati dalla University of Southern California Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC) ed eseguito in stretta conformità con National Institutes of linee guida per la salute e le raccomandazioni della Associazione per la valutazione e l'accreditamento del laboratorio Animal Care International.

1. roditori Cervello Isolamento e preparazione per Immunocolorazione

GIORNO 1:

  1. Posizionare ratti TgF344-AD di età (14 mesi) o APP / PS1 topi (12 mesi) in continuo anestesia isoflurano profonda (4%). Valutare la profondità di anestesia pinch punta e l'assenza di recesso reflex.
  2. Tagliare i due lati della gabbia toracica e sollevare per esporre il cuore. Inserire un ago G 23 nel ventricolo sinistro del cuore e fare una piccola incisione nell'atrio destro. Procedere alla dissanguamento da perfusione transcardial con PBS ghiacciata(PBS) utilizzando una pompa peristaltica (30 mL per topi; 150 - 200 ml per i ratti).
  3. Effettuare una incisione mediana caudale nella pelle e spostare la pelle ei muscoli da parte. Tagliare attraverso la parte superiore del cranio lungo la linea mediana e tra gli occhi. Rimuovere le piastre ossee e isolare l'intero cervello dal cranio.
  4. Mettere il cervello in una matrice roditore cervello coronale e si taglia in quarti. Incubare quarti posteriori O / N (16 h) in paraformaldeide fissativo (4% PFA in PBS) a 4 ° C. Lavare 3x in PBS, e poi il trasferimento al 70% di etanolo. Attenzione: PFA è tossico e deve essere manipolato sotto una cappa chimica con opportuni dispositivi di protezione individuale.

GIORNO 2:

  1. Posizionare quarti cerebrali in cassette incorporamento e progressivamente disidratano tessuto in bagni di etanolo 1 h in successione più concentrate (70%, 80%, 95% e 100% x3).
  2. Cancella l'etanolo dal tessuto con tre bagni successivi xilene 100% (1 ora ciascuno). Attenzione: xilene è tossico e should essere trattati sotto una cappa chimica con opportuni dispositivi di protezione individuale.
  3. Incorpora tessuti in blocchi di paraffina dopo due bagni fusi paraffina (56-58 ° C, 90 min ciascuna).

3 ° GIORNO:

  1. Tagliare 10 sezioni micron di spessore di cervelli in paraffina utilizzando un microtomo. sezioni Dip in un bagno d'acqua (50 ° C per 1 min) e si applicano a vetrini da microscopio. Lasciare le diapositive asciugare O / N, garantendo l'adesione dei tessuti alla diapositiva.

2. immunocolorazione

Nota: differenti combinazioni di anticorpi possono essere utilizzati per la procedura di colorazione descritta di seguito. Cocktail di anticorpi compatibili con il tessuto cerebrale di ratti e topi sono elencati nella tabella 1.

4 ° GIORNO:

  1. Deparaffinare sezioni del cervello che utilizzano 2x 100% bagni xilene (12 min ciascuna).
  2. Reidratare sezioni di cervello in bagni etanolo successive - 100% per 10 min, 95% per 5 min, 80% per 10 min, ed infine 70% per 15 min - followed da lavaggi PBS 3x [5 minuti a temperatura ambiente, con l'agitazione luce]. Nel frattempo, il calore soluzione antigene di recupero di 95-97 ° C su una piastra calda con magnetica barra di agitazione.
  3. Incubare sezioni di cervello in soluzione recupero dell'antigene a 95 - 97 ° C per 30 min. Poi, lavare 3x in PBS (5 minuti a temperatura ambiente, con l'agitazione della luce).
  4. Rapidamente diapositive a secco che utilizzano delicati tergicristalli attività per evitare l'essiccamento dei tessuti, e disegnare una barriera idrofobica intorno alla zona di tessuto con una penna barriera idrofoba. Riempire la regione tessuto circondato con tampone di bloccaggio [PBS contenente 0,3% Triton X-100 e il 10% Normal Donkey Serum (NDS)], ed incubare a temperatura ambiente per 1 h in una camera umidificata.
  5. Sostituire tampone di bloccaggio con Iba1 anticorpo primario (diluito in tampone bloccante) per etichettare fagociti mononucleari, e incubare O / N a 4 ° C in una camera umidificata. Per gli host di anticorpi e diluizioni di lavoro, vedi Tabella 1 e la Tabella dei Materiali.

GIORNO 5:

  1. Sciacquareanticorpo primario con i bagni 3x PBS (5 minuti a temperatura ambiente con agitazione luce). Incubare con immunofluorescenza secondario (coniugato con un fluorocromo di emissione 594 nm) per 1 h (in tampone di bloccaggio a RT al buio) seguita da bagni 3x PBS (5 min a RT agitazione luce). In questo momento, mantenere sezioni al buio per evitare fluorescente sbiancamento segnale.

