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Articolo metodologico

Il Colon-26 Carcinoma tumore-cuscinetto mouse come un modello per lo studio del cancro cachessia

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DOI:

10.3791/54893

⸱

30 novembre 2016

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Simon Cancer Center and IUPUI Center for Cachexia Research, Innovation and Therapy, Indiana University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

I topi portatori del carcinoma del Colon-26 (C26) rappresentano un modello classico di cachessia tumorale. L'atrofia muscolare progressiva si verifica in associazione con la crescita tumorale, la sovraespressione di ubiquitina ligasi muscolo-specifiche e la riduzione dell'area della sezione trasversale muscolare. Si osserva anche una perdita di grasso. La cachessia viene studiata in modo tempo-dipendente con l'aumentare della gravità del deperimento.

Abstract

La cachessia tumorale è la progressiva perdita di massa muscolare scheletrica e di tessuto adiposo, bilancio azotato negativo, anoressia, affaticamento, infiammazione e attivazione dei sistemi di lipolisi e proteolisi. I pazienti oncologici con cachessia beneficiano meno delle terapie antineoplastiche e mostrano un aumento della mortalità1. Diversi modelli animali sono stati messi a punto per studiare le cause molecolari responsabili dell'atrofia corporea e muscolare a seguito della crescita tumorale. Qui, descriviamo le metodologie relative a un modello ben caratterizzato di cachessia tumorale: topi portatori del carcinoma C262-4. Sebbene questo modello sia ampiamente utilizzato nella ricerca sulla cachessia, diversi approcci rendono la riproducibilità un potenziale problema. La crescita del tumore C26 provoca una marcata e progressiva perdita di massa muscolare corporea e scheletrica, accompagnata da una riduzione dell'area della sezione trasversale muscolare e della forza muscolare3-5. Anche il tessuto adiposo viene perso. Il deperimento coincide con elevati livelli circolanti di citochine pro-infiammatorie, in particolare l'interleuchina-6 (IL-6)3, che è direttamente, anche se non interamente, responsabile della cachessia C26. È ben noto che un meccanismo primario attraverso il quale il tumore C26 induce la deplezione del tessuto muscolare è l'attivazione dei sistemi proteolitici del muscolo scheletrico. Pertanto, l'espressione di ubiquitina ligasi muscolo-specifiche, come atrogin-1/MAFbx e MuRF-1, rappresenta un metodo accettato per la valutazione del catabolismo muscolarein corso 2. Qui, presentiamo come eseguire questo modello in modo riproducibile e come asportare diversi tessuti e organi (fegato, milza e cuore), nonché muscoli adiposi e scheletrici (gastrocnemio, tibiale anteriore e quadricipite). Forniamo anche utili protocolli che descrivono come eseguire il congelamento muscolare, il sezionamento e la quantificazione delle dimensioni delle fibre.

Introduzione

Atrofia muscolare è una grave complicanza di varie condizioni cliniche, come il cancro, la sepsi, il fegato, la cirrosi, il cuore e insufficienza renale, malattia polmonare ostruttiva cronica, e l'AIDS. In particolare, atrofia muscolare è evidente in almeno il 50% dei pazienti con tumore 1. La perdita del muscolo scheletrico nei risultati di cancro da degradazione delle proteine aumentato a causa della sovra-attivazione dei sistemi scheletrici proteolitici muscolare e / o da diminuita sintesi proteica 6. Lipolisi è anche evidente, che porta alla deplezione del tessuto adiposo. Clinicamente, cachessia è associato ad una ridotta qualità e la durata della vita e si stima che sia la causa della morte a 20 - 30% dei pazienti affetti da cancro 7. L'utilizzo di modelli sperimentali che assomigliano malattia umana più vicino possibile sarebbe vantaggioso. Un modello animale ottimale è caratterizzato da elevata riproducibilità, nonché da interferenze limitata da terapie diverse ei fattori imprevedibilidieta, il sesso e il background genetico che sono di solito associati con la condizione clinica 8. Finora, cachessia cancro è stata studiata principalmente in modelli animali caratterizzati da trapianto di cellule tumorali o iniezione di sostanze cancerogene, anche se un nuovo metodo è quello di utilizzare topi geneticamente modificati sensibili alla sviluppo del cancro.

Topi portatori di carcinoma C26 (noto anche come colon-26 e adenocarcinoma) rappresentano un modello ben caratterizzato e ampiamente usato di cachessia neoplastica 2,5. La crescita dei risultati tumorali C26 nel corpo e perdita di peso muscolare, soprattutto attraverso una maggiore grassi e proteine catabolismo 9. Generalmente, il peso del tumore 10% contro peso corporeo totale è associato ad una riduzione del 20-25% in peso, muscolo scheletrico e una maggiore deplezione di grasso 3,10. Epatomegalia e splenomegalia sono osservate anche con la crescita del tumore, insieme con l'attivazione della risposta di fase acuta e l'elevazione di pro-Inflalivelli di citochine mmatory 3,11. Tra questi, è noto che IL-6 svolge un ruolo chiave nella mediazione atrofia muscolare nel modello C26, anche se questa citochina non è probabilmente l'unico induttore di cachessia 12. Elevati di IL-6 provoca atrofia muscolare attraverso l'attivazione del pathway JAK / STAT3, e inibendo questo fattore di trascrizione può prevenire l'atrofia muscolare 3,4.

