La valutazione post-mortem dell'infarto del miocardio (MI) nei roditori si basa sulla quantificazione dell'infarto su sezioni di cuore colorate. Descriviamo un metodo accurato per quantificare le dimensioni dell'infarto utilizzando il campionamento sistematico di cuori di ratto raccolti dalla base all'apice e l'analisi delle immagini di sezioni istologiche colorate con tricrombi.
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Articolo metodologico
Quantificazione istologica di cronica Myocardial Infarto in Rats
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'infarto del miocardio è definito come la morte dei cardiomiociti dovuta a ischemia prolungata; una risposta infiammatoria e la formazione di cicatrici (fibrosi) seguono il danno ischemico. Dopo la fase acuta iniziale, il rimodellamento cronico del ventricolo sinistro (LV) modifica la struttura e la funzione del cuore. La legatura coronarica permanente nei piccoli animali è stata ampiamente utilizzata come modello di riferimento per un modello cronico di infarto miocardico. L'assottigliamento della parete infartuata si sviluppa progressivamente in fibrosi transmurale. La valutazione istologica delle dimensioni dell'infarto viene comunemente eseguita; Ciononostante, manca una standardizzazione dei metodi di quantificazione. In effetti, importanti aspetti metodologici, come il numero di sezioni analizzate e i metodi di campionamento e quantificazione, di solito non sono descritti e quindi precludono il confronto tra le indagini. Troppo spesso la quantificazione viene eseguita su una singola sezione ottenuta a livello dei muscoli papillari. Poiché sono in fase di studio nuove strategie volte a ridurre l'espansione e il rimodellamento dell'infarto, vi è un'importante necessità di standardizzare protocolli di campionamento cardiaco accurati. Descriviamo un metodo accurato per quantificare le dimensioni dell'infarto utilizzando un campionamento sistematico di cuore di ratto raccolto e analisi di immagini di sezioni istologiche colorate tricromatiche ottenute dalla base all'apice. Forniamo anche prove che il calcolo dell'indice di espansione (EI) ha permesso di valutare le dimensioni dell'infarto, tenendo conto dei cambiamenti del ventricolo sinistro durante il rimodellamento.
Introduzione
Infarto del miocardio (MI) è una delle principali cause di morte e disabilità in tutto il mondo. La malattia coronarica è la causa principale; MI deriva da ischemia consecutivo a eventi coronarici quali l'occlusione. Quando riperfusione non viene eseguita entro le prime 6 ore, ischemia induce necrosi miocardica irreversibile. Nei pazienti, la caratterizzazione di MI si basa su diversi strumenti diagnostici, tra cui i segni clinici, elettrocardiogramma, valutazione dei livelli plasmatici di biomarcatori, l'ecocardiografia, risonanza magnetica per immagini, e istologica analisi 1. Acuta e cronica MI sono classificati in due diverse fasi di pregiudizio secondo i tempi della necrosi miocardica rispetto al tempo della occlusione coronarica. La fase acuta, che si verificano durante i primi 7 giorni, è associato con la perdita di cardiomiociti, infiammazione estesa, e il reclutamento di fibroblasti. La fase sub-acuta, caratterizzata da guarigione del tessuto cardiaco e la formazione di una cicatrice, si verificatra 1 e 4 - 6 settimane. Espansione dell'infarto, assottigliamento della parete del ventricolo, e il ventricolo dilatazione caratterizzano la fase cronica. Ampia rimodellamento del ventricolo sinistro si traduce progressivamente in grave insufficienza cardiaca 2.
