Utilizzando canali lineari Agarose per studiare Drosophila Comportamento larvale Crawling

Sommario

La larva di Drosophila è un sistema potente modello per studiare il controllo neurale del comportamento. Questa pubblicazione descrive l'utilizzo di canali di agarosio lineari per suscitare attacchi sostenuti di scansione e metodi lineari per quantificare la dinamica di strutture larvali durante comportamento strisciare ripetitivo.

Abstract

Drosophila scansione larvale sta emergendo come un potente modello per studiare il controllo neurale del comportamento sensomotorio. Tuttavia, il comportamento scansione larvale su superfici piane aperte è complessa, tra cui: pausa, tornitura, e meandri. Questa complessità nel repertorio di movimento ostacola un'analisi dettagliata degli eventi che si verificano nel corso di un singolo ciclo di scansione passo. Per superare questo ostacolo, i canali di agarosio lineari sono stati fatti che vincolano il comportamento larvale a diritto, sostenuta, scansione ritmica. In linea di principio, perché i canali di agarosio e il corpo larvale Drosophila sono sia otticamente trasparente, il movimento delle strutture larvali etichettati da sonde fluorescenti geneticamente codificati può essere monitorato in intatto, larve liberamente muoversi. In passato, le larve sono stati inseriti in scanalature lineari e strisciando a livello di tutto l'organismo, segmento e muscoli sono stati analizzati ^1. In futuro, larve strisciando nei canali può essere utilizzato per l'imaging del calcio per il monitoraggio neurol'attività finale. Inoltre, questi metodi possono essere utilizzati con larve di ogni genotipo e con qualsiasi canale ricercatore progettato. Così il protocollo presentato sotto è ampiamente applicabile per gli studi che utilizzano la larva di Drosophila come modello per capire il controllo del motore.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di studiare Drosophila scansione larvale in dettaglio. Esperimenti su locomozione hanno giocato un ruolo importante nello sviluppare e testare le teorie sul controllo motore ^2. Tradizionalmente locomozione è stata studiata in animali acquatici (ad esempio, sanguisuga, lampreda, girino) ^3. La natura ripetitiva di locomozione in questi animali ha consentito per lo studio di rhythmogenesis, per l'analisi degli eventi biofisici locomozione di guida, e per monitorare i modelli di cottura neurali che accompagnano locomozione.

L'uso di Drosophila larve per studi di locomozione presenta una combinazione unica di vantaggi rispetto ad altri sistemi modello: genetica facili, sviluppo ben caratterizzato, un corpo che è otticamente chiaro primi e secondi stadi, e un elettrone trasmissione permanente ricostruzione microscopica dell'intero sistema nervoso ^4-6. Tuttavia, Drosophila larvale locomovimento su superfici piane aperte è un po 'complesso che include le pause, si gira, e serpeggiante striscia ^7. Questa pubblicazione presenta un metodo per utilizzare i canali di agarosio lineari per guidare Drosophila comportamento motorio larvale in modo tale che le larve perform sostenuto, dritto, il comportamento scansione ritmica.

Studiando Drosophila comportamento larvale nei canali di agarosio, invece di comportamento su superfici piane aperte, ha diversi vantaggi. In primo luogo, permette ai ricercatori di selezionare specificamente strisciando comportamento dai molti movimenti che sono parte del repertorio comportamentale larvale. In secondo luogo, regolando la larghezza del canale rispetto alla dimensione del corpo larvale, velocità scansione può essere regolata. Terzo, canali consentono la larva per essere visto da dorsale, ventrale o laterale a seconda di come la larva viene caricato e orientato all'interno del canale. Questa versatilità in orientamento larvale permette a qualsiasi struttura di interesse per essere costantemente visibile durante la scansione. Il quarto,canali sono suscettibili per l'uso con un'ampia varietà di microscopi e obiettivi. Ad esempio, canali lineari possono essere utilizzati per l'imaging bassa risoluzione sulla stereoscopes campo chiaro e / o per l'imaging ad alta risoluzione sulla filatura-disco microscopio confocale ^1. Quinto, questo metodo può essere usato in combinazione con optogenetic / thermogenetic manipolazioni neuronali in qualsiasi sfondo genetico. Infine, perché sia ​​il corpo larvale (in prima e seconda stadi) e canali di agarosio sono otticamente trasparente, canali possono essere utilizzati quando si studiano i movimenti dinamici, o cambiamenti di intensità fluorescente delle strutture larvali etichettati da sonde fluorescenti geneticamente codificati.

