Articolo metodologico

Inducibile LAP-tagged linee cellulari stabili per indagare la funzione delle proteine, Spatiotemporal Localizzazione e reti di interazione proteina

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DOI:

10.3791/54870

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24 dicembre 2016

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un metodo per generare linee cellulari stabili inducibili marcate con localizzazione e purificazione di affinità (LAP) per studiare la funzione delle proteine, la localizzazione subcellulare spaziotemporale e le reti di interazione proteina-proteina.

Abstract

I complessi multiproteici, piuttosto che le singole proteine che agiscono in isolamento, spesso governano i percorsi molecolari che regolano l'omeostasi cellulare. Sulla base di questo principio, la purificazione delle proteine critiche necessarie per il funzionamento di queste vie insieme ai loro partner nativi interagenti non solo ha permesso la mappatura dei costituenti proteici di queste vie, ma ha anche fornito una comprensione più profonda di come queste proteine si coordinano per regolare queste vie. In questo contesto, la comprensione della localizzazione spazio-temporale di una proteina e della sua rete di interazione proteina-proteina può aiutare a definire il suo ruolo all'interno di un percorso, nonché come la sua errata regolazione possa portare alla patogenesi della malattia. Per soddisfare questa esigenza, sono stati progettati e utilizzati con successo diversi approcci per la purificazione delle proteine, come la purificazione di affinità tandem (TAP) e la purificazione di localizzazione e affinità (LAP). Tuttavia, al fine di applicare questi approcci alle analisi proteomiche su scala di percorso, queste strategie devono essere integrate con i moderni sviluppi tecnologici nella clonazione e nella generazione di linee cellulari stabili nei mammiferi. Qui, descriviamo un metodo per generare linee cellulari stabili umane inducibili con tag LAP per studiare la localizzazione subcellulare delle proteine e le reti di interazione proteina-proteina. Questo approccio è stato applicato con successo alla dissezione di molteplici vie cellulari, compresa la divisione cellulare, ed è compatibile con analisi proteomiche ad alto rendimento.

Introduzione

Per studiare la funzione cellulare di una proteina non caratterizzata, è importante determinare la sua localizzazione subcellulare spazio-temporale in vivo e i suoi partner proteici interagenti. Tradizionalmente, i tag epitopici singoli e tandem fusi all'estremità N o C di una proteina di interesse sono stati utilizzati per facilitare la localizzazione proteica e gli studi di interazione proteica. Ad esempio, la tecnologia di purificazione di affinità tandem (TAP) ha permesso l'isolamento di complessi proteici nativi, anche quelli che sono in bassa abbondanza, sia in linee cellulari di lievito che di mammiferi1,2. La tecnologia di localizzazione e purificazione di affinità (LAP) è uno sviluppo più recente che modifica la procedura TAP per includere una componente di localizzazione attraverso l'introduzione della proteina fluorescente verde (GFP) come uno dei tag dell'epitopo3. Questo approccio ha fornito ai ricercatori una comprensione più profonda della localizzazione subcellulare di una proteina nelle cellule viventi, pur mantenendo la capacità di eseguire purificazioni complesse TAP per mappare le reti di interazione proteina-proteina.

Tuttavia, ci sono molti problemi associati all'uso delle tecnologie TAP/LAP che hanno ostacolato il loro uso diffuso nelle cellule di mammifero. Ad esempio, il tempo necessario per generare una linea cellulare stabile che esprime una proteina di interesse marcata con TAP/LAP; che in genere si basa sulla clonazione del gene di interesse in un vettore virale e sulla selezione di integranti stabili a singola cellula con il livello di espressione desiderato. Inoltre, molte vie cellulari sono sensibili alla sovraespressione delle proteine costitutive (anche a bassi livelli) e possono arrestare le cellule o innescare la morte cellulare nel tempo, rendendo impossibile la generazione di una linea cellulare stabile TAP/LAP. Questi e altri vincoli hanno impedito alle metodologie LAP/TAP di diventare sistemi ad alto rendimento per la localizzazione e la delucidazione dei complessi proteici. Pertanto, c'è stato un notevole interesse per lo sviluppo di un sistema di marcatura LAP inducibile ad alto rendimento per cellule di mammifero che tragga vantaggio dalle attuali innovazioni nella clonazione e nelle tecnologie delle linee cellulari.

Qui presentiamo un protocollo per la generazione di linee cellulari stabili con proteine di interesse LAP-taged inducibili con Doxiciclina/Tetraciclina (Dox/Tet) che applica i progressi sia nella clonazione che nelle tecnologie delle linee cellulari di mammifero. Questo approccio semplifica l'acquisizione di dati per quanto riguarda la localizzazione subcellulare delle proteine marcate con LAP, la purificazione dei complessi proteici e l'identificazione delle proteine interagenti4. Sebbene la proteomica di affinità utilizzi un'ampia gamma di tecniche per la delucidazione dei complessi proteici5, il nostro approccio è vantaggioso per accelerare l'identificazione di questi complessi e delle loro reti di interazione native ed è suscettibile di marcatura proteica ad alto rendimento, necessaria per studiare percorsi biologici complessi che contengono una moltitudine di costituenti proteici. La chiave di questo approccio sono i progressi nelle strategie di clonazione che consentono una clonazione ad alta fedeltà e accelerata di geni bersaglio in una serie di vettori per l'espressione genica in vitro, in vari organismi come batteri e baculovirus e in cellule di mammifero6,7. Inoltre, la collaborazione ORFeome ha clonato migliaia di frame di lettura aperti convalidati da sequenze in vettori che incorporano questi progressi nella clonazione, che sono disponibili per la comunità scientifica8-11. Nel nostro sistema, il vettore di tagging LAP pGLAP1 consente la clonazione simultanea di un gran numero di cloni, il che facilita il tagging LAP ad alto rendimento. Questa procedura di clonaggio accelerata è abbinata a un approccio semplificato per la generazione di linee cellulari con geni di interesse marcati con LAP inseriti in un singolo locus genomico predeterminato. Questo fa uso di linee cellulari che contengono un singolo sito target di riconoscimento della flippasi (FRT) all'interno del loro genoma, che è il sito di integrazione per i geni marcati con LAP. Queste linee cellulari esprimono anche il repressore della tetraciclina (TetR) che si lega agli operatori Tet (TetO2) a monte dei geni marcati con LAP e ne silenzia l'espressione in assenza di Dox/Tet. Ciò consente l'espressione inducibile Dox/Tet della proteina marcata con LAP in un dato momento. Avere la capacità di espressione inducibile di proteine marcate con LAP è fondamentale, poiché molte vie cellulari sono sensibili ai livelli di proteine critiche che governano la via e possono arrestare la crescita cellulare o innescare la morte cellulare quando queste proteine sono costitutivamente sovraespresse, anche a bassi livelli, rendendo impossibile la generazione di linee cellulari stabili non inducibili con LAP-tagged12.