Durante atrofia muscolare C26-indotta, come in molte condizioni di atrofia muscolare, la massa muscolare è perso in gran parte attraverso la riduzione del contenuto di proteine muscolari attraverso fibre muscolari, non attraverso la morte delle cellule o la perdita di fibre 13. In C26 cachessia, uno spostamento verso aree di sezione trasversale più piccoli si osserva in entrambi i glycolytic e ossidative fibre 2. Questo è anche coerente con ridotta forza muscolare 5. Molti gruppi in tutto il mondo hanno approfittato del modello C26, al fine di scoprire nuovi mediatori di atrofia muscolare o farmaci clinicamente rilevanti per il cancro cachexia. Tuttavia, sono stati riportati molti diverse procedure per l'uso di questo modello, sollevando preoccupazioni per la coerenza dei dati ottenuti e posa barriere riproducibilità in diverse condizioni sperimentali. Qui riportiamo un utilizzo tipico di questo modello per lo studio della cachessia cancro che produce dati standardizzati e riproducibili.

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Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutti gli studi descritti sono stati approvati dai Comitati Istituzionali Animal Care e l'uso della Thomas Jefferson University e Indiana University School of Medicine.

1. C26 cellulare crescita e preparazione

  1. Ottenere cellule del cancro del colon-retto C26 (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) e preparare mezzo di crescita completo (cioè ad alta glucosio Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM) contenente il 10% siero fetale bovino (FBS), 1 mM di sodio piruvato, 1% glutamina e 1% di streptomicina / penicillina).
    NOTA: Al fine di consentire una migliore riproducibilità inter-sperimentale, è preferibile usare cellule C26 ad un passaggio più basso possibile.
  2. Utilizzare un contatore di cellule disponibile in commercio al piatto 50.000 cellule / cm 2 in boccette con terreno di coltura completo. Li Incubare in atmosfera umidificata a 37 ° C e 5% CO 2 fino sub-confluenti. Evitare di coltura ad alta densità di prevdifferenziazione ent e deriva di fenotipi cellulari.
  3. Dopo il primo passaggio, piastra abbastanza cellule da impiantare nel numero previsto di animali. Il giorno di impianto di cellule, dissociare le cellule mediante tripsinizzazione con 0,02 ml di 0,25% soluzione di tripsina-EDTA per cm 2, neutralizzare la tripsina aggiungendo almeno 3 ml di mezzo fresco per ml di tripsina, determinare la concentrazione cellulare in cellule / ml e risospendere il numero di cellule necessarie per l'esperimento (1 x 10 6 cellule per topo) in PBS sterile.
    NOTA: le celle C26 raggiungano la confluenza quando la densità è di circa 500.000 cellule / cm 2.

2. I topi

  1. Randomize adulti topi CD2F1 (almeno 8 settimane di età) in gruppi (di solito controlla e tumorali portatori) con almeno n = 6 per gruppo.
    NOTA: tumori C26 crescono in topi Balb / c pure. Tuttavia, sulla base della nostra esperienza, i topi CD2F1 rappresentano una serie più versatile ed economico per questo particolare modello di tumore. Inoltre,simili alle impostazioni cliniche e di risultati riportati in altri modelli sperimentali di muscolo cancro-associata sprecare 14-16, differenze di sesso nella risposta alla C26 cachessia può anche essere osservato 17 (vedi anche tabella 1).
  2. Anestetizzare il mouse con isoflurano per via inalatoria (3% di ossigeno). Mantenere l'animale in anestesia esclusivamente per il tempo necessario per eseguire l'inoculazione del tumore. Assicurarsi che il mouse si trova su un tampone riscaldato al fine di prevenire la perdita di calore corporeo. Prima di iniziare la procedura di iniezione del tumore, confermare il corretto anestesia pizzicando delicatamente le dita dei piedi posteriori.
    NOTA: A causa della durata della procedura (generalmente pochi secondi), l'uso di veterinaria unguento oculare non è necessaria. Per lo stesso motivo, gli animali di controllo sottoposto all'operazione farsa non si prevede di perdere peso.
  3. Usando una siringa da insulina sterile da 1 ml con un ago da 26 gauge, iniettare rapidamente 250 microlitri della soluzione contenente il tumor cellule per via sottocutanea e intrascapularly nel cuscinetto adiposo del mouse.
    NOTA: Gli animali di controllo riceveranno 250 ml di soluzione salina sterile intrascapularly nel cuscinetto adiposo.
  4. Posizionare la parte posteriore animale nella sua gabbia. Direttamente osservare il mouse almeno una volta ogni 15 minuti fino a che non può rispondere alla manipolazione dolce e ha riacquistato un riflesso di raddrizzamento.
    NOTA: Non lasciare il mouse senza sorveglianza, e tenerlo in una gabbia di recupero caldo che contiene un substrato solido. Inoltre, non restituiscono il mouse per la stanza degli animali finché non è completamente recuperato da anestesia. In generale, i topi non hanno bisogno di essere alloggiati individualmente a meno che il ricercatore si propone di valutare l'assunzione di cibo individuale. Se questo è il caso e l'uso di gabbie metaboliche automatici non è disponibile, la registrazione manuale di consumo alimentare deve essere eseguito, possibilmente quotidiana e allo stesso tempo ogni giorno.
  5. Controllare i topi quotidiana e registrare le loro peso corporeo.
    NOTA: La registrazione il punteggio condizione fisica ecomportamenti gabbia di casa in grado di differenziare i gradi di cachessia e della malattia comportamento, che è utile per studi di trattamento 18.

