La stimolazione del nervo vago ha dimostrato di avere una forte efficacia per ridurre l'infiammazione periferica. Qui, presentiamo un protocollo di stimolazione del nervo vago modificato che consente ulteriori esami dei meccanismi antinfiammatori colinergici in risposte infiammatorie limitate.
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Articolo metodologico
Aumento tempo di recupero e Diminuzione LPS Per studiare il nervo vago meccanismi di stimolazione in risposta infiammatoria limitati
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'infiammazione è una risposta locale all'infezione e al danno tissutale mediata da macrofagi attivati, monociti e altre cellule immunitarie che rilasciano citochine e altri mediatori dell'infiammazione. Per molto tempo, i meccanismi umorali e cellulari sono stati studiati per il loro ruolo nella regolazione della risposta immunitaria, ma i recenti progressi nel campo dell'immunologia e delle neuroscienze hanno anche svelato specifici meccanismi neurali con interessanti potenzialità terapeutiche. È stato descritto che la cosiddetta via antinfiammatoria colinergica (CAP) controlla le risposte immunitarie innate e l'infiammazione in modo molto potente. All'inizio degli anni 2000, Tracey e collaboratori hanno sviluppato una tecnica che stimola il nervo vago e imita l'effetto del percorso. La metodologia si basa sulla stimolazione elettrica del nervo vago a basso voltaggio e frequenza, al fine di evitare eventuali effetti collaterali di sovrastimolazione, come la deregolazione della variabilità della frequenza cardiaca. Sono ora disponibili dispositivi elettrici per la stimolazione, che facilitano l'impostazione della metodologia in laboratorio. L'obiettivo di questa ricerca è stato quello di indagare il potenziale coinvolgimento delle prostaglandine nella CAP. Sfortunatamente, sulla base di precedenti tentativi, non siamo riusciti a utilizzare il protocollo originale, poiché la risposta infiammatoria indotta era troppo elevata o non era adatta alle proprietà del metabolismo enzimatico. Le diverse impostazioni del protocollo chirurgico originale sono rimaste per lo più invariate, ma le condizioni relative all'induzione infiammatoria e il punto temporale prima del sacrificio sono state migliorate per adattarsi ai nostri scopi (ad esempio, indagare il coinvolgimento della CAP in risposte infiammatorie più limitate).
La versione modificata del protocollo originale, presentata qui, include un intervallo di tempo più lungo tra la stimolazione del nervo vago e l'analisi, che è associato a una minore induzione di risposte infiammatorie. Inoltre, mentre diminuivamo il livello di lipopolisaccaridi (LPS) da iniettare, ci siamo anche imbattuti in nuove osservazioni riguardanti le proprietà meccanicistiche nella milza.
Introduzione
L'immunità innata fornisce immediatamente prima linea di difesa contro le infezioni e malattie in una vasta gamma di organismi. Essa non solo avvia la risposta immunitaria primaria per eliminare la minaccia, ma svolge anche un ruolo fondamentale nell'attivazione e educare l'immunità adattativa che svolge risposte immunitarie secondarie in modo specifico agente patogeno. L'infiammazione è orchestrato da una pletora di citochine e chemochine, che a loro volta hanno la capacità di attrarre altre cellule immunitarie al sito di infezione e di indurre i segni cardinali di infiammazione, come rossore, gonfiore, dolore, perdita di funzione, e la febbre . La durata e l'intensità dell'infiammazione dipendono da diversi fattori, ma risolvere l'infiammazione e ripristinando l'omeostasi è un passo fondamentale per evitare l'insorgenza di malattie infiammatorie croniche. I recenti progressi nel campo delle neuroscienze e immunologia hanno svelato i meccanismi neurali specifiche con immenso potenziale terapeutico per il controllo inflinfiammazione sia nel sistema nervoso centrale e nella periferia. Uno di essi consiste nello colinergica via anti-infiammatori (PAC), noto anche come il riflesso infiammatoria, che è azionato dal sistema nervoso autonomo 4, 5.
Attualmente è pensato che mediatori infiammatori attivano nervi sensoriali e inviare segnali relativi allo stato di infiammazione del sistema nervoso centrale. Una risposta riflessa viene quindi attivato attraverso il nervo vago efferente. Un ampio studio sui dettagli anatomici della PAC ha rivelato un modello parasimpatico-simpatico composto da due nervi, il nervo vago e nervo splenico, rispettivamente 6. Nella PAC, il nervo vago colinergica efferente attivato termina nel ganglio celiaco mesenterico, causando l'attivazione del nervo splenico adrenergico da un meccanismo ancora da esplorare. Il nervo splenico, così attivato, si caratterizza per internovate in prossimità di cellule immunitarie nella polpa bianca, zona marginale, e polpa rossa della milza, la principale e organo obbligatorio della PAC 7, 8. Norepinefrina (NE) dalle terminazioni nervose splenici lega ai corrispondenti β 2 adrenergici espressi sui linfociti T splenici. Questo induce il rilascio colina acetil transferasi (ChAT) acetilcolina mediata (ACh), che a sua volta attiva i recettori nicotinici dell'acetilcolina (a7) α7nACh sui macrofagi, limitando in tal modo la produzione di citochine e infiammazione 2. Di conseguenza, è chiaro che il sistema nervoso è in grado di regolare l'infiammazione nei tessuti periferici e di ripristinare omeostasi immunitaria locale.