Protocollo

NOTA: Una panoramica della generazione di linee cellulari stabili LAP-tag inducibili per qualsiasi proteina di interesse è illustrato nella figura 1 e la panoramica di espressione proteica LAP-tag, purificazione e la preparazione proteomica massa analisi è illustrato nella figura 3.

1. Clonazione Open Reading Frame (ORF) del gene di interesse nel LAP-tag Vector

  1. Clonazione ORF del gene di interesse nel vettore navetta.
    1. Utilizzare reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare la ORF di interessi con gli opportuni siti attB1 e attB2 all'interno dei primer sia per fusione N-terminale o fusione C-terminale. Vedere la Tabella 1 per le sequenze primer e Tabella 2 per le condizioni di PCR.
    2. Gel purificare i prodotti di PCR per risolverli su un gel di agarosio 1%. Asportare la band amplificato che è la dimensione corretta dal gel ed estrarlo dalla fetta di gel utilizzando un DNA gkit di estrazione el secondo le istruzioni del produttore.
    3. Incubare la ATTB purificato contenente prodotti di PCR con un ATTP contenente vettore navetta e la ricombinasi che permette ai prodotti di PCR per ricombinare nel vettore secondo le istruzioni del produttore (vedi ento tabella).
      NOTA: vettori navetta vuoti e LAP-tagging vettori contengono il gene ccd B e devono essere propagato in cellule batteriche resistenti ccd B (vedi Materiali Tavolo). Tuttavia il gene CCDB viene ricombinato quando un ORF è inserito in questi vettori, quindi usare le cellule normali coli DH5α E. Quando moltiplicazione vettori con ORF clonati.
    4. Trasformare cellule di E. coli DH5α con 1 ml del prodotto di reazione e piastra le cellule trasformate su un brodo Luria (LB) piastra di agar con 50 mg / ml kanamicina 13.
    5. Selezionare le colonie resistenti kanamicina.
    6. Far crescere le colonie selezionate in LB media con 50 mg / ml kanamicina, fare una mini-prep DNA e confermare l'integrazione del gene per il sequenziamento del DNA utilizzando i primer di sequenziamento elencati nella tabella 3.
  2. Trasferimento del gene di interesse dal vettore Shuttle nel LAP-tag Vector.
    1. Incubare il vettore shuttle contenente la sequenza verificato gene di interesse ORF con il LAP-tag vettoriale (pGLAP1 per la fusione N-terminale) e la ricombinasi che media il trasferimento del gene di interesse dal vettore shuttle nel vettore LAP-tag secondo le istruzioni del produttore (vedi Materiali).
      NOTA: Una serie di vettori LAP / TAP che possono essere utilizzati in base promotore desiderato, epitopi-tag, e N o marcatura C-terminale possono essere trovati nella tabella 4.
    2. Trasformare cellule di E. coli DH5α con 1 ml del prodotto di reazione e piastra le cellule trasformate su una piastra di agar LB con 100 mg / ml ampicillina 13.
    3. Selezionare il colo resistente ampicillinaNies.
    4. Far crescere le colonie selezionate in LB media con 100 mg / ml ampicillina, fare un DNA mini-prep, e confermare l'integrazione del gene per il sequenziamento del DNA utilizzando i primer di sequenziamento elencati nella tabella 5.