3. L'eutanasia e il prelievo di sangue

  1. Quando la perdita di peso corporeo in i padroni di casa del tumore rispetto ai controlli raggiunge il 5%, 10%, o del 15% (lieve, moderata e grave cachessia, rispettivamente) rispetto al loro peso iniziale del corpo, eutanasia i topi.
    NOTA: Un tipico esperimento sarà effettuato fino a quando un gruppo raggiunge perdita di peso del 10%, su cui vengono sacrificati tempo tutti i gruppi. perdita di peso corporeo è valutata misurando il peso corporeo comprensivo del tumore.
  2. Posizionare il mouse in anestesia generale isoflurano (3% di ossigeno). Disegnare sangue mediante puntura cardiaca (circa 1 - 1,5 ml).
  3. Raccogliere il sangue in K 2 -EDTA (18 mg) tubetti vuoti e disporli sul ghiaccio. Centrifugare il sangue (2.000 xg per 15 min a 4 ° C) e raccogliere il plasma / siero.
  4. Euthanize il mouse mediante cdislocazione ervical. Procedere alla asportazione dei tessuti e la raccolta di organi.

4. tessuti e organi escissione

NOTA: Per l'utilizzo di tessuti in test di biologia molecolare o biochimici, prevede di pesare ogni organo e tessuto e posizionare immediatamente un frammento in CryoTubes pre-etichettati. Snap congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C.

  1. Per evitare la contaminazione di campioni di tessuto con pelliccia, spruzzare etanolo al 70% su tutto il corpo.
  2. Posizionare il mouse su un letto dissezione in posizione supina ed estendere un arto verticale fissando il piede per un morsetto buret elevata.
  3. Afferrare la pelle dell'arto inferiore con una pinza Dumont e utilizzare le forbici sottili curve per rimuovere delicatamente la pelle e la fascia, esponendo i ventri muscolari sottostanti dell'arto inferiore.
  4. Identificare il muscolo gastrocnemio sull'arto posteriore inferiore di origine nel condili mediale e laterale sul femore posteriore e il suo inserimentocalcagno tramite il tendine calcaneare.
    1. Procedere per tagliare il tendine gastrocnemio calcaneare. Afferrare l'estremità distale del gastrocnemio con una pinza Dumont e tirare il ventre muscolare verso la sua origine. Utilizzando le forbici, tagliare il muscolo all'origine più vicino possibile al femore. Posizionare il muscolo in un piatto. Pesare immediatamente e congelare in un tubo in azoto liquido.
      NOTA: Assicurarsi di non asportare il muscolo soleo insieme al gastrocnemio. In tal caso, rimuovere con attenzione soleo tirando delicatamente fuori con le pinze.
  5. Procedere per identificare e asportare il muscolo tibiale anteriore dalla sua origine alla superficie antero-laterale della tibia e del suo inserimento nella cuneiforme mediale attraverso il suo tendine distale.
    1. Al fine di avere effetto leva, tenere il piede afferrando le cifre con il dito indice e il pollice. Inserire la punta di pinze Dumont immediatamente sotto il tendine distale superficiale del tibiale e spostare la pinza in modo tale che il bllato unt può essere utilizzato per staccare il ventre muscolare tibiale dal tessuto connettivo sottostante.
    2. Tagliare il tendine distale utilizzando le forbici curve sottili, e quindi tagliare il muscolo all'origine, il più vicino possibile alla tibia.
  6. Aprire la cavità addominale eseguendo un'incisione sagittale partire dalla regione ipogastrica e spostando superiormente alla regione epigastrica, fermando l'incisione appena sopra il diaframma.
    NOTA: La profondità dell'incisione deve essere solo sufficiente a rompere la parete muscolare addominale e la fascia peritoneale sottostante.
  7. Rimuovere con attenzione il fegato afferrandolo con le pinze smussato a punta, e usare le forbici curve sottili di sezionare via qualsiasi vasi sanguigni o del tessuto connettivo che aderiscono il fegato alla cavità. Fare attenzione a non lasciare alle spalle lobi. Pesare e scattare congelare il fegato in un tubo in azoto liquido.
  8. Utilizzando le pinze a punta smussata, allontanarsi l'intestino, e quindi esporre e delicatamente rimuoverela milza. Afferrare la milza delicatamente con la pinza a punta smussata e utilizzare la parte posteriore o laterale smussato delle belle forbici curve di sezionare via qualsiasi vasi sanguigni del tessuto connettivo o aderenti la milza alla cavità. Pesare e scatto congelare in un tubo in azoto liquido.
  9. Identificare i cuscinetti adiposi gonadici, adiacente al epididimo (nei maschi) o dell'utero (nelle femmine). afferrare delicatamente il cuscinetto adiposo dell'epididimo con la pinza a punta smussata e tirare il tessuto fuori della cavità. Utilizzando le forbici curve sottili, tagliare qualsiasi tessuto gonadico che può essere collegato al cuscinetto adiposo. Pesare il pad grasso e scattare congelare in un tubo in azoto liquido.
    NOTA: In genere, questo tessuto adiposo è considerato rappresentativo della massa complessiva grasso corporeo nei topi e declina in peso con cachessia. Altri cuscinetti di grasso possono essere similmente identificati, sezionati, rimossi, e pesati.
  10. Utilizzare le forbici sottili curve di aprire il petto dell'animale. Tagliare le costole collegati a entrambi i bordi laterali della sternum. Rimuovere lo sterno. Utilizzando due coppie di pinze, afferrare ciascun lato della gabbia toracica e tirare ogni lato lateralmente per aprire la cavità toracica.
  11. Delicatamente tirare il cuore con le pinze. asportare con cura il cuore con le forbici sottili curve tagliando l'aorta in atrio sinistro. Assicuratevi di svuotare l'organo di eventuali residui di sangue da delicatamente assorbente contro un foglio di carta assorbente. Pesare e scatto congelare in un tubo in azoto liquido.

