Spaziale e temporale Analisi di attiva ERK nel<em&gt; C. elegans</em&gt; Linea germinale

Sommario

Presentiamo un metodo di imaging basata immunofluorescenza per la localizzazione spaziale e temporale di ERK attivo nel sezionato C. elegans gonade. Il protocollo qui descritto può essere adattato per la visualizzazione di qualsiasi segnalazione o proteina strutturale in C. elegans gonadi, disponibile un opportuno anticorpo è disponibile.

Abstract

Il segnale extracellulare evolutivamente conservato trasduzione RTK-RAS-ERK percorso è un importante cascata di chinasi di segnalazione che controlla più processi cellulari e dello sviluppo principalmente attraverso l'attivazione di ERK, chinasi terminale del percorso. regolamentazione stretta di attività ERK è essenziale per il normale sviluppo e l'omeostasi; risultati ERK eccessivamente attivi nella eccessiva proliferazione cellulare, mentre poco attiva ERK provoca la morte delle cellule. C. elegans è un sistema potente modello che ha contribuito a caratterizzare la funzione e la regolazione di RTK-RAS-ERK percorso di segnalazione durante lo sviluppo. In particolare, il percorso RTK-RAS-ERK è essenziale per C. elegans sviluppo della linea germinale, che è al centro di questo metodo. L'utilizzo di anticorpi specifici per la attiva, sotto forma diphosphorylated di ERK (dpERK), il modello di localizzazione stereotipo può essere visualizzato all'interno della linea germinale. Poiché questo modello è sia spazialmente e temporalmente controlled, la capacità di saggiare riproducibile dpERK è utile identificare regolatori della via che influenzano dpERK durata del segnale e l'ampiezza e sviluppo pertanto germinale. Qui mostriamo come sezionare con successo, macchia, e l'immagine dpERK all'interno del C. elegans gonade. Questo metodo può essere adattato per la localizzazione spaziale di qualsiasi segnalazione o proteina strutturale in C. elegans gonadi, disponibile un anticorpo compatibile con immunofluorescenza è disponibile.

Introduzione

Il recettore tirosin-chinasi (RTK) -RAt sarcoma (RAS) del segnale -Extracellular regolamentato chinasi (ERK) percorso trasmette i segnali extracellulari attraverso una cascata chinasi conservata che provoca la fosforilazione e l'attivazione di ERK ^1-3. Proteine ERK sono membri del conservata MAP serina / treonina prolina-diretto (mitogeno Protein Attivato) famiglia chinasi, e sono azionati direttamente dal MEK tramite doppia fosforilazione in treonina (T) e tirosina (Y) del motivo TEY conservata. ERK attivo (denominato diphosphorylated ERK, o dpERK) regola quindi molti processi cellulari e dello sviluppo attraverso la sua fosforilazione di una batteria di substrati a valle ^1-3. Così l'attività di ERK anomala porta a molte delle cellule e difetti di sviluppo ^4-7.

disciplina rigorosa di attività ERK è un fattore critico per il normale sviluppo: nei mammiferi troppa attività ERK porta alla eccessiva proliferazione cellulare leaderalla crescita oncogeno; troppo poca attività porta alla morte delle cellule ^4,6. Inoltre, cambiamenti nella durata dell'attività ERK può anche portare a risultati distinti: in cellule PC12, ERK per 30 minuti o meno induce proliferazione cellulare, ma ERK per 60 minuti o più induce differenziazione neuronale ^8,9. regolamentazione stretta di attività ERK è quindi chiaramente essenziale per il normale sviluppo e l'omeostasi.

C. elegans è un potente, e geneticamente malleabile sistema modello per sezionare la funzione e la regolazione del RTK-RAS-ERK via di segnalazione ^3,10-15. Relativa ai sistemi di mammiferi, che contengono più geni per RAS e ERK, C. elegans contiene un gene RAS (let-60) e un gene ERK (MPK - 1), rendendolo un sistema geneticamente più facile in cui analizzare la funzione di questo percorso ^3,10-14. Il C. elegans germinale è essenzialmente un tubo che si compone di mitoticocellule staminali alla sua estremità distale e oociti maturi alla sua estremità prossimale (Figura 1) ^16. Le cellule germinali iniziano meiosi appena prossimale alla zona mitotico distale, e il progresso attraverso un profase meiotica esteso (pachitene), dopo di che cominciano a formarsi ovociti nella regione di loop, infine, in fase di maturazione degli ovociti nella regione prossimale ^16.