2. Generazione di un inducibile Stabile linea cellulare che esprime il gene LAP-tag di interesse

  1. Selezionare la linea cellulare più adatto per il progetto di interesse. In alternativa, creare una linea di cellula ospite da qualsiasi linea cellulare esistente che esprime costitutivamente il TetR e contiene un sito FRT che permette il gene LAP-tag di interesse da stabilmente integrato nel genoma (vedi Materiali).
    NOTA: Questo protocollo utilizza una linea cellulare HEK293 che contiene il TetR e un sito FRT, coltivato in -Tet DMEM / F12 supporti [fornito con 10% di siero fetale bovino (FBS) che è privo di tetraciclina (-Tet)] 4 .
  2. Determinare la concentrazione minima di Hygromycin necessario per uccidere la linea di cellula ospite entro 1 a 2 Weeks dopo tossicodipendenza. La concentrazione può variare tra linee cellula ospite, con la maggior parte compresa tra 100 mg / ml e 800 mg / ml.
    NOTA: HEK293 cellule coltivate in -Tet DMEM media / F12 con 100 ug / ml Hygromycin a 37 ° C e 5% di CO 2 morirà entro 1-2 settimane.
  3. Co-trasfezione del vettore che esprime la ricombinasi flippase (media l'integrazione del gene LAP-tag di interesse nel sito FRT nel genoma della cellula) con il vettore LAP-tag in cellule HEK293 utilizzando un reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore . Utilizzare un rapporto di 4: 1 di ricombinasi vettore a vettore LAP 14.
    NOTA: Il rapporto ottimale dipende dalla linea cellulare ospite e metodo di trasfezione, e può richiedere una titolazione. Un rapporto di 4: 1 funziona bene per la maggior parte delle linee cellulari. Include una piastra di mock-transfettate come controllo negativo.
  4. Un giorno dopo la trasfezione, sostituire la media / F12 -Tet DMEM con mezzi freschi.
  5. Due giorni dopo transfectisu, celle divise al 25% di confluenza. Consentono alle cellule ~ 5 ore da allegare, quindi aggiungere Hygromycin contenenti media / F12 -Tet DMEM alla concentrazione prefissata in fase 2.2. Per HEK293 cellule usano 100 mg / ml Hygromycin.
    NOTA: La FRT contenente linea cellulare HEK293 contiene anche la TetR che è associato con la resistenza Blasticidin, quindi 5 mg / ml Blasticidin viene utilizzata durante il processo di selezione linea cellulare stabile selezionare per la TetR e per minimizzare l'espressione perde.
  6. Sostituire Hygromycin contenenti -Tet DMEM media / F12, se necessario fino a foci di cellule distinte sembrano che assomigliano macchie opache contro la lastra trasparente.
  7. Aggiungere 20 ml di tripsina in cima ad ogni foci di cellule e pipettare su e giù 2 volte con una punta di pipetta 200 microlitri. Cellule posto in un piatto ben 24 e ampliare le cellule di crescita continua in Hygromycin contenenti -Tet DMEM / F12 supporti.
  8. cellule dello schermo per l'espressione della proteina LAP-tag inducibile per cella fissa o live-cell microscopia a fluorescenza e / oWestern blotting per il tag GFP all'interno del LAP-tag 15.

3. La purificazione di complessi proteici LAP-tag

Nota: Le seguenti lap-tag purificazione di proteine ​​dettagli del protocollo raccomandazioni sulle condizioni e volumi utilizzati per un tipico purificazione delle proteine ​​LAP-tag sulla base dell'esperienza precedente. Tuttavia, si deve prestare attenzione al fine di garantire che l'ottimizzazione empirica viene effettuata per ogni complesso di proteine ​​e proteine ​​livello di espressione di interesse per fornire i migliori risultati.