5. muscolare congelamento e di montaggio

  1. Immergere la metà inferiore di un piccolo beaker di plastica (50 ml) contenente isopentano in azoto liquido. Il isopentano è pronto all'uso quando diventa leggermente viscosa e forma un solido rivestimento laminato bianco all'interno del bicchiere (temperatura: -160 ° C).
    NOTA: utilizzare sempre nonsparking bronzo o alluminio utensili a mano. Evitare di respirare vapori del prodotto. Usare con ventilazione adeguata. Se si tratta di una fuoriuscita e la ventilazione è impossibile o impractical, indossare un respiratore adeguato.
  2. Congelare qualche mezzo di inclusione su un mandrino (cork) immergendo brevemente (10 sec) in isopentano.
  3. Maniglia muscolo (ad es., Il tibiale o gastrocnemio) tenendolo dal tendine, verticalmente rispetto al tappo, in modo da mantenere l'orientamento delle fibre e consentire sezioni trasversali.
  4. Posizionare accuratamente la porzione terminale del muscolo fresco sulla parte superiore del mezzo di inclusione congelati.
    NOTA: Il muscolo si attacchi. E 'importante non per circondare completamente il muscolo con mezzo di inclusione. E 'anche importante mantenere l'orientamento verticale per la successiva determinazione della sezione trasversale.
  5. Immergere il mandrino con il muscolo allegato nel bagno isopentano (il solito tempo di congelamento è di 7 - 15 sec, a seconda delle dimensioni del provino e composizione).
    NOTA: L'immersione nella soluzione di congelamento non dovrebbe durare più di quanto sia necessario per bloccare completamente il campione. Congelamento troppo lungo frac volontàture il blocco dei tessuti, mentre un tempo troppo breve causerà la formazione di cristalli di ghiaccio. Un campione ben congelati saranno bianco gessoso.
  6. Dopo il congelamento del campione, posto in un sacchetto di plastica o provetta del campione (50 ml) ed immediatamente conservarlo in un congelatore a -80 ° C o in azoto liquido.

6. Analisi dei dati grezzi

  1. Al fine di controllare le variazioni di dimensione dei topi, normalizzare il peso corporeo finale (FBW); -Tumorale libera del peso corporeo; e la carcassa, organo, e il peso del tessuto (espresso in grammi) in funzione del peso corporeo iniziale (PCI), e li esprimono come "peso / 100 mg IBW".
    NOTA: In alternativa, alcuni ricercatori normalizzare la massa muscolare per la lunghezza della tibia.
  2. Utilizzare un software per l'analisi dei dati. Trova la media e la deviazione standard dei pesi normalizzati. Effettuare analisi statistiche con t-test di Student spaiato tra i controlli e topi C26-cuscinetto.
    NOTA: I risultati possono essere presentati rispetto al corpo (PCIe pesi FBW) libera da tumore, tumore, di organi, e del tessuto.