Studi genetici da più laboratori, compreso il nostro, hanno dimostrato che la via RTK-RAS-ERK è essenziale per lo sviluppo della linea germinale in C. elegans ^{12,13,15,17-19.} In particolare, abbiamo trovato che i controlli ERK e coordina almeno nove processi biologici distinti durante lo sviluppo della linea germinale, che vanno da switch dello sviluppo come l'apoptosi delle cellule germinali in cella processi biologici quali la crescita del ^11,18 ovocita. Proprio come nei mammiferi, troppa attività ERK in C. elegans risultati germinali nella produzione di alcune piccole ovociti, mentre troppo Lirisultati dell'attività ttle in un unico grande ovocita ^11. Così stretto regolazione della dpERK è essenziale per il normale sviluppo della linea germinale. La forma attiva di ERK, come visualizzato mediante un anticorpo specifico per dpERK, visualizza un stereotipo, dinamico, bimodale modello localizzazione: dpERK è alto durante metà pachytene (Zona 1, Figura 1), basso nella regione di loop e di nuovo alta in maturo ovociti (Zona 2, figura 1). Recentemente, abbiamo scoperto che la nutrizione agisce attraverso il fattore di crescita insulino-like receptor-1 (daf-2) per attivare ERK in Zona 1 ^12; lavoro precedente ha mostrato che il segnale di sperma (attraverso il Ephrin recettore tirosin-chinasi) attiva ERK in Zona 2 ^13.

Dato che le funzioni di ERK attivi come un reostato nella linea germinale di regolare la crescita degli ovociti, la localizzazione spaziale e temporale, così come l'ampiezza di dpERK, è la chiave per comprendere la sua normale esito di segnalazione. Utilizzando il metodo descritto qui, cambia inla localizzazione stereotipata di dpERK può essere facilmente monitorato e le previsioni deriva sull'impatto delle perturbazioni ambientali o genetiche sull'attività ERK e così la funzione. Così, analizzando per dpERK consente una completa comprensione del suo ruolo durante lo sviluppo della linea germinale.

Protocollo

Il protocollo qui descritto è in primo luogo per il sistema modello invertebrati C. elegans, e segue tutte le linee guida etiche stabilite dall'istituzione.

1. Manutenzione degli animali

1. Mantenere C. elegans di lavoro stock culture sul nematode crescita a medio ^20,21 (NGM, vedi Materiali Tavolo) agar seminato con E. coli OP50.
2. Mantenere gli stock a vite senza fine a temperature comprese tra 16 ° C e 25 ° C.
   NOTA: La coltura vermi alle più alte temperature si traduce in maggiore velocità di crescita, spesso, lo sviluppo della linea germinale aberranti e dimensioni covata inferiori. Inoltre, genotipi sensibili alla temperatura mostreranno fenotipi diversi a diverse temperature.
3. Trasferire i vermi a nuove piastre NGM ogni 2 - 3 giorni a seconda sul loro tasso di crescita in modo da mantenere una fornitura costante di vermi ben nutriti.
   NOTA: Per ogni esperimento che coinvolge i livelli dpERK, vermi NON devono essere ottenuti da un morto di fame o di follapiatto ed. Affollamento o impatti fame segnalazione dell'insulina nei vermi ^22, e segnalazione dell'insulina regola ERK ¹² attività. Così i vermi da lastre Starved o sovraffollate si tradurrà in modelli di marcatura variabili e difficili da riprodurre.