  1. Crescita delle cellule e Cell raccolta.
    1. Espandere la linea cellulare LAP-tag convalidato per l'isolamento TAP di complessi proteici, per passaging continuamente tutti HEK293 cellule in piatti più grandi e / o bottiglie a rulli in -Tet DMEM media / F12 a 37 ° C e 5% di CO 2.
    2. Per linee cellulari inducibili Tet / Dox, indurre il 10-15 ore ad una concentrazione di 0,2 mg / ml Tet / Dox quando le cellule raggiungono ~ 70% di confluenza, prima harvestincellule g.
      NOTA: Il tempo di concentrazione e di induzione deve essere determinata per ogni proteina, si raccomanda una titolazione di 0,1-1 mg / ml Tet / Dox per 10-15 ore.
    3. Celle di raccolta di agitazione o cellule tripsinizzazione e pellet a 875 xg per 5-10 min.
  2. Giunto anti-GFP anticorpi per Beads Proteina A
    1. Utilizzare 40 mg di anticorpo per immunoprecipitazione da un lisato preparato da un pellet di 0,5 ml di cellule, ematocrito (PCV).
      NOTA: La quantità di anticorpo necessaria dipenderà l'abbondanza della proteina LAP-tag, tra gli altri fattori, e richiederà ottimizzazione. Si raccomanda una titolazione di 10-40 mg.
    2. Equilibrare 160 microlitri di volume imballato (PV) Proteina A perline in PBST (PBS + 0,1% Tween-20) in una provetta da 1,5 ml. Lavare 3 volte con 1 ml di PBST.
      NOTA: Tutti i lavaggi nel presente documento sono effettuate mediante centrifugazione le perline a 5.000 xg per 10 sec.
    3. perline risospendere in 500 microlitri PBST e aggiungere 80 mg di affinità-purified coniglio anti-GFP anticorpi a ciascuna provetta di 160 perline microlitri. Mescolare per 1 ora a temperatura ambiente (RT).
    4. Lavare perline 2 volte con 1 ml di PBST. Poi, lavare perline 2 volte con 1 ml di 0,2 M sodio borato, pH 9 (+ 15 ml di 0,2 M di acido borico 20 ml di 0,2 M sodio borato). Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 900 ml di borato 0,2 M di sodio, pH 9 per portare il volume finale a 1 ml.
    5. Aggiungere 100 ml di 220 mM dimethylpimelimidate (DMP) ad una concentrazione finale di 20 mM. Ruotare delicatamente le provette a temperatura ambiente per 30 min. Per 220 mm DMP, risospendere contenuto di un flacone da 50 mg in 877 ml di 0,2 M borato di sodio, pH 9 e aggiungere immediatamente alla sospensione tallone.
    6. Dopo l'incubazione con DMP, lavare perline 1 volta con 1 ml di 0,2 M etanolammina, 0,2 M di NaCl pH 8,5 per inattivare il reticolante residua. perline risospendere in 1 ml dello stesso tampone e ruotare per 1 ora a temperatura ambiente. perline pellet e perline risospendere in 500 ml di 0,2 M etanolammina, 0,2 M di NaCl pH 8,5. Beads sono stabili per SeveraL mesi a 4 ° C.
  3. Preparazione del buffer per Cell Lysis e purificazione Complex
    1. Preparare buffer LAPX (dove X è la concentrazione di sale desiderato [mm KCl] del buffer LAP, 300 mm per la lisi cellulare, 200 mm per la maggior parte dei lavaggi di perline, e 100 mm per perle di lavaggio prima del rilascio di proteine), facendo un pH 7,4 soluzione contenente 50 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES), X mM KCl, 1 mM di acido etilen glicole tetraacetico (EGTA), 1 mM MgCl 2 e 10% glicerolo.
      NOTA: I componenti di questo buffer vengono utilizzati per approssimare l'ambiente in cellule viventi. HEPES è usato come un buffer in rabbia pH di 7,2-8,2. KCl è un sale usato per mantenere la forza ionica del tampone. EGTA è un agente chelante che lega ioni calcio per ridurre i livelli di calcio rispetto al magnesio. Glicerolo e MgCl 2 sono utilizzati per migliorare la stabilità delle proteine.
    2. Preparare tampone LAPX N con l'aggiunta di 0,05% nonil phenoxypolyethoxylethanol al buffer LAPX.
      NOTA: Nonil phenoxypolyethoxylethanol è un detergente delicato che solubilizza le proteine, ma conserva le interazioni proteina-proteina, in tal modo una maggiore concentrazione viene utilizzato durante il processo di estrazione e viene quindi abbassata durante le fasi vincolanti e lavaggio.
  4. Preparazione di lisati cellulari
    1. Risospendere 500 ml di PCV in 2,5 ml di LAP300 con 0,5 mM ditiotreitolo (DTT) e inibitori della proteasi. Aggiungere 90 ml di 10% phenoxypolyethoxylethanol nonil (0,3% finale) e mescolare per inversione.
    2. Mettere in ghiaccio per 10 min. Centrifugare a 21.000 g per 10 min. Raccogliere questa surnatante bassa velocità (LSS). Prendere un campione di 10 ml del LSS per l'analisi del gel.
    3. Trasferimento LSS ad un tubo TLA100.3 e far girare a 100.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Raccogliere il surnatante alta velocità (HSS), in un tubo e disporli sul ghiaccio. Prendere un campione di 10 ml di HSS per l'analisi del gel.
      NOTA: evitare di prendere la parte superiore di uno strato più lipidicod fondo più strato di detriti cellulari. Lo strato di lipidi deve essere rimosso mediante aspirazione a vuoto prima di raccogliere HSS.
  5. Prima Affinity Capture: Legatura di Beads anti-GFP
    1. Pre-Eluire anticorpi accoppiato perline (utilizzano 160 ml di perle per 0,5 ml di pellet cellulare (PCV)) lavando loro 3 volte con 1 ml di tampone di eluizione [3,5 M MgCl 2 con 20 mM Tris, pH 7.4] per sbarazzarsi di disaccoppiato anticorpi e riducono sfondo. Fare in fretta. Non lasciare perline in alto sale per un lungo periodo di tempo.
    2. Lavare perline 3 volte con 1 ml di LAP200 N. Mescolare HSS estrarre con perle di anticorpi per 1 ora a 4 ° C. Centrifugare a 21.000 g per 10 min. Prelevare 10 ml di surnatante (cioè, il flusso attraverso (FT)) per l'analisi del gel.
    3. Lavare perline 3 volte con 1 ml di LAP200 N con 0,5 mm DTT e inibitori della proteasi. Lavare perline 2 volte (5 minuti ciascuno) con 1 ml di LAP200 N con 0,5 mm DTT e inibitori della proteasi. Lavare rapidamente 2 tIME con 1 ml di LAP200 N con 0,5 mM DTT e senza inibitori della proteasi prima di aggiungere la proteasi del virus di incisione tabacco (TEV).
  6. TEV Decolleté
    1. Diluire 10 mg TEV proteasi in 1 ml di LAP200 N e ruotare provette a 4 ° C durante la notte.
      NOTA: Questo passaggio può essere ottimizzato per qualsiasi proteina LAP-tag per essere completato in poche ore, regolando la concentrazione di TEV proteasi, che può aiutare la conservazione di complessi proteici Lap-tag.
    2. perline pellet e il trasferimento surnatante in una nuova provetta. Risciacquare perle due volte con 160 ml LAP200 N con 0,5 mM DTT e inibitori della proteasi (concentrazione tripla) per eliminare ogni residuo di proteine. Prelevare 10 ml di surnatante per l'analisi del gel.
  7. Secondo Affinity Capture: Binding Protein a S Agarosio
    1. Lavare 1 tubetto di 80 microlitri proteina S agarosio liquami (40 ml di resina al sacco) per 3 volte con 1 ml di LAP200 N.
      NOTA: S protEin legame con la S-tag sarà ricostituire un RNasi attiva e un tag alternativa secondo epitopo dovrebbe essere preso in considerazione per RNA contenente complessi proteici.
    2. Aggiungere TEV eluita surnatante in perline di proteine ​​di agarosio e rock per 3 ore a 4 ° C. Perline pellet e lavare 3 volte con 1 ml di LAP200 N con 0,5 mm DTT e inibitori della proteasi. Lavare perline 2 volte con 1 ml di LAP100.
  8. Proteine ​​eluizione
    1. Eluire proteine ​​off proteina S agarosio aggiungendo 50 ml di tampone campione 4x Laemmli e scaldare a 97 ° C per 10 min.
      NOTA: Le proteine possono anche essere eluite dalle perline con tampone di eluizione (3.5 M MgCl 2 con 20 mM Tris, pH 7,4).