7. muscolare sezionamento

  1. Impostare la temperatura di lavoro della camera interna criostato a circa -23 ° C.
  2. Lasciare il campione (precedentemente conservati a -80 ° C) per acclimatarsi alla temperatura di lavoro (un paio d'ore dovrebbe essere sufficiente).
  3. Taglio multiplo di 8 micron di spessore sezioni del campione (preferibilmente il tibiale anteriore o muscoli gastrocnemio) e alla loro raccolta su vetrini.
    NOTA: Tagliare la sezione alla regione medio-ventre del muscolo. Inoltre, per amore di precisione, tagliare le sezioni perpendicolarmente all'asse di montaggio.
  4. Tenere i vetrini all'interno della camera criostato. Non lasciare che scongelare se l'obiettivo è quello di realizzare se gli studi / IHC o colorazione enzimatica.
  5. Conservare i vetrini a -80 ° C per ulteriori analisi.

8. Valutazione di myofiber formato da laminina immunofluorescenza (Alternativa 1)

NOTA: Per la valutazione della morfologia muscolare e l'area della sezione trasversale (CSA), ematossilina e eosina (H & E) - sistemi, così come immunofluorescenza (IF) metodi di colorazione basati sono accettati per determinare le dimensioni della fibra 19. Sebbene la colorazione H & E di sezioni muscolari rappresenta un metodo valido e conveniente per l'analisi della morfologia, l'uso di un approccio IF 14 è significativamente più veloce e modestamente più accurata rispetto al metodo basato E H &. H & E i metodi sono descritti di seguito.