Il metodo descritto è adatto per gli studi cinematici dettagliati di primo e secondo instar Drosophila comportamento larvale. Questa pubblicazione analizza i cambiamenti dinamici di intensità fluorescente del sistema nervoso centrale durante la scansione larvale in avanti per dimostrare l'utilizzo di canali e come un precursore di NeuCalcio Imaging Ronal.

Protocollo

1. Preparazione di larve

1. Una settimana prima di registrare il comportamento, impostare una croce (minimo di 25 vergini e 5 maschi). Mantenere tutte le croci e progenie a 25 ° C.
   NOTA: La temperatura di condizioni di coltura può essere modificata, ma la linea di tempo indicato di seguito dovrebbe essere aggiustato per tenere conto di cambiamenti di velocità di sviluppo.
2. 5 giorni prima della registrazione, prima cosa al mattino, mettere la croce in una gabbia di raccolta con un tappo di agar / succo di frutta e una piccola quantità (0,5-1 ml) di pasta di lievito, nel centro del tappo agar / succo di frutta.
   1. Per fare una gabbia di raccolta, colpire i fori in un 6 once polietilene piazza bottiglia Drosophila.
   2. Per rendere tappi agar / succo, mescolare 18 g di agar con acqua 600 ml in pallone conico. In un separato mix pallone 20 g di saccarosio con 200 ml di succo di mela. Forno a microonde fino a quando i solidi si sciolgono. Unire e mescolare, permettendo miscela raffreddare a 60 ° C. Aggiungere 20 ml di 10% di metil-p-idrossibenzoato in 95% di etanolo, e mescolare. Aggiungere ~ 7ml alla metà inferiore di un 35 x 10 mm rotondo Petri. Lasciare agar / succo solidificare per 1 ora a RT. Conservare a 4 ° C.
   3. Per fare pasta di lievito, aggiungere parti uguali da lievito secco volume e acqua. Conservare a 4 ° C.
3. Controllare la salute delle collezioni larvali.
   1. Al mattino, 4 e 3 giorni prima della registrazione, rimuovere il tappo e inserire un tappo fresco sulla gabbia. Cambiare i tappi, allo stesso tempo ogni giorno per ottenere una raccolta 24 ore di uova e larve appena schiusi.
   2. Dopo ogni tappo viene rimosso, esaminarlo per vedere quante uova la croce sta ponendo. Aspettatevi tra 500-2000 uova. Regolare il numero di adulti, se necessario.
      NOTA: un paio di uova si sono schiuse dovrebbero in larve, e le larve appena schiusi saranno trovato lontano dalla pasta di lievito.
   3. Età ogni tappo per 24 ore. Riesaminare il tappo per determinare se le larve sono sani.
      NOTA: La maggior parte delle uova dovrebbero sono nati in larve, e le larve avrebbero dovuto strisciato in voipasta ast. I segni di cattiva salute includono un gran numero di uova non schiuse, corpi larvali morti lontano dalla pasta di lievito, e le larve con notevoli macchie scure in addome, che indica una reazione immunitaria. Se larve sono malsano, cambiare la gabbia, fare tappi freschi / pasta di lievito, e verificare il genotipo.
   4. Eliminare i vecchi tappi.
4. Raccogliere le larve per le registrazioni del comportamento.
   1. Sia a 2 e 1 giorno prima della registrazione, togliere il tappo e sostituire con un tappo fresca.
   2. Etichettare ogni tappo rimosso e mantenere a 25 ° C. Ciò produrrà una serie messa in scena di larve per le registrazioni del comportamento. Larve da appena tratteggiata (0-4 hr posthatch) attraverso la seconda instar (24-48 posthatch) può essere utilizzato nei canali. Salva tappi per le registrazioni in giorni consecutivi.
   3. Eliminare tutte le protezioni dopo 48 ore.
   4. Se necessario, ripetere i passaggi 1.4.1-1.4.3 per un massimo di 5 ulteriore d. Dopo che meno uova fecondate vengono prodotte.