2. La dissezione di vermi adulti per ottenere Gonadi

1. Raccogliere 100 - 150 WT (N2) o genotipo desiderato di vermi allo stadio di sviluppo desiderato e specifico (L1, L2, L3, L4, adulti, ecc.) In 100 ml di tampone M9 in una provetta da microcentrifuga da 1,5.
2. Riempire la provetta con 900 ml di tampone M9 (vedi Materiali Tavolo). Centrifugare le provette a 1000 xg in una microcentrifuga per 1 min a temperatura ambiente.
3. Rimuovere delicatamente 900 ml del buffer M9 e scartare. Rimuovere il buffer sotto un microscopio da dissezione per garantire che i vermi non vengano accidentalmente rimossi.
4. Ripetere i punti 2.2 - 2.3 altre due volte con fresca M9 tampone ogni volta.Ciò garantisce che tutti i batteri che sono stati riportati con i vermi sono effettivamente lavati via.
5. Dopo l'ultimo lavaggio rimuovere 900 ml di tampone M9 dal tubo e degli scarti.
6. Trasferire il restante 100 ml di M9 tampone contenente i 100 - 150 vermi con una punta di 200 microlitri-micropipetta ad un fondo piatto piatto di orologio di vetro. Assicurarsi che la punta micropipetta viene tagliato in corrispondenza del segno 10 ml prima dell'uso. Non tagliare la punta comporterà tranciatura dei vermi.
7. Aggiungere 1 - 3 ml di 0,1 M levamisolo al piatto orologio di vetro contenente i vermi nel buffer M9. Agitare delicatamente il levamisolo e la M9 per consentire anche mescolare fino a quando i vermi si fermano.
   NOTA: le scorte levamisolo può essere conservato a -20 ° C per una conservazione a lungo termine. Qui, utilizzare la maggiore concentrazione di 1 - 3 mM quello che è stato descritto in letteratura ²³ 0,2 - 0,25 mm di levamisolo per ottenere una rapida perdita di mobilità negli animali. Se gli animali Flay giro per troppo long in sospensione liquida, i modelli risultanti dpERK nelle gonadi possono essere variabile (a causa di stress o di mancanza di alimentazione o di entrambi). pattern di colorazione Ulteriori riproducibili sono stati raggiunti con 1 - 3 mM levamisolo per la dissezione.
8. Fissare due aghi 25 G a due siringhe 1 mL (la dimensione della siringa non importa, il calibro dell'ago è critica). Posizionare una siringa in ogni mano (Figura 2).
9. Sotto un microscopio da dissezione, posizionare ciascun ago sotto e sopra ogni vite senza fine, come mostrato in Figura 2 e posizionare un taglio sottile sul verme vicino alla seconda lampadina faringea con un movimento a forbice. Dopo un taglio nel verme passare al successivo animali finché tutti gli animali nel piatto sono stati tagliati almeno una volta.
   NOTA: essere consapevoli che i passaggi 2,8-2,9 sono momento delicato. Sezionare tutti i vermi nel piatto in meno di cinque minuti per un modello dpERK riproducibile. tempi di dissezione più lunghi si tradurrà in un spegnimento del segnale dpERK, soprattutto in Zuno 1. Regolare il numero di vermi per ogni turno di dissezione (vale a dire, 50 vermi vs 150), se necessario, per rimanere nel lasso di tempo assegnato.
   1. Nel caso in cui una gonade estruso non è visibile durante la dissezione, non tentare un altro taglio nello stesso animale. Solitamente che si tosare solo l'animale e non provocare l'estrusione della gonade. Invece, passare al successivo animali. Worms dove le gonadi non estrudere appariranno come tali le diapositive che verranno fatte nella sezione 6 e possono essere ignorati durante l'imaging
      NOTA: Attraverso tutte le fasi di dissezione e di trasformazione, è importante ricordare che gonade rimarrà attaccato al corpo / carcassa. Non forzare la gonade e il corpo senza con l'ago. Spesso una lacerazione aberrant nel tessuto gonadico nel tentativo di recidere gonade dal corpo possono causare segnale spurio anticorpi. Il corpo / carcassa può essere ignorato durante le fasi di imaging (sezione 6), e solo il gonade ripreso. Inoltre, SOMetimes le cellule intestinali possono anche servire come controlli interni / controlli somatiche per l'anticorpo essere analizzati.