  1. Rimuovere sezioni di tessuto sia dal criostato oppure immagazzinamento -80 ° C e consentire loro di equilibrare a temperatura ambiente (circa 5 - 10 min).
    NOTA: Per evitare interazioni non specifiche associate con anticorpi primari sollevate nei topi, è consigliabile utilizzare sia i anticorpi sollevati in un'altra specie o di avvalersi di kit disponibili in commercio immunorivelazione "mouse-on-mouse".
  2. Immergere le sezioni in pre-cooled metanolo (-20 ° C) per 10 min.
  3. Lavare le sezioni in temperatura ambiente 1x PBS per 5 min.
  4. Rimuovere la PBS e utilizzare una penna per le applicazioni di immunoistochimica di circondare sezioni sul vetrino. Non lasciate che le sezioni completamente asciutto in qualsiasi punto.
  5. Applicare un tampone adatto bloccaggio (5 - 8% FBS in PBS o 5% siero di capra in PBS) sulle sezioni per 1 ora a RT.
  6. Rimuovere il tampone di bloccaggio.
  7. Applicare o un coniglio anti-laminina (1,30) o un topo anti-distrofina (1,30) anticorpo primario in tampone di bloccaggio sezioni per 2 ore a temperatura ambiente (o per una notte a 4 ° C) in una camera umida.
  8. Lavare le sezioni con PBS 1x per 5 min.
  9. Rimuovere il tampone di lavaggio e lavare di nuovo le sezioni in PBS 1x per 5 min.
  10. Rimuovere il tampone di lavaggio e applicare una corretta anticorpo secondario fluorescente (1: 1.000 in tampone bloccante) alle sezioni in una camera umida per 1 ora a RT.
  11. Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare le sezioni con PBS 1x per 5min.
  12. Rimuovere il tampone di lavaggio e ripetere il lavaggio con PBS 1x per 5 minuti. Rimuovere il tampone di lavaggio e coprire le sezioni con un vetro di copertura utilizzando un mezzo acquoso-based.
  13. Identificare le caratteristiche morfologiche del muscolo utilizzando immagini digitali della sezione macchiato. Per fare ciò, utilizzare un microscopio a luce fluorescente invertito per se le sezioni (un obiettivo 10X o 20X di ingrandimento è appropriato), insieme a un software della fotocamera e acquisizione di immagini digitali. Inserite una barra di scala in ogni immagine digitale (20 - 30 campi aleatori sono consigliati per ogni sezione muscolare) per facilitare la quantificazione del CSA. Le immagini devono essere salvati in formato TIF per essere compatibile con il software di analisi delle immagini utilizzando il programma ImageJ.
  14. Utilizzare una macro ImageJ distinguere tessuto connettivo dal tessuto contrattile (dimensione myofiber) attraverso la presenza di anticorpo secondario fluorescente dello nell'endomisio 20.
    NOTA: La macro e le istruzioni sono disponibili presso l'autenticazioneors, Richard Lieber e Shannon Bremner.
  15. Aprire il programma ImageJ facendo doppio clic sull'icona sul desktop.
  16. Caricare la macro CSA facendo clic una volta sulla scheda "Plugins". Spostare il cursore verso il basso per selezionare l'opzione "Installa" facendo clic una volta.
  17. Caricare il macro sezione trasversale selezionandolo dalla cartella è stato salvato, e quindi fare clic su "Apri".
  18. Una volta che la macro è stato aperto, aprire l'immagine istologico che contiene la barra di scala facendo clic su "File" e poi "Apri" dalla barra degli strumenti ImageJ.
  19. Una volta che l'immagine viene aperta, selezionare la "strumento linea retta" nel programma ImageJ cliccando sull'icona con la linea retta.
  20. Una volta selezionato il "strumento Retta", fate clic una volta sulla fine più a sinistra della barra di scala e quindi fare clic una volta sulla più a destra estremità della barra della scala. Se fatto correttamente, ci dovrebbe essere una linea gialla sovrapposto sulla barra di scala.
  21. Fare in modo che il Yellolinea di w è ancora sovrapposto sulla barra di scala, selezionare la scheda "Analizza" dalla barra degli strumenti ImageJ facendo clic una volta.
  22. Nella scheda "Analizza", spostare il cursore verso il basso e selezionare "scala set" facendo clic una volta.
  23. Nella finestra "Imposta scala", NON modificare il valore nella "distanza in pixel" scatola. Inserire la distanza nota della barra di scala nella casella "distanza nota". Cambiare le unità nella casella "Unità di lunghezza" per corrispondere con le unità barra di scala (cioè, micrometri = micron). Infine, selezionare "globale" facendo clic sulla casella a sinistra di "Global" una volta.
  24. Chiudere la finestra "Imposta scala".
  25. Aprire la prima immagine da misurare premendo il pulsante "O" sulla tastiera. Osservare una finestra pop-up che permette all'utente di trovare e selezionare l'immagine da misurare dalla cartella che è stato salvato in. Selezionare l'immagine facendo clic su di esso una volta e facendo clic su "Apri".
  26. Una volta aperto, una finestra dovrebbe comparire per la selezione della gamma accettabile per misurazioni CSA e circolarità.
    NOTA: Queste impostazioni vengono di solito lasciati ai valori predefiniti. Tuttavia, se si desidera modificare queste impostazioni, essere sicuri di mantenere i valori uguali per ogni immagine consecutiva da misurare nell'esperimento.
  27. Dopo aver impostato la gamma CSA e circolarità, osservare l'immagine coperta di pixel rossi con una finestra "Threshold". Regolare la soglia dell'immagine utilizzando le barre nella finestra "Threshold" finché le fibre muscolari sono riempiti accuratamente con pixel rossi.
    NOTA: tentativo di ottenere il maggior numero di fibre che non si toccano l'un l'altro; se le fibre si toccano, verranno misurati come una grande fibra, che dovrà essere modificato a valle.
  28. Dopo aver impostato la soglia, premere il tasto "1" sulla tastiera per misurare le fibre muscolari.
  29. Cerchia l'singole fibre muscolari con una linea gialla.Spostare attraverso l'immagine e rimuovere gli artefatti o fibre doppie che sono state selezionate dal programma. Per fare questo, selezionare le strutture che non sono le fibre di clic su di essi una volta, e quindi premere il tasto "D" sulla tastiera. Questo li cancellerà dalle misure.
  30. Selezionare e copiare le misurazioni dalla "finestra dei valori di misura", e incollarli in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.
    NOTA: I valori ottenuti possono anche essere utilizzati per valutare l'analisi della distribuzione delle fibre, che generalmente rappresenta un parametro utile per determinare se la crescita tumorale promuove il passaggio a fibre muscolari più piccoli.
  31. Chiudere tutte le finestre aperte in ImageJ facendo clic sulla "X" nell'angolo in alto a sinistra delle finestre.
  32. Apri una nuova immagine da misurare premendo il tasto "O" e ripetendo i passaggi 8,24-8,29.