2. Preparazione di canali

1. Preparare il PDMS canali lineari (Polidimetilsilossano, un elastomero siliconico) colata stampo (Figura 1A). PDMS colata stampi sono disponibili presso il laboratorio di Heckscher su richiesta.
   1. Pulire lo stampo fusione con alcool isopropilico. aria secca, DAB secco con salviette di laboratorio, o utilizzare aria compressa.
   2. Mettere lo stampo fusione in un 10 centimetri Petri coperchio o altro contenitore.
2. Preparare e versare la soluzione di agarosio.
   1. Effettuare una soluzione al 3% di agarosio in acqua (3 g in 100 ml) per microonde fino a completo scioglimento.
   2. Raffreddare a 55 ° C, permettendo bolle di salire alla superficie.
   3. Versare il composto agarosio nella capsula di Petri contenente lo stampo di colata in modo tale che lo stampo sia appena coperto. Lasciate set agarosio fino solidificato.
3. Rimuovere i canali agarosio dallo stampo di fusione. Tagliare i bordi del disco agarosio con una lama di rasoio.
   1. Mettere il canales in una capsula di Petri 10 centimetri immerso in acqua. Essi possono essere conservati a 4 ° C per 7 giorni.

3. Caricamento di una larva in un canale da registrare il comportamento

NOTA: Se la memorizzazione dei canali a 4 ° C, permettono canali di venire a RT prima di utilizzare per la registrazione del comportamento.

1. Utilizzare una lama di rasoio pulito per tagliare un singolo canale da quelli preparata nella fase 2 (Figura 2A).
2. Utilizzare un paio di pinze per posizionare il canale scanalato-side-up su un vetrino di vetro (Figura 2B). La dimensione e lo spessore del vetrino dipende dalla portata specifica utilizzata per l'imaging.
3. Utilizzare una pinza sottile per selezionare una larva dal tappo agar / succo preparata nella fase 1 e posizionare nel canale di taglio (Figura 2C).
   1. Non spremere la larva. Raccoglierlo delicatamente con la punta della pinza denti. È anche possibile manipolare larva con un pennello con una punta fine.
      NOTA: Questo è importante in quanto le larve sono molto sensitive al tatto. Se non sono maneggiati con cura, le risposte nocicettive potrebbero dominare il loro comportamento durante i primi secondi di questo esperimento.
   2. Lavare le larve da loro immergendo brevemente in acqua.
   3. Dopo aver posizionato la larva sul canale di taglio, utilizzare la punta della pinza denti a stuzzicare delicatamente la larva nel boschetto canale.
      NOTA: Per la maggior parte delle applicazioni la larghezza della larva e la larghezza del canale devono corrispondere. La larghezza media di larve a diversi stadi di sviluppo segue: 0 HR posthatch - 140 micron, 24 ore posthatch - 180 micron, 48 hr posthatch - 320 micron, 72 hr posthatch - 500 micron, 96 hr posthatch - 750 micron ^8. I canali sono disponibili nelle seguenti larghezze: 100, 150, 200, 250 e 300 micron, e tutti i canali sono 150 micron di profondità.
   4. Utilizzare la punta di un dente pinze o pennello per regolare la posizione della larva all'interno del canale. Esso può essere orientato in qualsiasi direzione: ventraleup, ventrale giù, ventrale da un lato, a seconda di quale struttura è da acquisire.
4. Utilizzando pinze, capovolgere delicatamente il canale sopra in modo che la larva è ora sul vetro di copertura. Inserire una o due gocce d'acqua alle estremità del canale in modo da riempire con acqua (Figura 2D).
   1. Sollevare delicatamente ai lati del canale per rimuovere eventuali bolle d'aria.
   2. Regolare l'orientamento della larva. Per farlo, spingere delicatamente il canale, ma non il vetro di copertura a rotolare la larva. Se questo non cambia l'orientamento, rimuovere il vetro di copertura e regolare la posizione larvale. La larva è pronta per essere ripreso.
   3. Immagine del canale / vetrino su un microscopio invertito. Se l'imaging su un microscopio in posizione verticale, è sufficiente invertire il canale / vetrino.