4. Identificare proteine ​​interagenti da Analysis Spettrometria di Massa

  1. Testare la qualità della purificazione analizzando i campioni raccolti mediante elettroforesi sodio dodecil solfato gel di poliacrilammide (SDS-PAGE), colorazione argentica gel (vedi Materiali Table) e mediante immunoblotting gli eluati e preciso con anticorpi anti-GFP per garantire che la purificazione LAP-tag lavorato 16, vedere Figura 4.
  2. Per identificare le specie di co-purificanti stechiometrico e substechiometrica, prelevare il campione di eluizione finale e separarlo da SDS-PAGE. Colorare il gel con una macchia proteina compatibile con la spettrometria di massa. Accise delle band più importanti e lo spazio tra di loro dal gel ed elaborarli per l'analisi mediante spettrometria di massa a parte 16.
    NOTA: Ci sono numerosi approcci per separare i eluati purificazione finale e li prepara per la spettrometria di massa 5. Ad esempio, i complessi LAP-purificati possono essere eluiti da perline S-proteina mediante salina (3,5 M MgCl 2) e l'intera popolazione proteine in massa possono essere analizzati mediante spettrometria di massa 17. In alternativa, eluati finali possono essere separate per 1 mm, tramite SDS-PAGE e un singolo nastro 1 mm può essere excised e analizzato. Questo cancella la miscela complessa di qualsiasi perline o particolato che interferiscono con l'analisi.

Risultati

Per evidenziare l'utilità di questo sistema, la griglia di lettura aperta (ORF), della proteina legante Tau microtubuli è stato clonato nel vettore shuttle amplificando Tau ORF con primer contenenti siti attB1 e attB2 (Tabella 1) e incubando i prodotti di PCR con lo vector navetta e una ricombinasi che media l'inserimento dei prodotti di PCR nel vettore navetta. I prodotti di reazione sono stati usati per trasformare DH5α batteri 13 e DNA plasmidico da colonie resistenti kanamicina è stato sequenziato per assicurare l'inserimento Tau. Una sequenza convalidato navetta-Tau vettoriale è stato poi utilizzato per trasferire il Tau ORF nel vettore pGLAP1, che fonde Tau in cornice con il LAP (EGFP-TEV-S-Protein) tag, incubando il vettore shuttle-Tau con il vettore pGLAP1 e ricombinasi che media il trasferimento della ORF dal vettore navetta per pGLAP1. I prodotti di reazione sono stati usati per trasformare batteri DH5α13 e DNA plasmidico da colonie resistenti Ampicillina è stato sequenziato per verificare che la fusione LAP-Tau era nel telaio. Sequenza convalidato pGLAP1-LAP-Tau è stata poi co-trasfettate con un vettore che esprime l'enzima flippase ricombinazione in cellule HEK293 che conteneva un bersaglio singolo riconoscimento flippase (FRT) sito all'interno del loro genoma, che è il luogo di integrazione per i geni LAP-tag 14. Questa linea cellulare esprime anche il TetR che si lega agli operatori Tet monte dei geni PAL-tag e silenzi loro espressione in assenza di Tet / Dox. integrants stabili sono stati selezionati con -Tet DMEM media / F12 con 100 ug / ml Igromicina per 5 giorni. Individuali foci cellulari resistenti Hygromycin state raccolte aggiungendo 20 ml di tripsina in cima e pipettando su e giù 2 volte. Le cellule sono state poste in un piatto ben 24 e ampliato da una crescita continua in -Tet DMEM media / F12.

Per verificare che la cellula resistente Hygromycins erano in grado di esprimere LAP-Tau, le cellule HEK293 LAP-Tau sono stati indotti con 0,1 mg / ml Dox per 15 hr e proteine ​​estratti sono stati preparati da cellule non-indotta e Dox-indotte. Questi estratti sono state separate mediante SDS-PAGE, trasferiti su una membrana PVDF e immunoblotted per GFP e tubulina come controllo di caricamento. Come si vede nella figura 4A, LAP-Tau (visualizzata con anticorpi anti-GFP) è stato espresso solo in presenza di Dox. Per convalidare LAP-Tau è stata correttamente localizzata al mandrino microtubuli mitotico durante la mitosi, come era stato precedentemente mostrato per Tau endogena 18, cellule HEK293 LAP-Tau sono state indotte con 0,1 ug / ml Dox per 15 h e le cellule sono state fissate con 4% paraformaldeide e co-macchiato per il DNA (Hoechst 33342) e microtubuli (anticorpi anti-tubulina). Coerentemente, LAP-Tau è stata localizzata al fuso mitotico durante la metafase della mitosi (figura 4B). Per verificare che LAP-Tau e le sue proteine ​​che interagiscono potrebbe essere purificato con questo SYSTEM, cellule HEK293 LAP-Tau sono state coltivate in bottiglie a rulli a ~ 70% di confluenza, indotta con 0,1 mg / ml Dox per 15 ore, raccolte da agitazione, lisate con tampone LAP300, e LAP-Tau era purificato usando il protocollo di cui sopra. Eluati da purificazione LAP-Tau sono stati risolti mediante SDS-PAGE ed il gel è stato colorato argento. La figura 4C mostra la purificazione LAP-Tau, contrassegnati da un asterisco è LAP-Tau e molte altre band indicativo di Tau proteine che interagiscono si vedono.