9. Valutazione di myofiber formato da H & E macchiato Sezioni (Alternativa 2)

  1. Posizionare il vetrodiapositive in vaschette Coplin contenente filtrati ematossilina di Harris per 8 min.
    NOTA: In alternativa, Mayer ematossilina può essere utilizzato se una macchia meno intensa si desidera.
  2. Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata.
  3. Immergere i vetrini in acqua di rubinetto per un massimo di 5 min.
  4. sciacquare rapidamente in acqua deionizzata, e poi incubare in soluzione filtrata eosina 1% per meno di 2 min.
    NOTA: se una macchia più intenso si desidera, aggiungere 1 - 2 gocce di acido acetico (0,01% o meno) alla soluzione eosina.
  5. Inizia la procedura di disidratazione. Sciacquare i vetrini in etanolo al 70% per meno di 1 min.
  6. Immergere i vetrini in etanolo al 90% per 1 min.
  7. Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 1 min.
  8. Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 2 min.
  9. Immergere i vetrini in xilene per 2 minuti. Spostare le diapositive in un altro vaso Copley contenente xilene fresco per altri 2 minuti.
    NOTA: Mantenere le diapositive in xilene (non più di 1 ora) fino a quando non sono coprioggetto.
  10. Posizionare il coverslips sulle sezioni muscolari utilizzando Permount o di un mezzo di montaggio a base di xilene di scelta.
  11. Osservare i vetrini H & E-colorati sotto un microscopio con un ingrandimento 20X, e di acquisire le immagini di tutta l'area sezione di muscolo. Ottenere immagini utilizzando un microscopio luminoso-luce, macchina fotografica digitale e software per la cattura delle immagini.
    NOTA: La presenza di una barra di scala o l'immagine di un micrometro taken allo stesso ingrandimento sarà necessario per determinare la CSA. Come sopra, registrare almeno 20 - 30 campi casuali per ogni sezione muscolare.
  12. Valutare la dimensione myofiber utilizzando il software ImageJ. Aperto tutti i immagine digitale. Impostare la scala come sopra. Misurare almeno 1.500-2.000 fibre muscolari al muscolo utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, tracciando la circonferenza della fibra con il mouse o, per l'ingresso più veloce, con un dispositivo di input tablet e penna.

10. Raccolta e analisi dei dati

  1. Al fine di stabilire le dimensioni delle fibre muscolari, valutare la superficie media di fibra "."Calcola mezzi e SD per le misure ottenute per ciascun muscolo, comprendente sia l'area e il diametro di Feret. Inoltre, al fine di valutare se l'impostazione sperimentale è associato con uno spostamento verso fibre muscolari sia piccole o più grandi, analizzare la" distribuzione delle fibre ".
  2. Valutare il significato del risultato eseguendo una T-test non appaiati per due gruppi. Determinare i rapporti tra i valori ottenuti per il gruppo di topi C26 e per il gruppo di controllo. Tracciare i valori su un grafico segnalato la mezzi SD e la frequenza di distribuzione / istogramma che intende dimostrare il cambiamento nelle dimensioni in fibra.

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Risultati

C26 cinetica di crescita tumorale mostrano una fase di latenza per la prima 7 - 8 d dopo l'iniezione, seguita da crescita cellulare esponenziale (4 - 5 d). La massa tumorale raggiunge infine ~ 10% del peso corporeo (circa 2 g; Figura 1A-B). Durante la prima fase, il tumore può essere localizzato solo palpazione e appare come una piccola sporgenza della pelle. Nella seconda fase, il tumore è osservato come una massa sotto la pelle. Raramente, il tumor...

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Discussione

Soprattutto nelle ultime fasi, cancro colorettale è associato con lo sviluppo di cachessia, che è responsabile per poveri risultati e riduzione della qualità della vita del paziente. Molti studi si sono concentrati sul trattamento di condizioni secondarie al cancro; Tuttavia, nonostante i numerosi sforzi in questa direzione, non c'è ancora una terapia approvato per cachessia neoplastica 21. Pertanto, è imperativo che i modelli animali assomigliano alla patologia umana più vicino possibile al fine di massi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Richard Lieber e Shannon Bremner per la loro macro ImageJ e le loro istruzioni. Mentre era alla Thomas Jefferson University, questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Salute della Pennsylvania CURE Grant TJU n. 080-37038-AI0801. Successivamente, questo studio è stato supportato da una sovvenzione ad AB dal National Institutes of Health (R21CA190028) e da sovvenzioni a TAZ dal National Institutes of Health (R01CA122596, R01CA194593), dall'IU Simon Cancer Center, dalla Lustgarten Foundation, dalla Lilly Foundation, Inc. e dall'IUPUI Pancreas Signature Center.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fiasche per colture cellulariFalcon - Becton Dickinson35-5001
DMEMCellgro10-017-CV
FBSGibco26140
Streptomicina-PenicillinaCellgro30-002-CI
CD2F1 topiHarlan060
Apparecchio per anestesiaEZ-AnesthesiaEZ-7000
2-Metil butanoSigma-AldrichM32631
OCTTissue-Tek4583
CriostatoLeicaCM1850
Dischi di sugheroMicroscopia elettronica Sciences63305
Superfrost plus vetriniVWR48311-703
Anticorpo policlonale di coniglio anti-lamininaSigma-AldrichL9393
Anticorpo monoclonale di topo anti-distrofinaVector LaboratoriesVP-D508
Alexa Flour 594 anti-topo IgGLife TechnologiesA11062
Alexa Flour 594 anti-coniglio IgGLife TechnologiesA21211
EmatossilinaSigma-AldrichGHS216
EosinaSigma-AldrichHT110332
XileneAcros Organics422680025
Cytoseal-XYLThermo8312-4
MicroscopioZeissObserver.Z1 
Tavoletta di bambùWacomCTH-661
Prism 7.0 per Mac OS XGraphPad Software, Inc.
Excel per Mac 2011Microsoft Corp.
ImageJUS National Institutes of HealthIJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
MicrotainerBD365873

