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Articolo metodologico

Condrogenico Differenziazione induzione di cellule staminali derivate da tessuto adiposo per gravità centrifuga

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DOI:

10.3791/54934

⸱

24 febbraio 2017

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

In questo articolo

Sommario

Lo stress meccanico può indurre la differenziazione condrogenica delle cellule staminali, fornendo un potenziale approccio terapeutico per la riparazione della cartilagine compromessa. Presentiamo un protocollo per indurre la differenziazione condrogenica di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) utilizzando la gravità centrifuga (CG). L'upregolazione di SOX9 indotta dalla CG porta allo sviluppo di fenotipi condrogenici.

Abstract

La cartilagine compromessa non può guarire naturalmente. Attualmente, la terapia più avanzata per i difetti della cartilagine è il trapianto di condrociti differenziati da cellule staminali utilizzando citochine. Sfortunatamente, la differenziazione condrogenica indotta da citochine è costosa, dispendiosa in termini di tempo e associata a un alto rischio di contaminazione durante la differenziazione in vitro. Tuttavia, gli stimoli biomeccanici fungono anche da fattori regolatori cruciali per la condrogenesi. Ad esempio, lo stress meccanico può indurre la differenziazione condrogenica delle cellule staminali, suggerendo un potenziale approccio terapeutico per la riparazione della cartilagine compromessa. In questo studio, abbiamo dimostrato che la gravità centrifuga (CG, 2.400 × g), uno stress meccanico facilmente applicabile per centrifugazione, induce la sovraregolazione della regione Y che determina il sesso (SRY)-box 9 (SOX9) nelle cellule staminali di derivazione adiposa (ASC), inducendole ad esprimere fenotipi condrogenici. Le ASC centrifugate esprimevano livelli più elevati di marcatori di differenziazione condrogenica, come l'aggrecano (ACAN), il collagene di tipo 2 alfa 1 (COL2A1) e il collagene di tipo 1 (COL1), ma livelli più bassi di collagene di tipo 10 (COL10), un marcatore di condrociti ipertrofici. Inoltre, è stata osservata la formazione di aggregati condrogenici, un prerequisito per la condrogenesi, nelle ASC centrifugate.

Introduzione

Difetti di cartilagine articolare non guariscono naturalmente. Di conseguenza, trapianto di cellule staminali è stata proposta come un approccio promettente per la riparazione della cartilagine compromessa. Tuttavia, questo metodo richiede sia l'acquisizione di un numero sufficiente di cellule staminali e l'induzione di queste cellule a subire differenziazione condrogenico. Il midollo osseo (BM) è stato ampiamente utilizzato come fonte di cellule staminali, ma l'isolamento delle cellule da BM ha due principali svantaggi: invasività e di rendimento insufficiente. A causa della sua facilità di acquisizione, tessuto adiposo è fonte preferibile di cellule staminali. Studi precedenti hanno dimostrato la fattibilità di isolare cellule staminali dal tessuto adiposo e indurre la differenziazione condrogenica in queste cellule con citochine, come TGF-β1 1, 2. Questi metodi sono efficaci ma costosi.

Come un più basso costo alle citochine, stress meccanico può essere utilizzato perindurre la differenziazione condrogenico. Carico meccanico gioca un ruolo fondamentale nel mantenimento della salute della cartilagine articolare 3, e può indurre fenotipi condrogeniche in varie cellule. Ad esempio, la pressione idrostatica induce fenotipi condrogeniche in cellule progenitrici derivate dal sinovio attraverso la via MAP chinasi / JNK 4, e la compressione meccanica induce condrogenesi nelle cellule staminali mesenchimali umane (MSC) per upregulating geni chondrocytic 5. Inoltre, shear stress contribuisce alla espressione della matrice extracellulare chondrogenesis legati (ECM) di MSC umani 6. Gravità centrifugo (CG), uno stress meccanico facilmente applicata e controllata generato per centrifugazione, può indurre l'espressione genica differenziale in cellule 7. Ad esempio, nelle cellule di carcinoma epiteliale polmonare, l'espressione di interleuchina (IL) -1 ter è upregulated per centrifugazione 8. Therefore, come sollecitazioni meccaniche sperimentalmente inducibile, CG può essere utilizzato per indurre l'espressione genica in cellule staminali chondrocytic. Tuttavia, non è chiaro se CG può indurre la differenziazione delle cellule staminali condrogenica.