4. Caratteristica Misura di interesse in registrazione Behavioral

1. Per una struttura di interesse (ad esempio, la coda, CNS), misurare una caratteristica di interesse (ad esempio,, Intensità di fluorescenza, posizione) nel tempo.
   NOTA: Strutture come la testa e la coda possono essere annotate a mano. Ad esempio, la testa può essere identificato come contenente bocca ganci a forma di H scuri e la coda può essere identificato come contenente spiricles tracheali posteriori. Questo documento si concentra sul cordone nervoso. Utilizzare la linea neuronale GAL4 ELAV-GAL4 di guidare un transgene UAS-MYR-GFP (ELAV> GFP) ^9,10 per etichettare fluorescente del sistema nervoso centrale (SNC). La CNS contiene due lobi cerebrali anteriori collegati al cordone nervoso, che si estende al posteriore (figura 3).
2. Misurare l'intensità dei pixel del cordone nervoso (f _(NC)) in ciascun punto di tempo (t). Qui di seguito descrive un approccio di annotazione manuale, ma questo passo potrebbe essere automatizzato.
   1. Nelle Figi (o software simile) nel menu 'Analizza' utilizzare i "Set Misure ..." finestra di dialogo per segnalare il valore di grigio medio e SLICe la posizione.
   2. Disegnare manualmente una scatola nel centro del cordone nervoso nel primo fotogramma del filmato (Figura 3). Questo passo potrebbe anche essere automatizzato con algoritmi immagine segmentazione e registrazione.
   3. Utilizzare il comando "Misura" nel menu 'Analizza' a riferire l'intensità media dei pixel nella regione scatola di interesse. Ciò genera una finestra "Risultati".
   4. Nel fotogramma successivo, riposizionare manualmente la scatola senza ridimensionamento utilizzando i tasti freccia. Utilizzare nuovamente il comando "Misura". I risultati aggiornati verranno visualizzati nella finestra "Risultati". Ripetere questo passaggio per ogni fotogramma di interesse.
   5. Salvare i "Risultati" che utilizzano il 'Salva con nome ...' comando dal menu File. I risultati saranno esportati come file .xls.