MI indotta da permanente discendente anteriore sinistra (LAD) legatura rappresenta il modello roditore livello di infarto miocardico cronico. I imita legatura coronarie l'occlusione coronarica. Le dimensioni dell'infarto dipende dal sito della legatura. Caratterizzazione di danno ischemico del miocardio in un modello di roditore è classicamente eseguita utilizzando i livelli plasmatici di biomarker, come la troponina I e T 3, l'ecocardiografia, risonanza magnetica, e istologia 4,5. livelli di biomarker sono correlati con l'entità della morte dei cardiomiociti. L'ecocardiografia valuta la funzione ventricolare sinistra di valore derivante da anomalie di movimento della parete regionali. Inoltre, le tecniche di imaging non invasive, come la risonanza magnetica o ad alta risoluzioneecocardiografia, permetta la valutazione della riduzione di movimento della parete, il volume dell'area cicatriziale con ridotta perfusione e miocardio vitale, e l'assottigliamento della parete. dimensioni LV permettono la valutazione accurata della dimensione dell'infarto. Infine, la quantificazione del miocardio vitale e morti può essere eseguita un'autopsia con macchie specifiche di sezioni istologiche di cuori raccolte e consente la verifica della dimensione dell'infarto (IS). Un'altra caratteristica importante è la valutazione dell'indice di espansione dell'infarto (EI) 6. L'EI è associato con l'infarto transmurale e inizia entro i primi 3 giorni. L'EI è caratterizzata da una progressiva riduzione di spessore della parete, un aumento delle dimensioni della cavità LV, e conseguenti cambiamenti di forma LV.
Per valutare l'efficacia terapeutica di nuovi trattamenti - in particolare, le strategie di rigenerazione basata su cellule, matrici, e gene valutazione delivery-accurata MI nei roditori è di fondamentale importanza.Quando misurato su una singola sezione trasversale ottenuta a livello muscolo papillare, la dimensione IS può essere polarizzato a causa della grande variabilità che esiste nello sviluppo dell'infarto seguente legatura LAD; l'infarto apice potrebbe essere poi occultato. È importante sottolineare che le metodologie più accurate alle dimensioni MI determinato sono stati descritti per topi o ratti 7-9 10. Tuttavia, IS è insufficiente per quantificare con precisione LV rimodellamento o riduzioni terapeuticamente indotte (o prevenzioni) del rimodellamento. Infatti, IS è comunemente espressa come percentuale del volume totale LV valutata su sezioni trasversali del cuore. Anche se questo metodo è valido per infarto miocardico acuto, l'assottigliamento della parete LV si verificano durante il rimodellamento rimane sotto-valutato 11,12. Una completa quantificazione morfometrica delle dimensioni dell'infarto e cambiamenti strutturali dovrebbe quantificare diversi parametri, quali la lunghezza endocardici ed epicardici e diametri, così come infarto e zone sane. Descriviamo un appr metodologicaoach per valutare con precisione MI e rimodellamento in un modello di ratto cronica.
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Protocollo
Tutti gli animali hanno ricevuto cura umana nel rispetto della Convenzione europea sulla cura degli animali. Le procedure chirurgiche sono state eseguite in conformità con la legge svizzera sulla protezione degli animali dopo aver ottenuto l'autorizzazione del veterinario di Stato, Friborgo, approvato dal veterinario, la Svizzera federale.
Raccolta 1. Cuore
NOTA: Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti in anestesia isoflurano. Gli sforzi sono stati fatti per ridurre la sofferenza degli animali. In particolare, tutti gli animali hanno ricevuto una iniezione sottocutanea di 0,1 mg / kg buprenorfina pre-anestesia. Il protocollo chirurgico per induzione di infarto miocardico è stato precedentemente descritto altrove 13.
- Eseguire una sternotomia su un animale myocardially infartuato in anestesia (animale intubato, 2,5% isoflurano, anestesia corretta confermati dalla zampa pizzico reflex).
- Aprire l'animale tagliando la pelle e poi i muscolicon le forbici chirurgiche. Tagliare le costole a sinistra ea destra, e quindi rimuovere il petto.
- Rimuovere le adesioni rimanenti dopo l'intervento chirurgico precedente (LAD legatura). Tagliare l'aorta e rimuovere il cuore. Mettere il tessuto in 1 M KCl (in PBS), e poi lavare con PBS.
2. Preparazione del tessuto
- Mettere il cuore infartuato longitudinalmente in una matrice acrilica cuore di ratto. Tenerlo a -20 ° C per 1 ora.
- Tagliare cuore direttamente nella matrice con una lama di rasoio con una trasversale. Assicurarsi che ogni fetta ha uno spessore di 2 mm. Tagliare circa 5 - 7 diapositive per ogni cuore (in base al livello rimodellamento); questo è chiamato campionamento sistematico.
- A questo punto, eseguire la colorazione cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) è facoltativo (mantenere l'orientamento del cuore fette base-apice).