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Figura 1: Panoramica della Generazione del LAP-tagged inducibili linee cellulari stabili per qualsiasi proteina di interesse. La griglia di lettura aperta (ORF) di geni di interesse sono amplificati con i siti attB1 e attB2 fiancheggiano il 5 'e 3' sequenze finali, rispettivamente (sequenze di primer sono riportati nella Tabella 1) e clonati in il vettore shuttle. Sequenza verificato vettori navetta con il gene di interesse vengono poi utilizzati per trasferire il gene di interesse nel vettore pGLAP1. La sequenza verificato pGLAP1 vettore con il gene di interesse è poi co-trasfettate con il vettore contenente la ricombinasi flippase nella linea cellulare desiderata che contiene un bersaglio singolo riconoscimento flippase (FRT) sito nel loro genoma, che è il sito di integrazione per LAP geni -tagged. Queste linee di cellule esprimono anche il repressore Tet (TetR) che si lega agli operatori Tet (teto 2) a monte dei geni lap-tag e silenzi la loro espressione in assenza di Tet / Dox. Il gene LAP-tag di interesse è poi ricombinato nel sito FRT e integrants stabili sono selezionati con Hygromycin. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Panoramica delle domande di lap-tagged linee cellulari stabili. linee cellulari stabili inducibili LAP-tag sono indotti ad esprimere la proteina LAP-tag di interesse da Dox aggiunta e possono essere sincronizzati in diverse fasi del ciclo cellulare o possono essere stimolate con sostanze chimiche o ligandi per attivare qualsiasi percorso di segnalazione desiderata. La localizzazione subcellulare della proteina LAP-tag di interesse può essere analizzato da cellule dal vivo o l'imaging cellulare fisso. proteine ​​LAP-tag possono anche essere tandem affinità purificato e le loro proteine ​​che interagiscono può essere identificato da cromatografia liquida spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS). Infine, Cytoscape può essere utilizzato per generare una rete di interazione proteina-proteina della proteina esca. Dox indica doxiciclina, IP indica immunoprecipitato, EGFP indica migliorato proteina fluorescente verde, Tev indica sito di scissione TEV proteasi, e S indica S-tag.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Panoramica dei LAP-tagged proteine Espressione, purificazione e la preparazione per spettrometria di massa. Il protocollo dispone di 9 punti: 1) la crescita e l'induzione dell'espressione della proteina LAP-tag, 2) la raccolta delle cellule e lisi, 3) la preparazione dei lisati, 4) il legame di lisati di perle anti-GFP, 5) TEV proteasi scissione la GFP-tag, 6) il legame di lisati di perline S-proteine, 7) l'eluizione della proteina esca e proteine ​​che interagiscono, e 8-9) la preparazione dei campioni per le analisi proteomica mass spettrometria-based. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 4: Verifica di espressione LAP-Tau. (A) Western Blot (WB) analisi dei campioni di proteine da cellule non-indotta e Dox indotto LAP-Tau HEK293 sondato con anticorpi anti-GFP e anticorpi anti tubulina per rilevare il LAP-tag proteina Tau e il controllo tubulina di carico, rispettivamente. Si noti che LAP-Tau è espressa solo quando le cellule sono indotte con Dox. Cellule (B) mitotiche che esprimono LAP-Tau sono state fissate e co-macchiato per il DNA (Hoechst 33342) e tubulina (Tub) con anticorpi anti-tubulina e la localizzazione subcellulare di LAP-tau è stata analizzata mediante fluorescenza microcopy. Si noti che LAP-Tau localizza ai poli del fuso e fuso mitotico durante la mitosi. Argento (C) macchiato gel della purificazione LAP-Tau. MW indica peso molecolare, CL indica lisati eliminato e la E indicates eluati finali. I campioni sono stati analizzati su un 4-20% SDS-PAGE ed il gel è stato colorato argento per visualizzare le proteine ​​purificate. Si noti che una banda corrispondente al LAP-Tau è contrassegnato con un asterisco e diverse altre bande corrispondenti a co-purificare proteine ​​può essere visto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Fusion N-terminale
Inoltrare 5'-GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 '
Inverso 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (> 18gsn) -3 '
Fusion C-terminale
Inoltrare 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 '
Inverso 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (> 18gsn) -3 '

Tabella 1: Forward e Reverse Primer per amplificare ORF o di interesse per l'inserimento nel vettore Shuttle. I siti ATTB sono evidenziate in grassetto, GSN indica che i nucleotidi specifici più di 18 geni vengono aggiunti al primer.

Passo Temperatura Tempo
denaturazione iniziale 94 ° C 2 min
Cicli di amplificazione PCR (35) Denaturare 94 ° C 30 sec
temprare 55 ° C (a seconda del primer Tm) 30 sec
Estendere 72 ° C 1 min / kb
tenere 4 ° C indefinitamente

Tabella 2: PCR Condizioni per l'amplificazione del ORF di interesse.

Vettore Forward Sequencing Primer Reverse Sequencing Primer
Shuttle vettore 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 '

Tabella 3: Forward e Reverse Sequencing Primer per il vettore Shuttle.

ID Struttura parentale Promotore Bac Res Mam Res Tet reg?
pGLAP1 N-termine EGFP-TEV-S peptide pcDNA5 / FRT / TO CMV Amp HYG sì
pGLAP2 N-termine Flag-TEV-S peptide pcDNA5 / FRT / TO CMV Amp HYG sì
pGLAP3 N-termine EGFP-TEV-S peptide; C-termine V5 pEF5 / FRT-V5 EF1A Amp HYG No
pGLAP4 N-termine Flag-TEV-S peptide; ; C-termine V5 pEF5 / FRT-V5 EF1A HYG No
pGLAP5 C-peptide termine S-PreProt x2-EGFP pEF5 / FRT-V5 EF1A Amp HYG No

Tabella 4: Elenco dei vettori disponibili LAP / TAP con i promotori variabili, epitopi-tag, e Dox inducibili capacità di espressione per N o C-terminale della proteina Tagging. I vettori sono disponibili in commercio. Bac Res indica marcatore di resistenza batterica, Mam Res indica marcatore di resistenza delle cellule di mammifero, Tet reg? indica se l'espressione è Tet / Dox regulatable.

Vettore Forward Sequencing Primer Reverse Sequencing Primer
pGLAP1 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 '
pGLAP2 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 '
pGLAP3 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 '
pGLAP4 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 '
pGLAP5 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 '

Tabella 5: Forward e Reverse Sequencing Primer per pGLAP vettori.