Come il nome del percorso suggerisce, il sistema ACh è di importanza fondamentale per il funzionamento di questo percorso di regolazione neuro-immune. È interessante notare che i meccanismi coinvolti nell'attivazione diPAC sembrano essere differente nella periferia e nel sistema nervoso centrale. Mentre l'importanza dei recettori nicotinici (α7nAChR) nella milza è stata dimostrata in precedenza 9, recettori muscarinici (mAChR) sono obbligatorie per l'attivazione centrale del percorso 10, 11. Più recentemente, la somministrazione periferica di una azione centrale M1 agonista muscarinico notevolmente soppressa fattore di necrosi tumorale siero e milza α (TNFa) durante letale endotossemia murina, un'azione che richiedeva intatto nervo vago e nervo splenico segnalazione 12. Abbiamo inoltre recentemente dimostrato che topi privi prostaglandina E2 (PGE2) non erano in grado di rispondere alla stimolazione del nervo vago e non down-regolano il rilascio indotto da LPS di citochine nel siero e milza 3. Pertanto, la PAC potrebbe anche essere regolata da sistemi diversi dal principale pathw AChAy.
Il nervo vago è stata indicata come tale per la sua naturalmente vagare nel corpo, innervano organi principali compreso il fegato, polmone, milza, reni, intestino e 13. Considerando questo grande innervazione e molto potente effetto immunosoppressivo del nervo vago, il potenziale terapeutico della PAC potrebbe coprire un'ampia gamma di condizioni infiammatorie. Il nervo vago può essere elettricamente (o meccanicamente) attivato, con controllo della tensione e frequenza, e contrariamente al trattamento convenzionale, senza farmaci aggiunti al corpo. Le prove sono attualmente in corso in pazienti reumatici, per esempio, per testare il significato clinico di VNS nel trattamento di infiammazioni croniche 14. Complessivamente, la comunicazione e la regolazione di infiammazione neuro-immunitario sono attualmente allo studio, che fornirà un trattamento alternativo alla terapia convenzionale. Pertanto, l'analisi del nervo vago stimulatioEffetto n nei diversi organi innervati, ma anche la caratterizzazione del potenziale azione terapeutica in modelli animali di infiammazione cronica, sarebbe sicuramente dare spunti e di speranza per nuovi potenziali bersagli terapeutici.
La metodologia originale sviluppato da Tracey e colleghi 4 non poteva essere trasposto al nostro campo di ricerca a causa di eccesso di stimolazione della risposta infiammatoria (da una dose letale di LPS) e una troppo breve intervallo di tempo tra l'attivazione della PAC e il read-out. Nel presente documento, presenteremo le modifiche apportate al protocollo originale, confrontare i due metodi diversi su livelli di citochine, ed evidenziare un nuovo fronte osservazione sull'organo bersaglio (la milza).
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida per la cura e l'uso di animali approvati dal Comitato Etico locale Karolinska Institutet, Stoccolma. Il Comitato Etico locale segue le direttive dell'Unione europea in materia di cura degli animali.
NOTA: I principali cambiamenti rispetto al protocollo originale sono il tempo di recupero dopo l'intervento chirurgico (6 ore contro 1 ora) e il livello di LPS iniettati (2 mg / kg contro 15 mg / kg). In caso contrario, le diverse impostazioni relative alla chirurgia stessa non sono stati modificati.
1. preparazione del materiale per la stimolazione
- Accendere il computer e il sistema di acquisizione dati collegato alla stimolazione elettrodo (Figura 1A).
- Inserire il Riconoscimento programma.
- Preparare una soluzione stock di LPS ad una concentrazione di 5 mg / ml in PBS 1x, aliquota, e conservarlo a -20 ° C. Il giorno dell'esperimento, scongelare un'aliquota e preparare un adequate campione di LPS (0,5 mg / ml) per iniettare circa 100 microlitri nell'animale, in base al peso.
2. Preparare l'animale per anestesia
- Utilizzare C57BL 6 topi /. Mantenerle in condizioni climatiche controllate con un ciclo luce-12 hr / scuro, alimentarli chow roditori standard e dare loro acqua ad libitum.