- Incubare in 1% TTC in PBS per 50 min a 37 ° C. Incubare in 4% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a 1 ora. Mettere le sezioni between due lastre di vetro con distanziatori 2 mm e scattare foto con un microscopio stereologica accoppiato con una macchina fotografica a 15X di ingrandimento.
ATTENZIONE! Paraformaldeide è tossico.
- Incubare in 1% TTC in PBS per 50 min a 37 ° C. Incubare in 4% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a 1 ora. Mettere le sezioni between due lastre di vetro con distanziatori 2 mm e scattare foto con un microscopio stereologica accoppiato con una macchina fotografica a 15X di ingrandimento.
- Far scorrere il congelamento (1 opzione st)
- Mettere ciascun vetrino in uno stampo di plastica (10 x 10 x 5 mm) con supporto per cryotomy (temperatura di taglio ottimale, OCT) di montaggio, mantenere l'orientamento (posizionare il lato apice orientata della sezione giù sul fondo dello stampo). Congelare i blocchi con vapori 2-metilbutano sotto azoto liquido di raffreddamento per 10 - 15 minuti. Infine, memorizzare il tessuto a -80 ° C.
- Paraffinization (opzione 2 nd)
- Posizionare ciascuna diapositiva incorporamento cassette (mantenere l'orientamento posizionando il lato apice orientata della sezione sul fondo della cassetta) e poi in 4% PFA per 24 ore. Mettere in una macchina durante la notte processatore.
- Incubare in etanolo al 70% per 2 ore. Incubare a Ethanol 95% per 2 ore. Incubare in etanolo 100% per 3 ore. Incubare in xilolo per 4 ore. Incubare in paraffina (fuso a 60 ° C in forno) per 5 ore. Infine, fare blocchi, grazie all'integrazione di ogni diapositiva cuore in paraffina.
- Posizionare ciascuna diapositiva incorporamento cassette (mantenere l'orientamento posizionando il lato apice orientata della sezione sul fondo della cassetta) e poi in 4% PFA per 24 ore. Mettere in una macchina durante la notte processatore.
3. Masson-Goldner colorazione tricromica
- Rendere sezioni di tessuto da blocchi di paraffina con un microtomo manuale (spessore 5 um) o dai blocchi oltremare con un criostato impostato a -18 ° C (spessore 7 micron).
- Macchia un vetrino da ogni parte del cuore per ogni ratto (3 - 4 sezioni trasversali per vetrino) con Masson-Goldner colorazione tricromica (vedi allegato).
NOTA: Inizia da questo passaggio per le sezioni di paraffina.- Sciogliere i vetrini a 60 ° C in un forno. Sotto una cappa aspirante, li Deparaffinare in xilolo due volte per 10 minuti ciascuno. li Reidratare in 100% di etanolo, 95% di etanolo, 70% di etanolo e acqua distillata per 3 minuti ciascuno.
NOTA: Inizia da questo passaggio per il cryosectionS. - fissarli in Bouin soluzione durante la notte. Poi, sciacquarli sotto acqua corrente per 10 - 15 minuti. Sciacquare con acqua distillata. incubare in ematossilina di Mayer per 3 min.
- Rimuovere le diapositive e lasciarli in acqua distillata per 5 min. Poi, incubare in acido Fuchsin-Ponceau per 5 min. Risciacquare in acido acetico 1% per 1 min.
- Poi, incubare in acido fosfomolibdico Arancio G per 1 min. Risciacquare in acido acetico 1% per 1 min, incubare a colorante verde luce per 10 minuti, e sciacquare in acido acetico 1% per 1 min.
- li Disidratare in etanolo al 70% (30 sec), 95% di etanolo (30 sec), e il 100% di etanolo (5 min). Mettere una goccia di un mezzo di montaggio resinoso sulle sezioni di tessuto, coprire con coprioggetto, e lasciarli asciugare.
- Sciogliere i vetrini a 60 ° C in un forno. Sotto una cappa aspirante, li Deparaffinare in xilolo due volte per 10 minuti ciascuno. li Reidratare in 100% di etanolo, 95% di etanolo, 70% di etanolo e acqua distillata per 3 minuti ciascuno.
4. Infarct Size Analysis
- Acquisire una immagine da ogni diapositiva su uno stereomicroscopio (15x) accoppiato con una macchina fotografica. Fotografare un righello con la stessa impostazioneS.