3. Fissazione gonadi

1. Dopo la dissezione è completa, aggiungere 2 ml di 3% paraformaldeide (PFA) direttamente al piatto orologio di vetro contenente 100 ml di M9 e gli animali sezionati e coprire con Parafilm. Posizionare il piatto di vetro dell'orologio coperto in una cappa.
   Attenzione: PFA è una sostanza chimica pericolosa. Così, il fissaggio deve essere eseguita nella cappa.
2. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
3. Usando una usa e getta pipetta 9 "Pasteur di vetro aggiungere 3 ml di 1x PBS-T (vedi Materiali tabella) per il piatto di vetro orologio che contiene gli animali sezionati. Mix disegnando la soluzione PFA e 1x PBS-T con gli animali sezionati nel Pasteur pipetta e rilasciando delicatamente nuovamente dentro il piatto di vetro dell'orologio. non vortice i tubi durante i lavaggi.
4. Utilizzando un frevetro sh pipetta Pasteur disegnare il 5 ml di liquido (contenente vermi sezionati, PFA e 1x PBS-T) dal piatto di vetro dell'orologio nella pipetta Pasteur e trasferire il contenuto in un nuovo 5 ml tubo di vetro conica.
5. Centrifugare le provette coniche per 30 secondi in una centrifuga clinica a 1.000 x g. Utilizzare pipette Pasteur in vetro e tubi conici come gonadi sezionati aderisce alla plastica.
6. Rimuovere e scartare il surnatante facendo attenzione in modo da non disturbare gli animali sezionati. Rimuovere il liquido dopo ogni lavaggio dal tubo conico sotto un microscopio da dissezione modo da non alterare le gonadi sezionato, e minimizzare la loro perdita.
7. Usando una pipetta Pasteur fresco, aggiungere 5 ml di 1x PBS-T per i tubi conici. Centrifugare le provette coniche in una centrifuga clinica per 30 s a 1.000 x g. Rimuovere e scartare il surnatante facendo attenzione in modo da non disturbare gli animali sezionati.
8. Ripetere passaggio 3.7 per un totale di tre volte.
9. Usando una pipetta Pasteur fresco, aggiungere 2 ml di 100%metanolo per i tubi, e mescolare delicatamente le gonadi con il metanolo elaborando nella pipetta Pasteur. Incubare la provetta a -20 ° C per almeno 1 ora.
   NOTA: dissecato gonadi possono essere memorizzati in metanolo per un massimo di 2 giorni per dpERK colorazione. Bagagli per più di 2 giorni e fino a 2 settimane è compatibile con altre applicazioni di anticorpi di colorazione, come anticorpo anti-Lamin, ma non con l'anticorpo dpERK.
10. Dopo il tempo di incubazione desiderato, ripetere il passaggio 3.7 per un totale di tre volte per lavare gonadi. Non vortice i tubi durante i lavaggi. Dopo l'ultimo lavaggio lasciare 500 ml di 1x PBS-T nel tubo conico 5 ml.
11. Utilizzando trasferire una pipetta Pasteur il contenuto della provetta conica in una provetta 1 fresco mL (6 mm x 50 mm). Consentire agli animali sezionati di stabilirsi per gravità per 5 - 10 minuti.
12. Usando una pipetta Pasteur fresco e sotto un microscopio da dissezione, rimuovere la maggior quantità di lavaggio possibile dal 1 ml tubi di vetro di spiritoHout disturbare le gonadi sezionati.

4. Blocco e trattamento Anticorpo primario

1. Aggiungere 100 ml di 30% Normal Goat Serum (NGS) diluito in 1x PBS-T (vedi Materiali tabella) agli animali sezionati nei tubi di vetro da 1 ml. 30% NGS serve come tampone di bloccaggio. Coprire il tubo con Parafilm per evitare l'evaporazione del liquido. Incubare a temperatura ambiente per 1 h oppure a 4 ° C durante la notte.
2. Dopo il tempo desiderato di incubazione, rimuovere il tampone bloccante con una pipetta Pasteur fresco, eliminando quanto più liquido possibile. Utilizzare un microscopio da dissezione per garantire che le gonadi non sia redatto nella pipetta Pasteur.
3. Diluire l'anticorpo MAPKYT (vedi Materiali Tavolo, cui questo metodo come dpERK) a 1: 400 nel 30% NGS. Preparare la diluizione degli anticorpi sufficiente per utilizzare 100 ml per provetta. Inutilizzato, anticorpo diluito può essere conservato a 4 ° C per una settimana.
4. Aggiungere 100 ml di anticorpo anti-dpERK diluita in modoluzione ai tubi di vetro 1 ml contenente gli animali sezionati. Sigillare i tubi con Parafilm. Incubare le provette a 4 ° C durante la notte.
5. Dopo incubazione durante la notte, aggiungere 800 ml di 1x PBST per le provette a RT.
6. Prelevare il campione in una nuova pipetta Pasteur di vetro e rilasciare delicatamente per garantire che le gonadi siano uniformemente sospesi in 1x PBS-T. Lasciate che le gonadi depositano sul fondo con la gravità. Rimuovere il surnatante. Questo assicura che le gonadi sezionato vengono lavati ma non danneggiate durante il processo.
7. Ripetere i passaggi 4,5-4,6 per un totale di tre lavaggi. Non vortice i tubi durante i lavaggi. Dopo il terzo lavaggio assicurarsi di rimuovere ed eliminare quanto più surnatante possibile senza disturbare gli animali sezionati. Assicurarsi che una pipetta Pasteur fresco viene utilizzato ogni volta.