- Eseguire un intervento chirurgico su topi che pesano circa 25 g al giorno dell'esperimento.
NOTA: Quando reazioni infiammatorie sono indotti, è particolarmente importante effettuare regolari controlli e osservazioni delle reazioni cliniche negli animali. L'eutanasia precoce da CO 2 inalazione è necessaria se la condizione animale non soddisfa i criteri etici. - Impostare la macchina anestetico.
- Assicurarsi che il tubo sia collegato correttamente e non sia danneggiato in alcun modo. Assicurarsi che la zona ventilata funziona correttamente. Collegare il filtro chiave per la bottiglia isoflurano e riempire il vaporizer con una quantità sufficiente di isoflurano.
- Aprire l'alimentazione del gas (aria e ossigeno) e fare in modo che le bottiglie contengono abbastanza gas per l'esperimento. Un connettore a tre vie è quindi in grado di inviare il flusso isoflurano alla camera di induzione o la maschera.
- Ruotare il connettore a tre vie per la camera di induzione. Scegli un mouse dalla gabbia casa e inserire l'animale nella camera. Regolare il regolatore di flusso di 1,0 L / min di ossigeno e 1,0 L / min di aria. Regolare la concentrazione isoflurano al 4-5%.
- Quando si raggiunge il livello desiderato di anestesia, quando si raggiunge il livello desiderato di anestesia, radere l'area chirurgica e spostare l'animale dalla camera alla maschera. Girare il connettore a tre vie per il flusso maschera. Regolare il regolatore di flusso di 0,25 L / min ossigeno e 0,25 L / min di aria.
- Regolare la concentrazione isoflurano al 1,5-2,5%. Controllare il livello di anestesia per il controllo del riflesso e la frequenza respiratoria prima di iniziare SEGUIRE IL PROCEDIMENTO chirurgicae.
- Fissare le gambe del mouse al banco di lavoro con nastro adesivo. Assicurarsi che il naso dell'animale è ancora accuratamente posizionato nella maschera.
3. Chirurgia e stimolazione del nervo vago
- Disinfettare l'area chirurgica con il 70% di etanolo.
- Usando un bisturi, incidere con cura la pelle a livello del collo (un'incisione di circa 1 a 1,5 cm).
Nota: Nel protocollo, la procedura di chirurgia finisce qui per gli animali sham-operati. Infatti, è stato dimostrato che sfiora il nervo con un attrezzo metallico stimola già in una certa misura. Pertanto, per ottenere un più accurato controllo della chirurgia degli animali quando si utilizza una piccola quantità di LPS, fermare l'operazione in questa fase. - Con l'aiuto di un microscopio (obiettivo 12,5X), isolare il nervo vago sinistro dalla carotide utilizzando dissettore. In primo luogo individuare il muscolo sternocleidomastoideo rimuovendo pelle e grasso strati, e poi rientrare inordinare di mettere la pinza dietro sia il nervo e l'arteria.
Nota: Il passo successivo è molto difficile, come il nervo e arteria sono strettamente aderire l'uno all'altro. Pertanto, è molto facile da tagliare la nave e uccidere l'animale. Tuttavia, ponendo molta attenzione la pinza tra il nervo e l'arteria, che alla fine si separano, ed è possibile isolare il nervo. - Posizionare l'elettrodo (Figura 1B) sotto il nervo vago. L'elettrodo ad ago è piuttosto lungo, anche se il nervo muove leggermente durante la stimolazione, sarà sempre in contatto con l'elettrodo.
- Eseguire un intraperitoneale (ip) iniezione di LPS (2 mg / kg) con l'aiuto di una siringa (per la lettura su livelli di citochine, cioè per misurare l'effetto down-regulation).
- Attendere 5 minuti prima di iniziare la stimolazione.
- Stimolare il nervo vago per 5 minuti a 5 V e 1 Hz premendo il pulsante di avvio nel programma riconoscere.
- Rispostare l'elettrodo e suturare la ferita dell'animale con filo di sutura chirurgica.
- Spruzzare un No Sting Barriera Film (NSBF) sulla ferita al fine di migliorare la guarigione e per proteggere dalle infezioni.
4. Recupero del Animal
- Dopo l'intervento chirurgico, spostare l'animale torna alla sua gabbia casa per il risveglio e il recupero. Sotto la luce infrarossa al fine di mantenere la temperatura corporea, assicurarsi di monitorare l'animale fino piena coscienza è stato ripreso.
- Lasciate che l'animale recuperare nella sua gabbia per 6 ore prima del sacrificio per l'analisi.
Nota: L'effetto della stimolazione del nervo vago è molto veloce e ha anche dimostrato di essere di lunga durata (fino a 48 ore), in modo che il tempo di recupero può essere impostato dallo sperimentatore secondo le esigenze dello studio.