- Utilizzare immagine software di analisi per misurare lo spessore della cicatrice in mezzo dell'infarto, lo spessore del setto, la zona della cavità ventricolo sinistro (LV), la zona dell'infarto, e l'area di tessuto LV utilizzando.
- Impostare la scala con l'immagine righello (Figura 1A).
- Clicca su misurazioni quindi selezionare Imposta fattore di conversione. Tracciare una linea sulla barra di calibrazione. Fare clic destro sull'immagine e cliccare su taratura finale. Si noti il valore bar, e quindi fare clic su OK.
- Selezionare il LV dalla foto del cuore colorato (Figura 1B). Utilizzare lo strumento segmento multiplo. Selezionare il punto per punto LV, e quindi fare clic destro Copia / incolla da nessuna parte.
- Misurare lo spessore della cicatrice e membrana con lo strumento di misurazione singolo segmento (Figura 1C ).
- Rileva automaticamente il LV cavità, infarto, e le aree LV utilizzando lo strumento di misurazione locale automatico in modalità RGB (Figura 1D).
- Fare clic sullo strumento. Attiva solo Bordi e Contigui in modalità RGB. Infine, fare clic all'interno dell'area di interesse per rilevarla. Se necessario, utilizzare strumenti di precisione.
- Impostare la scala con l'immagine righello (Figura 1A).
- Calcolare le dimensioni dell'infarto come rapporto dell'area infartuata all'area LV.
- Calcolare l'indice di espansione come segue: [LV zona cavità / intera area LV] / [spessore infarto / spessore del setto], con l'intera area LV comprendente sia la cavità LV e aree di tessuto LV.
- Infine, calcolare un "medio" per ogni cuore come segue: [media dell'indice di espansione dalle diapositive infartuati] * [numero di diapositive infartuati / numero totale di diapositive].
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Risultati
Sei settimane post-LAD legatura, cuori sono state raccolte da ratti di Lewis. sezioni di tessuto 2 mm, sono state ottenute dall'apice alla base. Una procedura di colorazione TTC è stata effettuata per visualizzare l'area infartuale, che appare in bianco, e il miocardio sano, che appare in rosso (Figura 2). A seconda del sito di legatura LAD, le dimensioni dell'infarto varia. Per le grandi MI, infarti transmurale sono stati osservati dal vertice alla base
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Discussione
I passaggi critici all'interno del protocollo
tessuto fibrotico può essere valutata con precisione in un modello di ratto MI cronica con campionamento sistematico del cuore e l'immagine raccolta analisi di sezioni istologiche tricromatiche macchiato ottenuti dalla base all'apice. Due passi sono particolarmente importanti per l'attuazione del protocollo di successo. In primo luogo, l'uso di KCl per la raccolta cardiaca permette il muscolo cardiaco per esse...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Lo studio è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale Svizzera [SNF 310030-149986 a MNG], dall'Università di Friburgo e dall'Ospedale di Friburgo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Matrice di cuore di ratto in acrilico 2 mm | 72-5015 | Harvard Appartus | |
| Inspira ventilatore avanzato a volume controllato | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Catetere Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| O.C.T | BDHA361603E | VWR | |
| TTC | T8877-10G | Sigma Aldrich | |
| Mayer ematossilina | MHS32-1L | Sigma Aldrich | |
| Acid Fuchsin CI 42685 | F8129-50G | Sigma Aldrich | |
| Ponceau Xylidin CI 16150 | P2395-25G | Sigma Aldrich | |
| Orange G CI 16230 | O3756-100G | Sigma Aldrich | |
| Verde chiaro CI 42095 | L5382-25G | Sigma Aldrich | |
| KCl | P9333-500G | Sigma Aldrich | |
| Xylol | 10315083 | HoneyWell | |
| Etanolo assoluto | 10303990 | HoneyWell | |
| 2-metilbutano | M32631-1L | Sigma Aldrich | |
| Microscopio stereogico | SM2800 | Nikon | |
| Formaldeide | 99340 | Reactolab | |
| Cassetta di inclusione | K113.1 | Carl Roth | |
| Bersoft Software | Bersoft.com | Software con licenza |
Riferimenti
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