Discussione

Il protocollo descritto descrive la clonazione di geni di interesse nel vettore LAP-tagging, la generazione di linee cellulari stabili LAP-tag inducibili, e la purificazione di complessi proteici LAP-tag per le analisi proteomica. Rispetto ad altri approcci LAP / TAP-tagging, questo protocollo è stato semplificato per essere compatibile con approcci high-throughput per mappare la localizzazione delle proteine ​​e le interazioni proteina-proteina all'interno di qualsiasi via cellulare. Questo approccio è stato ampiamente applicato alla caratterizzazione funzionale delle proteine fondamentali per la progressione del ciclo cellulare, l'assemblaggio del fuso mitotico, mandrino polo omeostasi, e ciliogenesis solo per citarne alcuni e ha aiutato la comprensione di come misregulation di queste proteine può portare a malattie umane 15, 16,19,20. Ad esempio, il nostro gruppo ha recentemente utilizzato questo sistema per definire la funzione e la regolazione del kinesin STARD9 mitotico (un obiettivo tumore candidato) in assemblaggio del mandrino 15,21, per definire unnuovo collegamento molecolare tra la catena Tctex1d2 luce dynein e brevi sindromi costola polidattilia (SRPS) 19, e di definire un nuovo collegamento molecolare per capire come mutazione del ubiquitina ligasi Mid2 può portare a disabilità intellettuali X-linked 16. Altri laboratori hanno applicato con successo questo metodo, tra cui uno che ha determinato che Tctn1, un regolatore di topo Hedgehog segnalazione, era una parte di un complesso proteico ciliopathy-associata che la composizione della membrana ciliare regolamentato e ciliogenesis in modo tessuto-dipendente 22,23. Pertanto, questo protocollo può essere ampiamente applicato alla dissezione di qualsiasi via cellulare.

Un passo fondamentale in questo protocollo è la selezione di linee cellulari stabili LAP-tag che sono Hygromycin resistenti. Particolare attenzione dovrebbe essere presa per assicurare che tutte le cellule nella piastra di controllo sono morti prima di selezionare focolai nella piastra sperimentale per l'amplificazione. Hygromycin può anche essere Added durante routine di coltura delle cellule di linee cellulari stabili LAP-tag per garantire, inoltre, che tutte le cellule mantengono il gene LAP-tag di interesse presso il sito FRT. Si avverte che non tutte le proteine ​​LAP-tag sarà funzionale e che è importante avere test in luogo che può essere utilizzato per testare la funzione delle proteine. Esempi di test utilizzati per testare la funzione della proteina includono il salvataggio di fenotipi siRNA-indotta e nelle prove di attività in vitro. Per far fronte a eventuali problemi con l'aggiunta di un grande LAP-tag, abbiamo precedentemente generato vettori TAP-tag compatibili con questo sistema che contiene i tag più piccoli, come i FLAG, che sono meno probabilità di inibire la funzione e la localizzazione della proteina di interesse 4. Inoltre, esistono vettori lap-codifica per la generazione di proteine ​​LAP-tag C-terminale o proteine ​​TAP-tag C-terminali che sono compatibili con questo sistema, che può essere utilizzato nei casi in cui un tag LAP / TAP non è tollerato al N -terminus di una proteina. Inoltre, thLe concentrazioni e sale e detersivo dei buffer di depurazione (LAPX N) possono essere modificati per aumentare o diminuire la severità di purificazione se si rispettano nessuno o troppo molte interazioni. Allo stesso modo, la procedura di purificazione di affinità tandem è più rigoroso di procedure di purificazione e interattori deboli singolo può essere perso, quindi un unico schema di purificazione può essere utilizzato quando vengono identificati pochi o nessun interattori.