Giorno 6 - 7:

  1. Ripetere i punti 2.5 e 2.6 con CD68 (cervello dei topi) o LAMP1 (tessuto mouse) anticorpi e appropriati anticorpi secondari (accoppiato con un fluoroforo emissione di 488 nm) per etichettare phagolysosomes.

Giorno 7 - 8:

  1. Ripetere i punti 2.5 e 2.6 con OC (tessuto di ratto) o 4G8 (cervello di topo) anticorpi e appropriati anticorpi secondari (accoppiato ad un fluoroforo 647 nm) per etichettare depositi Ap.
    NOTA: In alternativa, 6E10 anticorpo può essere utilizzato con successo sia sul topo e ratto tessuti. Per opportune combinazioni di anticorpi, vedere la tabella dei materiali .
  2. Lasciare sezioni completamente asciutta O / N a RT al buio. Poi, la copertura campioni con un vetrino sigillato da mezzi di montaggio fluorescenza contenenti DAPI.

3. Acquisizione di grande Z-stack confocale Dataset

Nota: Questo protocollo richiede una scansione laser confocale completamente automatizzato dotato di un obiettivo 60X e 405 nm, 488 nm, 594 nm e 647 nm laser. Tutto l'equipaggiamento è controllato da imaging e controllo laser software per computer. Prima di iniziare la procedura di imaging, accendere il computer, lampada epifluorescente, microscopio, laser e macchina fotografica.

9 ° giorno:

  1. Selezionare l'obiettivo microscopio 60X. Aggiungere l'olio di immersione alla lente, e posizionare il campione sul supporto del microscopio fase di diapositive. Sollevare l'obiettivo finché l'olio entra in contatto con la slitta. Regolare il piano focale per individuare placche amiloidi nell'ippocampo o corteccia cerebrale che utilizzano illuminazione epifluorescente attraverso gli oculari.
  2. Acquisire im confocaleetà compresa tra i fagociti mononucleari attivate circostanti depositi di amiloide nell'ippocampo o corteccia di roditori mediante microscopia confocale (ingrandimento 60X, passi z-stack: 0.25 micron

4. q3DISM

Nota: Al fine di produrre risultati significativi, si consiglia l'analisi di un minimo di 3 immagini per animale / regione di interesse. Per ogni immagine, l'abbondanza di cellule da analizzare può variare a seconda paradigmi sperimentali. Nei risultati rappresentativi riportati nella presente relazione, abbiamo analizzato 3 cellule / condizione (per esempio, fagociti mononucleari distanti da o associati a placche, vedi figure 1C - D e 2C - D).

GIORNO 10:

  1. Analizzare i set di dati confocale con colocalization elaborazione delle immagini 3D e analisi scientifiche software (coloc) modulo per la vicinanza spaziale di Iba1 / CD68 (tessuto di ratto) o Iba1 / LAMP1 (tessuto mouse) colorazione in tutte le z-aerei simultaneamente.Creare Iba + / CD68 + o canali Iba + / + LAMPADA1 colocalizzazione che corrispondono a phagolysosomes all'interno di fagociti mononucleari attivate.
    1. Selezionare TRITC per il canale A (corrispondente al Iba1 colorazione accoppiato con 594 nm fluoroforo) e FITC per il canale B (corrispondente al CD68 o colorazione LAMPADA1 accoppiato con 488 nm fluoroforo). Sul lato destro della finestra del software per il 'controllo modalità,' selezionare 'soglia' e per 'intensità coloc,' Select 'canali sorgente.
    2. Fare clic su 'Modifica' per selezionare 'colore coloc' sul lato destro della finestra del software.
    3. Per ogni canale in modo indipendente, regolare le soglie per includere colorazione specifica ed escludere sfondo / segnali non specifici. Una volta regolato, non modificare le soglie tra le immagini al fine di garantire un'analisi imparziale. I voxel colocalized (pixel da tutti gli z-stack) apparirà nel colore selezionato al punto 4.1.2 in tutte le z-stack SIMultaneously.
    4. Fare clic su 'costruire canale Coloc'. Il canale co-localizzazione creato apparirà nella finestra di regolazione del display.
    5. Fare clic sul canale coloc per aprire le statistiche del canale. Il '% del volume / materiale A di sopra della soglia colocalized' rappresenta la% di segnale Iba1 (voxel corrispondente al fluoroforo 594 nm) colocalizzava con LAMPADA1 o il segnale CD68 (voxel corrispondente al fluoroforo 488 nm). Più semplicemente, questo è il volume occupato da monociti phagolysosomes (vedi figure 1C e 2C).
      NOTA: '% del volume / materiale B di sopra della soglia colocalized' corrisponde ad% di LAMPADA1 o CD68 segnale colocalized con Iba1. Questo dovrebbe essere vicino al 100%, come phagolysosomes sono strutture intracellulari. I valori sono basati sul rapporto tra segnale da tutte z-stack sopra soglia colocalized.
  2. Utilizzando il modulo coloc, analizzare il canale coloc creato nel passo 4.1 per la vicinanza spaziale con OC (ti rattoSSUE) o 4G8 (tessuto mouse) segnali Ap. Ciò consente la quantificazione di Ap incapsulati all'interno phagolysosomes.
    1. Selezionare il canale A dataset coloc (corrispondente al Iba1 / CD68 o canale Iba1 / LAMP1 coloc creato nel passo 4.1) e Cy5 per il canale B (corrispondente a OC o 4G8 colorazione accoppiato con 647 nm fluoroforo).
    2. Costruire un canale coloc come descritto ai punti 4.1.2 a 4.1.5.
    3. Fare clic sul canale coloc per aprire le statistiche del canale. Il '% del volume / materiale A di sopra della soglia colocalized' rappresenta la% di Iba1 / LAMPADA1 o Iba1 / CD68 (voxel corrispondente al canale coloc costruito nel punto 4.1.5.) Colocalized con OC o il segnale 4G8 (voxel corrispondente al 647 nm fluoroforo). Questo è il volume occupato da fagolisosomale Ap (vedi figure 1D e 2D).
      NOTA: '% del volume / materiale B di sopra della soglia colocalized' corrisponde% del segnale Ap totale colocalized con phagolysosomes.Questo può essere utilizzato per valutare la frazione dei depositi totali Ap incapsulati all'interno phagolysosomes (non mostrato nelle presenti risultati rappresentativi).
  3. Utilizzare il modulo superare per ricostruire le pile di immagini confocale e generare modelli 3D di A? Incapsulati all'interno phagolysosomes monociti.
    1. Nella finestra 'di regolazione del display', selezionare TRITC (per mostrare colorazione solo Iba1). Nella finestra 'Proprietà volume', clicca su 'aggiungi nuova superficie'.
    2. Nel passo '1/5 algoritmo', in 'Impostazioni', selezionare 'superficiale.' Inoltre, in 'colore', selezionare il tipo di colore nella tavolozza o RGB e regolare la trasparenza (rosso è fissato al 60% di trasparenza nelle figure 1B e 2B). Casella 'di selezionare la regione di interesse'. Fare clic su Avanti.
    3. Nel passaggio '2/5 regione di interesse,' disegnare una finestra attorno alla cella di interesse regolando x, y, z coordinate (vedi caselle bianche in figure 1A e 2A). Fare clic su Avanti.
    4. Nel passaggio '3/5 canale sorgente', selezionare il canale di origine TRITC. Selezionare la casella 'liscia', e impostare il livello di dettaglio superficie di 0,4 micron. Per 'soglia', selezionare l'intensità assoluta. Fare clic su Avanti.
    5. Nel passaggio '4/5 soglia,' regolare soglia in modo che il volume creato sovrappone perfettamente con il segnale del canale TRITC. Fare clic su Avanti.
    6. Nel passaggio '5/5 classificare superfici,' nella sezione 'filtro', selezionare gli oggetti in base alla loro dimensione per includere o escludere dai volumi da creare. Fare clic su Fine, eseguire tutte le fasi di creazione, e uscire dalla procedura guidata.
    7. Ripetere i punti da 4.3.1 a 4.3.6 per creare una superficie 3D per il canale FITC (LAMPADA1 + o CD68 + phagolysosomes).
    8. Ripetere i punti da 4.3.1 a 4.3.6 per creare una superficie 3D per il canale Cy5 (OC + o depositi 4G8 + Ap).

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Risultati

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Utilizzando la metodologia più stadi per q3DISM dettagliato sopra, siamo in grado di quantificare l'assorbimento Ap in phagolysosomes monociti nel cervello di APP / PS1 topi (figura 1) e ratti TgF344-AD (Figura 2). Pertanto, la metodologia q3DISM ha permesso l'analisi dei fagociti mononucleari in modelli di topo e ratto di AD. È interessante notare che il volume occupato da CD68 + phagolysosomes è significativamente aumentata in fagociti monon...