5. Il sacrificio per ulteriori analisi
- Posto l'animale in una gabbia collegato a un dispositivo di somministrazione di CO 2.
- Impostare il dispositivo su un 5Ciclo -min di CO 2 inalazione.
- Quando l'eutanasia è fatto, raccogliere gli organi di interesse e direttamente congelarli in ghiaccio secco per ulteriori analisi (ad esempio, la misurazione dei livelli di citochine negli estratti di milza usando un topo TH1 / TH2 9-Plex assay) 3.
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Risultati
Livello di TNFa e interleuchina-1β (IL-1β) dopo aver aumentato il Time Lapse dopo l'intervento e ridurre la dose di LPS
Come mostrato in precedenza, utilizzando il protocollo originale, VNS diminuzione dei livelli di TNFa (169,3 ± 24,9 pg / mg in SHAM contro 39,7 ± 10,8 pg / mg in VNS, p <0.001) e IL-1β (360.0 ± 40.21 pg / mg SHAM contro 191,7 ± 27,2 pg / mg in VNS, p <0,01) nella milza dopo l'iniezione intraperitoneale di ...
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Discussione
Fin dalla sua scoperta nei primi anni 2000, i meccanismi della PAC sono stati accuratamente studiati. Ora abbiamo una buona immagine del percorso, e in particolare, l'organo bersaglio, la milza, dove NE, le cellule T memoria, Ach, e macrofagi lavorare come una squadra molto efficiente per down-regolare mediatori infiammatori 2. Abbiamo inoltre recentemente pubblicato dati sulla importanza di un sistema prostaglandine funzionale nei topi, in particolare, PGE 2, che è ovviamente un c...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Lo studio è stato supportato dal Consiglio Svedese delle Ricerche, dall'Associazione Svedese per i Reumatismi, dalle Fondazioni dell'Istituto Karolinska, dal Consiglio della Contea di Stoccolma, dalla Fondazione Wallenberg e dalla Fondazione GV 80 Anni per la ricerca. Gli autori desiderano anche ringraziare Hannah Aucott per aver corretto le bozze del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Computer | Toshiba-Qualsiasi | computer è effettivamente compatibile | |
| MP-150 sistema di acquisizione dati | Biopac Systems | MP150WSW | |
| Acknowledge software | Biopac Systems | ||
| Mice C57Bl / 6 | Charles River | ||
| Macchina per anestesia | Simtec Engineering | ||
| Bombola di ossigeno medica | AGA | 107563 | |
| Bombola d'aria medica | AGA | 108639 | |
| Vetflurano (1.000 mg/g) | Virbac | 137317 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Soluzione salina | Merck Millipore | 1024060080 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493 | Diluito 10 volte per la concentrazione utilizzata |
| Siringa (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| Aghi 23 G | KD-FINE | 0,6 x 30 mm (blu) | |
| Pinza per microdissezione (curva) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Forbici da dissezione | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Sutura chirurgica 4-0 | Ethicon | G667G | |
| Unità di eutanasia | Euthanex Smartbox | EA-32000 | |
| Cavilon No Sting Barrier Film | 3M Health Care | 3346N | |
| TH1/TH2 9-Plex assay, kit ultrasensibile | MesoScale Discovery | K15013C-1 | |
| Dispositivo con elettrodi stimolanti | Biopac Systems | STIMSOC | |
| Aesculap Isis rasoio | Agnthos | GT420 | |
| R70 | Dieta per roditori da Lantmannen, Stoccolma, Svezia |
Riferimenti
- Nathan, C. Points of control in inflammation. Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).
- Rosas Ballina, M., et al. Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit. Science. 334 (6052), 98-101 (2011).
- Le Maître, E., et al. Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).
- Borovikova, L. V., et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).
- Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity. Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).
- Pavlov, V. A., Tracey, K. J. Neural circuitry and immunity. Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).
- Huston, J. M., et al. Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis. J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).
- Rosas-Ballina, M., et al. Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).
- Wang, H., et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).
- Pavlov, V. A., et al. Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).
- Pavlov, V. A., et al. Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).
- Rosas-Ballina, M., et al. Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation. Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).
- Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L. Psychoneuroimmunology. Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. 55, Academic. San Diego. 55-112 (2001).
- Andersson, U., Tracey, K. J. A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation. Cerebrum. 2012, 3(2012).
- Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function. J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).
- Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis. Blood. , (2016).
- Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. The vagal innervation of the gut and immune homeostasis. Gut. 62, 1214-1222 (2013).
- Pereira, M. R., Leite, P. E. The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex. J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).
- Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. 9 (8), e104530(2014).
- Huston, J. M., et al. Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis. Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).
- Yuan, H., Silberstein, S. D. Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II. Headache. 56 (2), 259-266 (2016).
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