5. Il trattamento anticorpo secondario

1. Durante l'anticorpo primario lava Preparare la diluizione per l'anticorpo secondario. Diluire il anti-topo SEanticorpo condary a 1: 500 nel 30% NGS. Come con l'anticorpo primario, utilizzare 100 ml per provetta. anticorpo non utilizzato può essere conservato a 4 ° C per una settimana.
2. Aggiungere 100 ml soluzione anticorpo secondario per i tubi di vetro 1 ml contenente gli animali sezionati. Coprire ciascun tubo con parafilm e poi avvolgere i tubi in alluminio per mantenere il contenuto della provetta nel buio. Incubare le provette a RT per 2 h, oppure a 4 ° C durante la notte.
3. Dopo il tempo desiderato di incubazione, aggiungere 800 ml di PBS 1x-T ai tubi e ripetere i passaggi 4,5 - 4.6 per un totale di tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere ed eliminare la maggior quantità di surnatante possibile sotto un microscopio da dissezione con una pipetta Pasteur fresco.
4. Preparare la soluzione DAPI durante i lavaggi per l'anticorpo secondario. Diluire 1 ml di DAPI (da un 1,000x magazzino di 1 mg / mL conservati a -20 ° C) in- 1 ml di 1x PBST.
5. Aggiungere 800 microlitri della soluzione diluita DAPI ai tubi contenenti laanimali sezionati. Coprire la bocca del tubo con parafilm e avvolgere ogni tubo in alluminio. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
6. Dopo l'incubazione con DAPI, rimuovere la maggior quantità della soluzione DAPI possibile con una pipetta Pasteur, sotto un microscopio da dissezione per non disturbare gli animali sezionati.
7. Aggiungere 1 goccia di soluzione ai tubi di montaggio. Avvolgere ogni tubo in un foglio di alluminio.
   NOTA: Per visualizzare dpERK colorazione, gonadi macchiati deve essere montato per la microscopia immediatamente. Per altre applicazioni anticorpali come fosforilazione della serina 10 istone H3, gonadi possono essere tenuti in mezzi di montaggio per fino a 2 settimane a 4 ° C al buio.

6. Assemblaggio diapositive e Imaging

1. Posizionare uno strato di nastro laboratorio longitudinale, sulla parte superiore, di due vetrini per microscopio (25 millimetri x 75 mm x 1 mm) come si vede nella figura 3. Inserire una fresca pulita vetrino per microscopio tra le due slitte nastrate.
   NOTA: Lo spessoredel nastro aiuta a generare un pad agarosio sul vetrino centrale. Spessore del pad agarosio è quasi uguale a quella del nastro, come il nastro serve come distanziatore per creare il pad agarosio.
2. Goccia ~ 200 ml di fuso 2% agarosio (effettuate in acqua distillata) sul vetrino da microscopio in mezzo. Introdurre rapidamente una diapositiva fresca pulita, perpendicolare e sulla parte superiore, della agarosio.
3. Lasciate che il Solidifica agarosio (1 - 2 min).
4. Rimuovere il vetrino superiore molto delicatamente, tale che il pad agarosio non viene distrutta. Il pad agarosio può rimanere attaccato sia alla parte superiore o la diapositiva in basso. Non importa quale scorrere il pad agarosio rimane attaccato, fintanto che è una superficie liscia di agarosio.
5. Usando una pipetta Pasteur trasferire gli animali sezionati sul pad agarosio. Rimuovere il liquido in eccesso dal vetrino usando una pipetta Pasteur sotto un microscopio da dissezione.
6. L'utilizzo di un capelli ciglia o capillare finemente disegnati, spingere il gonadi e intestino unamodo tra loro per diffondere gonadi sul vetrino.
7. Coprire il vetrino da microscopio con un coprioggetto misura 24 mm x 50 mm. Fare attenzione per garantire che il vetrino si abbassa dolcemente sul vetrino con bolle d'aria minimo in formazione tra il vetrino e lo scivolo.
8. Conservare a 4 ° C per una notte in una scatola di presentazione (una casella di scorrimento opaco con le diapositive in posizione orizzontale, coprivetrino up) per consentire il liquido in eccesso di evaporare e gonadi a diventare un po 'appiattito (a causa del peso del vetrino sulle gonadi). Il lieve appiattimento delle gonadi permette una migliore immagine di un tubo gonadica altrimenti tondo.
   1. Una volta che il vetrino è montato, non per esercitare una pressione verso l'alto del vetrino con le dita. Spesso questo si traduce in una distorsione di gonadi e perdita del segnale dpERK.
   2. Appiattire le gonadi durante la notte solo per l'imaging più efficace. I vetrini sono pronti per essere visualizzati non appena vengono assemblati. Per prendere immediatamente le immagini, assorbire delicatamentel'eccesso di liquido tra il vetrino e il vetrino dagli angoli utilizzando un tessuto laboratorio pulito.
9. Dopo il periodo notturno, sigillare il vetrino e applicare il coprioggetto con chiodo trasparente topcoat smalto sulle quattro angoli del coprioggetto e il confine diapositiva. Il / sigillo smalto vetrino assicura che il vetrino non si muove mentre l'imaging e protegge contro la distruzione dei campioni.
10. Immagine le gonadi con un microscopio composto a 63X. Tuttavia la lente obiettivo e microscopio possono essere variati sulla base della disponibilità di microscopi e dell'applicazione utente. Poiché la dimensione dell'intero gonadi dalla regione proliferativa ai ovociti è più grande può essere catturata in una immagine, le immagini sono presi come un montaggio con contorni sovrapposti come mostrato in Figura 4. ^{11-14, 18.}
    1. In molti casi, modificare la carcassa dopo la formazione immagine finale e assemblaggio, purché non importanti alterazioni sono fatti all'immagine linea germinale. Conservare tegli immagini crude lungo l'immagine assemblato per consentire il confronto della 'prima' di montaggio / editing e 'dopo' il montaggio / editing delle immagini.
       NOTA: Le immagini di microscopia non devono essere alterati per l'intensità del segnale o la saturazione durante il montaggio del montaggio.