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Discussione

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Il protocollo che descriviamo in questa relazione per una vera quantificazione 3D di Ap fagocitosi in vivo dai fagociti mononucleari si basa sulla etichettatura specifica dei compartimenti cellulari e subcellulari così come depositi di Ap. In particolare, usiamo Iba1 (ionizzata-calcio Binding Adaptor molecola 1), una proteina che è coinvolta nella arruffarsi membrana e fagocitosi delle cellule dopo l'attivazione 18, 19, a macchia fagociti mononucleari cerebrali. Mentre le ce...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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M-V. G-S. è supportato da un Alzheimer's Disease Research Fellowship Award (A2015309F) della BrightFocus Foundation e da un Alzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. è supportato da una Fondazione ARCS e dalla John Douglas French Alzheimer's Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, a T.T.), da un Alzheimer's Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, a T.T.) e da un American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, a T.T.). Siamo grati per i fondi di avvio dell'Istituto di Neurogenetica di Zilkha, che hanno contribuito a rendere possibile questo lavoro.  

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
IsofluranoAbbottNDC 0044-5260-05
Forbici da dissezioneVWR82027-582
Forbici da dissezione Punta smussataVWR82027-588
PinzetteVWR94024-408
ago da 23 GVWRBD305145
pompa peristaltica FH10Thermo Scientific72-310-010
PBS 10xBioland ScientificPBS01-02Soluzione salina tamponata con fosfato; Concentrazione di lavoro 1x
Matrice cerebrale di topo adulto, fette coronali, acciaio inossidabile 1 mm Kent ScientificRBMS-200C
Matrice cerebrale di ratto adulto, fette coronali, acciaio inossidabile 1 mm Kent ScientificRBMS-305C 
Soluzione acquosa di paraformaldeide al 32% (PFA)EMS15714-SAttenzione: Tossico. Concentrazione di lavoro: 4% in PBS
EtanoloVWR89125-188Varie concentrazioni, vedere il protocollo
Tissue-Tek Uni-cassette SakuraVWR25608-774
Inclusione e infiltrazione ParaffinaVWR15147-839
Microtomo Leica RM2125Leica Biosystems
Lame per microtomo monouso VWR25608-964
Bagnomaria Leica HI 1210Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plusVWR48311-703
XyleneSigma-Aldrich534056-4X4LAttenzione: Tossico 
Soluzione per il recupero del bersaglio 10xDAKOS1699Concentrazione di lavoro 1x
KimWipesVWR21905-026
Penna PAP idrofobicaVWR95025-252
Triton X-100VWR97062-208
Siero d'asino normale (NDS)Jackson Immuno017-000-121
Vetrini coprioggettiVWR48393081
Reagente antisbiadimento Prolong Gold con DAPILife TechnologiesP36935
Slide RackVWR100492-942
Anticorpo Iba1 (policlonale, coniglio)Wako019-19741 Concentrazione di lavoro 1:200
Anticorpo Iba1 (policlonale, caprino)LifeSpan BioscienceLS-B2645Concentrazione di lavoro 1:200
anticorpo CD68 [KP1] di ratto (monoclonale, topo)Abcamab955Concentrazione di lavoro 1:200
topo CD68 [FA-11] anticorpo (monoclonale, ratto)Abcamab53444Concentrazione di lavoro 1:200
topo CD107a (LAMP1) anticorpo (monoclonale, ratto)Affymetrix14-1071Concentrazione di lavoro 1:100
Beta-amiloide, 17 - 24 (4G8) anticorpo (monoclonale, topo)CovanceSIG-39220Concentrazione di lavoro 1:200
Beta-amiloide, 1 - 16 (6E10) anticorpo (monoclonale, topo)CovanceSIG-39320Concentrazione di lavoro 1:200
anticorpo OC (policlonale, coniglio)Donato da D. H. Cribbs e C. G. Glabe (UC Irvine)Concentrazione di lavoro 1:200
Alexa Fluor 488 anticorpo secondario di topoInvitrogenA-11001Concentrazione di lavoro 1:1.000
Alexa Fluor 488 anticorpo secondario di rattoInvitrogenA-11006Concentrazione di lavoro 1:1.000
Alexa Fluor 594 anticorpo secondario di coniglioInvitrogenA-11037Concentrazione di lavoro 1:1.000
Alexa Fluor 594 anticorpo secondario di capraInvitrogenA-11080Concentrazione di lavoro 1:1.000
Alexa Fluor 647 anticorpo secondario di topoInvitrogenA-21235Concentrazione di lavoro 1:1.000
Alexa Fluor 647 anticorpo secondario di coniglioInvitrogenA-21443Concentrazione di lavoro 1:1.000
Olio da immersioneNikon 
Microscopio confocale A1Nikon 
Software di ricerca avanzata NIS ElementsNikon
Imaris:Bitplane versione software 7.6Bitplane"coloc" e "supass". In alternativa, il freeware open source ImageJ può essere utilizzato per la colocalizzazione  Analisi di dataset confocali Z-stacks.
Glass Vengono utilizzati i moduli

Riferimenti

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