Recentemente sono stati sviluppati numerosi biosensori di forza basati su FRET, che consentono la risoluzione proteina-specifica della forza intracellulare. In questo protocollo, dimostriamo come uno di questi sensori, progettato per il linker della proteina del complesso nucleoscheletro-citoscheletro (LINC) Nesprin-2G, possa essere utilizzato per misurare le forze di actomiosina sul complesso nucleare LINC.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un protocollo per l'utilizzo di trasferimento di energia per risonanza (FRET) biosensori -force per misurare le forze meccaniche in tutto il complesso LINC nucleare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il complesso LINC è stato ipotizzato come la struttura critica che media il trasferimento delle forze meccaniche dal citoscheletro al nucleo. Nesprin-2G è un componente chiave del complesso LINC che collega il citoscheletro di actina alle proteine di membrana (proteine del dominio SUN) nello spazio perinucleare. Queste proteine di membrana si collegano alle lamine all'interno del nucleo. Recentemente, una sonda di forza FRET (Förster Resonance Energy Transfer) è stata clonata in mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (sensore di tensione)) e utilizzata per misurare la tensione attraverso Nesprin-2G in fibroblasti NIH3T3 vivi. Questo articolo descrive il processo di utilizzo di Nesprin-TS per misurare le forze del complesso LINC nei fibroblasti NIH3T3. Per estrarre le informazioni FRET da Nesprin-TS, viene anche presentato uno schema di come dismescolare spettralmente le immagini spettrali grezze nei canali fluorescenti accettore e donatore. Utilizzando un software open source (ImageJ), le immagini vengono pre-elaborate e trasformate in immagini raziometriche. Infine, vengono presentati i dati FRET di Nesprin-TS, insieme alle strategie per confrontare i dati tra diversi gruppi sperimentali.
Introduzione
Sensibile alla Forza, sensori FRET geneticamente codificati recente sono emersi come uno strumento importante per misurare forze di trazione basati in cellule vive, permettono di approfondire come le forze meccaniche vengono applicate attraverso proteine 1, 2, 3, 4. Con questi strumenti, i ricercatori possono immagine in modo non invasivo le forze intracellulare nelle cellule viventi utilizzano microscopi a fluorescenza convenzionali. Questi sensori sono costituiti da una coppia FRET (proteine fluorescenti donatore e accettore, più frequent....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Ottenere Nesprin-2G sensore DNA e di altri DNA plasmidico
- Ottenere Nesprin-2G TS (sensore di tensione) controllo, Nesprin-2G HL (senza testa), mTFP1, venere, e TSmod da una fonte commerciale. Propagare tutti i plasmidi di DNA e purificare utilizzando ceppi standard di E. coli, come DH5-α, come descritto in precedenza 12, 13.
2. Le cellule trasfezione con Nesprin-2G e altri plasmidi DNA
- Coltivare fibroblasti NIH 3T3 cellule al 70-90% di confluenza in un piatto di coltura cellulare 6 pozzetti in un incubatore standard di coltura cellulare con ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Seguendo il protocollo di cui sopra, il DNA plasmidico è stato acquisito dal repository DNA e trasformato in cellule di E. coli. E. coli che esprimono il DNA sensore sono stati selezionati da LB / piastre ampicillina e amplificati in un brodo LB liquido. Seguendo l'amplificazione dei vettori, plasmidi di DNA sono stati purificati in tampone TRIS-EDTA utilizzando uno standard, disponibile in commercio Kit di isolamento del DNA. Utilizzando uno spettrofotometro, DNA purif.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Procedimento e dimostrazione di cellule vive di tensione meccanica di tutti Nesprin-2G, una proteina nel complesso LINC nucleare, è stata illustrata sopra. Prima di questo lavoro, varie tecniche, come micropipetta aspirazione, magnetico-tallone citometria, e microscopica laser ablazione, sono stati utilizzati per applicare tensione sul nucleo cellulare e per misurare le proprietà materiali sfusi 16, 17, 18. Tuttavi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Thomas F. e Kate Miller Jeffress Memoria Trust (a dicembre) e NIH concedere R35GM119617 (a dicembre). Il microscopio confocale di imaging è stata effettuata presso l'impianto di VCU Nanomateriali Caratterizzazione core (NCC).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Recupera da https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Recupera da https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Recupera da https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Recupera da https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Recupera da https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillina | Sigma | A9518 | |
| Spettrofotometro | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| Cuvetta al quarzo | Biorad | 1702504 | Cuvetta per SmartSpec Plus |
| Kit di isolamento del DNA | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| per coltura cellulare a 6 pozzetti | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell Piastra per coltura in polistrene a 6 pozzetti |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| terreno cellulare a siero ridotto | Gibco | 31985-070 | Medium a siero ridotto, "optimem" |
| Lipide Soluzione vettore | invitrogen | 11668-019 | Reagente lipidico, "Lipofectamine 2000" |
| Tubo di plastica sterile da 1,5 ml | Denville | c2170 | |
| Tripsina | Gibco | 25200-056 | 0,25% Tripsina-EDTA (1x) |
| piatto di visualizzazione per microscopio con fondo di vetro | In vitro Scientific | D35-20-1,5-N | Piatto da 35 mm con pozzetto inferiore da 20 mm #1,5 |
| fibronectina | ThermoFisher | 33016015 | fibronectina proteina umana, soluzione |
| salina tamponata con fosfato plasmatico (PBS) | Gibco | 14190-144 | Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco |
| 15 mL provetta da centrifuga sterile | Greiner bio-one | 188261 | |
| rotore oscillante | Thermo electron | Centra CL2 | Rotore oscillante Thermo electron 236 |
| cappa di biosicurezza per colture cellulari | Incubatore | 1284 | |
| Microscopio fluorescente a campo largo a LED invertito | |||
| Siero fetale bovino Tecnologie | Life 10437-028 | ||
| Confocale a temperatura controllata-invertito con sorgenti laser da 458 e 515 nm. | Zeiss | LSM 710-w/rivelatore | |
| Terreno di crescita | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasti | ATCC | CRL-1658 |
Riferimenti
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dep....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