Risultati

Negli animali ermafroditi WT adulti, dpERK è in genere visualizzato nella regione di metà pachitene, Zona 1, e gli ovociti maturi più da -1 a -4 o -5 (Zona 2). Perturbazioni in questo pattern di attivazione riflettono le modifiche al percorso di segnalazione. Germlines femminili non specificano spermatozoi, e quindi non visualizzare attivazione di ERK in Zona 2, con la sola attivazione debole in Zona 1. Sono rappresentati in figura 5.

Figura 1: C. elegans germinale morfologia. immagine differenziale contrasto interferenziale (DIC) di un ermafrodita adulto con il braccio gonadi a forma di U quello delineato con la linea bianca. La gonade ermafrodita adulto contiene cellule in mitosi sulla punta distale. Le cellule mitotiche entrano meiosi e il progresso attraverso profase meiotica (pachytene) in via di sviluppo in Mature ovociti nella gonade prossimale. Zona 1 e Zona 2 marchio localizzazione stereotipata di dpERK in una gonade ermafrodita adulto. Scala:. 20 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dimostrazione di aghi posizioni durante dissezioni sinistra:. Fotografia di una dissezione nel processo. A destra:. Posizioni ago con riferimento al verme Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Dimostrazione di Agarose diapositiva Preparazione. (A) Posizionare un nastro lengthwise attraverso 2 vetrini da microscopio puliti. Posizionare un vetrino da microscopio fresca pulita tra i due vetrini con il nastro come mostrato. I tre slitte sono accanto all'altra longitudinalmente. (B) Aggiungere fuso agarosio alla slitta nel centro. (C) Inserire un vetrino da microscopio fresco perpendicolare, e in cima, la slitta centrale, portando la goccia di agarosio. ( D) lasciare che il agarosio solidificare. (E) Togliere la slitta superiore lasciando dietro di sé il pad agarosio solidificato. Utilizzare il vetrino di fondo con il pad agarosio per germlines montaggio sezionati e macchiati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Imaging le diapositive come un montaggio Montaggio di un tipo di linea germinale selvaggio con DAPI (t.op) e dpERK canale (in basso). Immagini prese a 63X con sovrapposizione dei confini, scatole bianche per scatole verdi per pannello B e le immagini C. Il DAPI e dpERK per ogni pannello pannello A e B e sono state prese contemporaneamente in due diversi canali. L'immagine assemblato è mostrato in Figura 5A. Barra della scala:. 20 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5: dinamica temporale / spaziale attivazione di ERK. (AC) WT (N2) per adulti (24 ore passato metà L4 stadio di sviluppo) germlines ermafroditi colorate per il DNA (B, DAPI, bianco) e dpERK (C, rosso). Il segnale dpERK nella Zona 1, la regione pachytene, e la Zona 2, gli ovociti maturi è evidenziato. (DF)fog-2 (oz40) germlines femminili (a 8 h passato fase intermedia L4 di sviluppo) colorate per il DNA (E, DAPI) e dpERK (F). Giovani germlines femminili mostrano dpERK debole nella zona 1, e in un unico ovocita in modo indipendente sperma. Zona 2 è sperma dipendente, e quindi assente nella linea germinale femminile. Barra della scala:. 20 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