5. Analizzare i Misure

1. Normalizza ogni f _(NC) valore a un valore compreso tra 0 e 1 (z _(t) </ Em>).
   1. Nel foglio di calcolo (o un altro programma), aprire il file Results.xls. Questo file avrà due colonne che rappresentano il numero di fotogramma e l'intensità media di fluorescenza.
   2. Fare una nuova colonna e utilizzare la formula z _(t) = f _{(NC [t])} -min _{(f [NC])} / max _{(f [NC])} -min _{(f [NC])} per generare un valore di fluorescenza normalizzato corrispondente a ciascun punto di tempo.
2. Determinare il periodo di passo per ogni passo nella registrazione.
   NOTA: Un ciclo passo è l'unità di ripetitivo movimento di tutto il corpo per la marcia avanti (e indietro) scansione. Per convenzione un passo in avanti inizia (e finisce) con il movimento in avanti della coda, la testa, e di altri organi interni come l'intestino o il sistema nervoso centrale ^1.
   1. Controllare manualmente la registrazione comportamentale e registrare i tempi di iniziazione (i) di ogni passo (i _{(STRIDE ciclo [n])).}
      NOTA: Nell'esempio riportato di seguito, il movimento in avantidel SNC come l'avvio di un ciclo passo è stato usato (figura 3).
   2. Per ogni passo calcolare il periodo: Δ t _{(ciclo del passo) =} I _{(Stride ciclo [n + 1])} -i _{(Stride ciclo [n]).}
3. Calcolare la percentuale del ciclo di passo trascorso per ogni punto di tempo della registrazione.
   1. Effettuare una colonna aggiuntiva nel foglio di calcolo rappresenta il tempo trascorso dall'inizio di un ciclo passo (c). Impostare il tempo dal momento che l'inizio del passo a zero l'avvio di ogni passo (c _{(Stride ciclo [n])} = 0). Regolare volte dopo l'inizio di conseguenza.
   2. Fare una colonna aggiuntiva nel file di foglio di calcolo che rappresenta ciclo per cento del passo trascorso (ciclo del passo%) Dividere volte modificate entro periodo falcata e moltiplicare per 100 per convertire in percentuale del ciclo del passo trascorso:. Ciclo% stride = (c _{(Stride ciclo [n] ))} / (Δ t ₍Ciclo Stride) * 100).

6. Generare coordinate polari piazzole rappresentare le dinamiche di strutture di interesse nel corso del ciclo di scansione

1. In MATLAB, usare il dialogo il 'Importa dati' nella scheda Home per importare il Results.xls aggiornato.
2. Fare un nuovo array "Theta" valori del ciclo passo contenente percentuale (% del ciclo del passo). ( "Theta = Var1" dove Var1 rappresenta% del ciclo del passo).
3. Fare un nuovo array "Rho" contiene valori di fluorescenza normalizzati (z _(t)). ( "Rho = Var2" dove Var2 rappresenta z _(t)).
4. Utilizzare il comando 'polarplot' per fare in coordinate polari trame con il ciclo per cento del passo come l'angolo, e la fluorescenza come il raggio ( "polarplot (Theta, Rho)").

Risultati

Questo articolo descrive un metodo per guidare comportamento larvale Drosophila utilizzando canali agarosio e per misurare la dinamica delle strutture larvali in un ciclo di scansione. Le larve di canali lineari eseguire attacchi sostenuti di scansione ritmica (Figura 3). Poiché sia ​​le larve e canali sono otticamente trasparenti, i canali possono essere utilizzati con esprimendo larve sonde fluorescenti espressi in qualsiasi struttura di interesse. Abbiamo reg...

Discussione

Un dispositivo di microfluidica è stato costruito per rendere i canali di agarosio lineari che possono ospitare larve di Drosophila (Figura 1). Quando Drosophila larve sono collocati in questi canali agarosio lineari loro repertorio comportamentale è limitato a scansione, che consente l'osservazione dettagliata della dinamica di strutture larvali durante il ciclo di scansione.

Una registrazione riuscita si verifica quando una larva eseguire una serie di...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bottiglia quadrata di Drosophila da 6 once	Scimart	DR-103
agar	sigma	A1296
saccarosio	sigma	S9378
succo			non da concentrato
Tegosept	Fisher	T2300	metil-p-idrossibenzoato
35 x 10 mm piastra di Petri	rotonda Fisher	351008
di
PDMS stampo di colata	FlowJem		può essere richiesto agli autori
Alcool isopropilico	Fisher	A417-1
salviette da laboratorio	Fisher	06-666-11
aria compressa	Fisher	18-431
piastra di Petri da 10 cm	BioPioneer	GS82-1473-001
agarosio	Fisher	50-444-176
lama di rasoio	Fisher	12-640
pinze	FST	11241-40
22 x 40 vetro di copertura, #1.5	Fisher	50-365-605
Fiji (versione 1.51d)	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Mathworks		www.mathworks.com