Riferimenti

  1. Tan, B., Fearon, K. Cachexia: prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 11, 400-407 (2008).
  2. Aulino, P., et al. Molecular cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC cancer. 10, 363(2010).
  3. Bonetto, A., et al. STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PloS One. 6, e22538(2011).
  4. Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303, E410-E421 (2012).
  5. Bonetto, A., et al. Deacetylase inhibitors modulate the myostatin/follistatin axis without improving cachexia in tumor-bearing mice. Current Cancer Drug Targets. 9, 608-616 (2009).
  6. Acharyya, S., et al. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of skeletal muscle gene products. The Journal of Clinical Investigation. 114, 370-378 (2004).
  7. Fearon, K., et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. The Lancet Oncology. 12, 489-495 (2011).
  8. Holecek, M. Muscle wasting in animal models of severe illness. Int J Exp Pathol. 93, 157-171 (2012).
  9. Acharyya, S., et al. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell. 8, 421-432 (2005).
  10. Benny Klimek,, E, M., et al. Acute inhibition of myostatin-family proteins preserves skeletal muscle in mouse models of cancer cachexia. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391, 1548-1554 (2010).
  11. Pedroso, F. E., et al. Inflammation, organomegaly, and muscle wasting despite hyperphagia in a mouse model of burn cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 199-211 (2012).
  12. Soda, K., Kawakami, M., Kashii, A., Miyata, M. Manifestations of cancer cachexia induced by colon 26 adenocarcinoma are not fully ascribable to interleukin-6. International journal of cancer. 62, 332-336 (1995).
  13. Costelli, P., et al. IGF-1 is downregulated in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291, R674-R683 (2006).
  14. Palus, S., Akashi, Y., von Haehling, S., Anker, S. D., Springer, J. The influence of age and sex on disease development in a novel animal model of cardiac cachexia. International Journal of Cardiology. 133, 388-393 (2009).
  15. Norman, K., et al. Effect of sexual dimorphism on muscle strength in cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 111-116 (2012).
  16. Stephens, N. A., et al. Sexual dimorphism modulates the impact of cancer cachexia on lower limb muscle mass and function. Clinical Nutrition. 31, 499-505 (2012).
  17. Cosper, P. F., Leinwand, L. A. Cancer causes cardiac atrophy and autophagy in a sexually dimorphic manner. Cancer Research. 71, 1710-1720 (2011).
  18. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49, 319-323 (1999).
  19. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Rep. 4, 732(2015).
  20. Minamoto, V. B., et al. Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol. 49, 907-914 (2007).
  21. Murphy, K., Lynch, G. Update on emerging drugs for cancer cachexia. Expert Opin Emerg Drugs. 14, 619-632 (2009).
  22. Seto, D. N., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. A Key Role for Leukemia Inhibitory Factor in C26 Cancer Cachexia. The Journal of Biological Chemistry. 290, 19976-19986 (2015).
  23. Judge, S. M., et al. Genome-wide identification of FoxO-dependent gene networks in skeletal muscle during C26 cancer cachexia. BMC Cancer. 14, 997(2014).
  24. Kliewer, K. L., et al. Adipose tissue lipolysis and energy metabolism in early cancer cachexia in mice. Cancer Biol Ther. 16, 886-897 (2015).
  25. Aversa, Z., et al. Changes in myostatin signaling in non-weight-losing cancer patients. Ann Surg Oncol. 19, 1350-1356 (2012).
  26. Bonetto, A., et al. Early changes of muscle insulin-like growth factor-1 and myostatin gene expression in gastric cancer patients. Muscle Nerve. 48, 387-392 (2013).
  27. Lazarus, D. D., et al. A new model of cancer cachexia: contribution of the ubiquitin-proteasome pathway. The American Journal of Physiology. 277, E332-E341 (1999).
  28. al-Majid, S., McCarthy, D. O. Resistance exercise training attenuates wasting of the extensor digitorum longus muscle in mice bearing the colon-26 adenocarcinoma. Biol Res Nurs. 2, 155-166 (2001).
  29. Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 303. 303, E410-E421 (2012).
  30. Samuels, S. E., et al. Liver protein synthesis stays elevated after chemotherapy in tumour-bearing mice. Cancer Lett. 239, 78-83 (2006).
  31. Cornwell, E. W., Mirbod, A., Wu, C. L., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. C26 cancer-induced muscle wasting is IKKbeta-dependent and NF-kappaB-independent. PloS One. 9, e87776(2014).
  32. Penna, F., et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are prevented by ERK inhibition. PloS One. 5, e13604(2010).

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