ERK attiva (dpERK) segue un modello localizzazione spaziale e dinamico stereotipata in C. elegans linea germinale. Questo modello stereotipati dpERK spaziale (figura 5), e l'ampiezza in un adulto C. elegans gonade, può essere efficacemente correlata con i molti processi biologici che ERK regolamenta. Ad esempio, l'incapacità di attivare ERK nella Zona 2 risultati in un arresto in ovociti in profase della meiosi, un fenotipo osservato in germlines femminili che non specificano spermatozoi, e quindi non attivare ERK in ovociti maturi (Figura 5). L'accoppiamento con risultati maschi 'di accumulo efficace di dpERK in Zona 2 nelle germlines femminili ^11,13, insieme con insorgenza di maturazione degli ovociti e l'ovulazione. Così analisi dei modelli spaziali e temporali di attivazione di dpERK su certe perturbazioni genetiche (come RNA interferenza mediata l'inattivazione del gene) o trattamenti chimici permette l'identificazione di fattori che regolasegnalazione ERK in ritardo e processi biologici quindi ERK-dipendente. Tali analisi permettono anche la scoperta di nuove interazioni genetiche tra vie di segnalazione.

Un fattore critico per qualsiasi analisi basata imaging è la disponibilità di reagenti funzionali come gli anticorpi che sono specifici per l'applicazione. Se un tale reagente esiste poi metodi come quello sopra descritto può essere facilmente adattato per l'analisi del modello di localizzazione per qualsiasi proteina di interesse. L'applicazione è quindi limitata dalla disponibilità di un anticorpo funzionamento. Inoltre, poiché il metodo descrive dissezione e colorazione in un determinato momento di sviluppo, permette solo l'acquisizione di informazioni in un lasso di tempo, e non far luce sulle dinamiche o regolazione della proteina in tempo reale o tasso di turnover delle proteine.

Il metodo sopra descritto è adattato da Francis et al. ^23, che è distinta dalla Seydoux e Dunn mMETODO ²⁴ per gonade estrusione e colorazione degli anticorpi. Il metodo basato su Francis et al. Sarà chiamato "metodo di sospensione" e il metodo Seydoux e Dunn chiamato "metodo congelare cracking" per il confronto. Il metodo di sospensione è stato molto efficace nelle nostre mani per ottenere modelli di localizzazione riproducibili di molecole di segnalazione, come dpERK, che sono intrinsecamente più sensibili alle condizioni di manipolazione dure. Nel caso di dpERK localizzazione, nella nostra esperienza, il segnale in Zona 1 è praticamente non rilevabile con il metodo di congelamento cracking. Inoltre, campioni di essiccazione, che può verificarsi spesso con il metodo freeze cracking, risultati in segnali spuri anticorpi. Il metodo di sospensione minimizza essiccazione del campione, poiché le gonadi sono sospese nel liquido durante tutto il processo. Troviamo anche che il metodo di sospensione è utile per l'imaging più genotipi differenti su una singola diapositiva. Per esempio, se due genotipi, come ermafroditi vsle femmine sono da confrontato direttamente per dpERK localizzazione, i due genotipi possono essere miscelati insieme ed elaborati. Questo è possibile perché i fenotipi sono distinti e possono essere distinti con morfologie DAPI. Colorazione nello stesso tubo seguita da immagini sulla stessa slitta permette la comparazione diretta tra le gonadi di diversi genotipi. In alternativa, se le morfologie DAPI non sono distinguibili, poi una colorazione anticorpale in due fasi può essere adottato. Prima ciascun genotipo è trattata con due anticorpi distinti, Anticorpi A per WT e anticorpo B per mutante (entrambi gli anticorpi devono essere sollevata in un host distinto dal anticorpi dpERK). Una volta che i due genotipi sono state colorate con l'anticorpo primario, e lavati, essi possono essere miscelati insieme in un tubo e ora colorate con l'anticorpo dpERK, seguito da un trattamento anticorpo secondario per visualizzare tutti gli anticorpi nel tubo. La capacità di confrontare i diversi genotipi su una singola diapositiva, soprattutto quando Deductions di pattern di attivazione sono stati fatti assicura interpretazioni accurate non affetti da condizioni di colorazione distinte.