È importante notare che altri approcci GFP epitopo codifica esistono che permettono proteina GFP larga scala codifica per localizzazione della proteina e purificazione studi 24,25. Questi includono l'approccio BAC TransgenOmics che utilizza i cromosomi batterici artificiali per esprimere geni GFP-tagged di interesse dal loro ambiente nativo che contiene tutti gli elementi regolatori, che imita l'espressione genica endogena 24. Più di recente, CAS9 / RNA a singolo guidata (sgRNA) complessi ribonucleoproteici (RNP) sono stati utilizzati per finireogenously tag geni di interesse con un sistema split-GFP che consente l'espressione dei geni GFP-tagged dal loro endogena loci genomici 25. Sebbene entrambi questi approcci permettono l'espressione di proteine ​​contrassegnate in condizioni endogene, rispetto al protocollo LAP-tagging qui descritto, non consentono di espressione inducibile e sintonizzabile dei geni categoria di interesse. Inoltre, essi devono ancora essere applicato a tandem epitopi codifica per TAP. E 'anche importante notare che altri sistemi di marcatura possono essere modificati per diventare compatibile con il sistema qui descritto per la generazione di linee cellulari stabili epitopi-tag inducibili. Ad esempio, l'identificazione di prossimità biotina-dipendente (BioID) ha raccolto una notevole attenzione grazie alla sua capacità di definire le relazioni spaziali e temporali tra interagenti proteine 26. Questa tecnica sfrutta fusioni di proteine ad un ceppo promiscua della Escherichia coli biotina ligasi Bira, che biotinilatos qualsiasi proteina di un ~ 10 nm raggio dell'enzima. Le proteine ​​biotinilati sono poi purificate per affinità con la cattura biotina-affinità ed analizzati per la composizione mediante spettrometria di massa. BIRA sarà biotinilato qualsiasi proteina in prossimità, anche transitoriamente, che lo rende particolarmente adatto per rilevare partner interagenti deboli all'interno di un complesso 27. Inoltre, lo schema di purificazione non richiede che endogeni interazioni proteina-proteina rimangono intatti e possono essere effettuate in condizioni denaturanti, riducendo così il tasso di falsi positivi. Nel nostro attuale protocollo, la sostituzione del vettore pGLAP1 da un vettore Bira-tagging potrebbe trasformare questo sistema di identificazione delle interazioni proteina-proteina, basate su affinità rilevarli base alla vicinanza. Tale sistema sarebbe estremamente vantaggiosa per rilevare interazioni proteina transitori come avviene tra molte interazioni enzima-substrato e per la mappatura spaziotemporale inte proteina-proteinaractions all'interno di strutture definite come è stata effettuata per il centrosoma e le ciglia 26,28.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della National Science Foundation NSF-MCB1243645 (JZT), tutte le opinioni, i risultati e le conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Flp-In T-REx Core KitInvitrogenK6500-01Kit per la generazione di linee cellulari che contengono un sito FRT e un'espressione di TrtR
PETG, 5xNunc, Inc.73520-734Flacone a rullo per cellule in crescita
PETG, 2,5xNunc, Inc.73520-420Flacone a rullo per cellule in crescita
Impilatori di celleCorning CellSTACK3271Impilatore di celle per cellule in crescita
Provette da centrifuga coniche da 500 mlCorning 431123Provette per la raccolta di cellule
Anticorpo anti-GFPInvitrogenA11122Anticorpo anti GFP di coniglio
Affiprep Perline di proteina ABiorad156-0006Utilizzato come matrice per coniugare gli anticorpi anti-GFP
Dimetilpimelimidato (DMP)ThermoFisher Scientific21667Utilizzato per coniugare gli anticorpi anti-GFP alle perle di proteina A
Provette TLA100.3Provetteper 349622Beckman per la centrifugazione di lisati proteici durante la fase di chiarificazione
Proteasi TEVInvitrogen12575-015Utilizzato per scindere il tag GFP dalle proteine N-terminali marcate LAP
Proteasi di precessioneGE Healthcare27-0843-01Utilizzato per scindere il tag GFP dalle proteine C-terminali marcate con LAP
Proteina S agarosioNovagen69704Utilizzato come seconda matrice di affinità durante la purificazione di complessi proteici marcati con LAP Kit
estrazione del gel di DNA QIAquickQiagen28704/28706Da utilizzare nella purificazione di prodotti PCR da un gel di agarosio
BP clonasi IIInvitrogen11789020Utilizzato per la clonazione di prodotti ORF PCR nel vettore navetta pDONR221
LR clonasi IIInvitrogen11791020Utilizzato per clonare l'ORF del gene di interesse nel vettore di marcatura pGLAP1
LAPccdB Sopravvivenza 2 T1R E. coliInvitrogenA10460Utilizzato per il propgating di vettori shuttle e vettori vuoti pGLAP
Fugene 6PromegaE2691Reagente di trasfezione per la trasfezione di vettori in cellule umane
TetraciclinaInvitrogenQ100-19Farmaco per indurre l'espressione proteica inducibile Dox/Tet 
DoxiciclinaClontechFarmaco per indurre l'espressione proteica inducibile Dox/Tet 
Igromicina BInvitrogen10687010Farmaco per la selezione di integranti stabili marcati con LAP
KanamicinaCorning61-176-RGFarmaco per la selezione di colonie batteriche resistenti alla Kanamicina
AmpicillinaFisherBP1760-5Farmaco per la selezione di colonie batteriche resistenti all'ampicillina
4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gelBiorad4561094Utilizzato per la separazione di campioni proteici e la purificazione finale di eluati con tag LAP
Kit Silver Stain Plus Biorad1610449Utilizzato per la colorazione dell'argento degli eluati di puficazioni con tag LAP e campioni raccolti durante il processo di purificazione.
Colorazione blu CoomassieInvitrogenLC6060Utilizzato per colorare i gel SDS-PAGE per visualizzare le purificazioni con tag LAP e tagliare le bande proteiche, compatibile con la spettrometria di massa
Vettore shuttle pDONR221Invitrogen12536017Vettore shuttle per la clonazione degli ORF dei geni di interesse
Vettore che esprime Flippasi pOG44InvitrogenV600520Vettore che esprime la ricombinasi Flippasi per l'integrazione di geni marcati con LAP nel genoma del sito FRT contenente linee cellulari
Platinum Taq DNA PolimerasiThermoFisher Scientific10966018Utilizzato per l'amplificazione PCR degli ORF dei geni di interesse
4x tampone per campioni LaemmliBiorad1610747Tampone per campioni per l'eluizione di complessi proteici purificati con tag LAP dal
terreno del brodo di Luria (LB) della matrice di perlineFisherBP9723-2Utilizzato per la coltivazione di batteri DH5 e alfa;
kit di miniprep del DNAPromegaA1222Utilizzato per la produzione di miniprep di plasmidi di DNA
Terreni DMEM/F12HycloneSH30023.01Per la crescita di cellule umane Hek293
FBS privi di TetAltanta BiologicalsS10350Utilizzato per la produzione di terreni -Tet DMEM/F12 per la generazione e la crescita di linee cellulari stabili inducibili con tag LAP
TripsinaHycloneSH30042.01Per il sollevamento di focolai cellulari Hek293 da piastre
Compresse inibitori della proteasiRoche11836170001Utilizzato per la produzione di tamponi di protocollo, senza EDTA
10% nonil fenossipolietossiletanoloRoche11332473001Utilizzato per la produzione di tamponi di protocollo
PBSCorning21-040-CMUtilizzato per la produzione di tamponi di protocollo
Tween-20FisherBP337-500Utilizzato per la produzione di tamponi di protocollo
Borato di sodioFisherS249-500Utilizzato per la produzione
FisherA78-500Utilizzato per la produzione di tamponi di protocollo
EtanolamminaCalbiochem34115Utilizzato per la produzione di tamponi di protocollo
NaClFisherP217-3Utilizzato per la produzione di tamponi di protocollo
KClFisherBP358-10Utilizzato per la produzione di tamponi di protocollo
Ditiotreitolo (DTT)FisherBP172-25Utilizzato per la produzione di tamponi di protocollo
MgCl2FisherM33-500Utilizzato per la realizzazione di buffer di protocollo
Tris baseFisherBP152-5Utilizzato per la realizzazione di buffer di protocollo
di 631311 di tamponi di protocollo

Riferimenti

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