Mentre vantaggiosa, ci sono più passaggi durante il metodo di sospensione che richiedono un'attenta manipolazione. E 'fondamentale che le dissezioni si verificano in un momento in modo efficiente; Soprattutto, le dissezioni non devono assumere più di 5 min. volte dissezione più lunghi si traducono in segnali dpERK variabile, che spesso possono essere erroneamente interpretato come cambiamenti in regolamentati ERK, piuttosto che fallimenti tecnici. E 'fondamentale per iniziare con più di 100 - 150 animali per ogni dissezione perché durante i vari passaggi di lavaggio delle gonadi possono essere facilmente perse dai tubi a causa di errori di pipettamento. La perdita di gonadi può essere ridotto o sezionando in più piccoli lotti (come ad esempio tre lotti di 50 animali ciascuno) che possono essere combinati o da sezionare una grande serie di 150. Un'altra sfida è ottenere le gonadi a giacere in una ben distanziati formazionesulla slitta in modo che l'intera gonade distale può essere ripreso. Per consentire questa operazione, utilizzare un ciglio su un fiammifero o una pipetta tirato per distanziare le gonadi. Tuttavia, occorre prestare attenzione in modo da non danneggiare le gonadi durante questo processo. Spesso con queste tecniche ci vogliono più tentativi di padroneggiare le dissezioni, nonché le modalità delle gonadi sulle diapositive.

Una volta che questa tecnica è stato masterizzato, serve come un potente metodo per analisi biologiche diverse, e può essere usato per studiare più appena livelli dpERK. Ad esempio, questo metodo può essere utilizzato per visualizzare i livelli di p38 attivi, o livelli CDK attive, o qualsiasi proteina per la quale esiste un anticorpo. Inoltre, il metodo può essere accoppiato con uno schermo di inibizione chimica in animali interi di dosaggio per gli inibitori nuovi o attivatori del percorso, tramite il saggio per i livelli dpERK. Ciò consentirà una lettura in vivo sia reazione e sensibilità per eventuali inibitori che possono interact con la via di segnalazione RTK-RAS-ERK. Inoltre, questo metodo può essere usato in combinazione con anticorpi più uscite di segnalazione che possono essere utilizzati e visualizzabili contemporaneamente. L'utilizzo di più anticorpi consente la correlazione tra più percorsi, il loro stato di attivazione, e risultati tutti all'interno dello stesso tessuto, consentendo una migliore comprensione di queste interazioni. Questi sono solo alcuni esempi di ulteriori applicazioni di questo metodo, ma questo sistema possono essere modificati per studiare più interessi di ricerca.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarosio	Sigma Inc.	A9539	Sciogliere 2 g in 100 mL per ottenere la soluzione al 2%
Piatto per orologio in vetro a fondo piatto	Agar Scientific	AGL4161	Usiamo il vetro perché le gonadi sezionate spesso si attaccano alla plastica
Aghi da 25 G Siringhe	BD PrecisionGlide	305122
(potrebbero essere 1 o 5 mL)	Siringhe BD	1 mL: BD 309659
Vetrini per microscopio (25 x 75 x 1,0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Vetrini coprioggetti (24 x 50 mm)	Corning	2935-245
Provetta conica in vetro da 5 mL	Corning	8060-5
Pipetta Pasteur monouso da 9"	Fisherbrand	13-678-20D
Centrifuga
Provette in vetro (6 x 50 mm)	Soluzione Fisherbrand	14-958-A
*M9
Levamisolo	Sigma	L9756
3% Paraformaldeide (PFA)	Servizi di microscopia elettronica	17500	Ottenuto come soluzione al 16% in fiale e diluito al 3% in tampone fosfato di potassio
1x PBS-T	1x PBS con 0,1% Tween 20
microscopia elettronica	metanolo	18510
Capra normale siero (NGS)	Cell Signaling	5425	diluito al 30% in 1x anticorpo PBS-T
MAPKYT (dpERK)	Sigma Inc.	M9692	Diluizione 1:400 in 30% NGS
Anticorpo secondario	Invitrogen	A-11005	Diluizione 1:500 in 30% NGS
DAPI		Sigma D9542
Vectashield	Vector Labs	H-1000
*M9 Ricetta			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g di NaCl, 1 mL 1 M di MgSO4, H2O a 1 L.
**PBS (1x)			8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, 0,133 g CaCl2, 0,10 g MgCl2, H2O a 1 L di
terreno di crescita dei nematodi (NGM)			3 g di NaCl, 17 g di Agar, 2,5 g di peptone, 975 mL di acqua in 2 L di pallone di Erlenmayer. Autoclave per 50 min. Raffreddare e aggiungere 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di 5 mg/mL di colesterolo, 1 mL di 1 M MgSO4 e 25 mL di 1 M KPO4.

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