In questo studio, abbiamo scoperto che CG ha indotto la upregulation di SOX9, un regolatore maestro di condrogenesi, in ASC umani, causando la sovraespressione di geni chondrocytic. Inoltre, abbiamo confrontato gli effetti di CG su chondrogenesis con quelli di TGF-β1, il fattore di crescita più comunemente utilizzati per indurre in vitro condrogenesi nelle cellule staminali.

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Protocollo

Questo protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università Cattolica di Corea (KC16EAME0162) ed eseguito secondo le direttive NIH. Tutti i tessuti sono stati ottenuti con il consenso informato scritto.

1. centrifuga carico gravitazionale e la cultura Pellet

  1. coltura cellulare e la raccolta
    1. ASC Culture (P2-P3, vedere elenco dei materiali) in Modified medio-basso livello di glucosio Eagle Dulbecco (DMEM-LG) supplementato con siero 10% fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S) a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO 2.
    2. Quando le cellule raggiungono 80% di confluenza, scartare il mezzo e lavare le cellule con 5 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS).
    3. Aggiungere 1 ml di PBS contenente 1 mM EDTA e incubare per 2 minuti a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO 2.
    4. Toccare la piastra di coltura delicatamente, aggiungere 4 ml di terreno fresco, trasferire le cellule aun tubo da 15 ml conica e centrifugare le cellule a 250 xg per 2 minuti a temperatura ambiente (RT).
  2. carico gravitazionale centrifuga
    1. Dopo la centrifugazione (fase 1.1.4), rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet in 10 ml di DMEM-LG con il 10% FBS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
    2. Per CG caricamento, trasferire 2,5 × 10 5 cellule in una nuova provetta conica da 15 ml e centrifugare a 2400 g per 15 min.
  3. cultura pellet
    1. Subito dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e aggiungere 500 ml di mezzo di differenziazione condrogenico definito (CDM, DMEM ad alto glucosio integrato con 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM desametasone, soluzione di aminoacidi 1x MEM non essenziali, 50 mcg / mL L-prolina, e l'1% di penicillina / streptomicina). Aggiungere 50 mg / mL di preparati di acido L-ascorbico 2-fosfato ad ogni cambio medio. Come controllo positivo, indurre differentiati condrogenichesu cellule non centrifugati con l'aggiunta di CDM contenente 10 ng / mL TGF-β1.
    2. Posizionare i tubi liberamente innevate contenenti il pellet in una posizione in piedi e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2.
    3. Modificare il medium a giorni alterni per 3 settimane.
  4. cultura Micromass
    1. Immediatamente dopo la centrifugazione (fase 1.2.2; 2.400 × g per 15 min), aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di CDM.
    2. Per formare un Micromass, posizionare le cellule risospese nel centro di un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
    3. Dopo 2 h, aggiungere con attenzione 1 mL di CDM al pozzo, pipettaggio contro la parete della piastra di non perturbare il Micromass. Come controllo positivo, eseguire una cultura Micromass con le cellule non centrifugati con l'aggiunta di CDM contenente 10 ng / mL TGF-β1.
    4. Incubare la Micromass a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO 2.
    5. Modificare l'ev medioery altro giorno per 3 settimane.

2. trascrittasi inversa-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) per rilevare trascrizionale upregulation di condrogenico differenziazione marcatori

  1. Il giorno 14, utilizzare una pipetta per trasferire i pellets sferoidali in una nuova provetta da 1,5 ml e lavarli in PBS 1x.
  2. Estrarre l'RNA totale da pellet che utilizzano il guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio metodo di estrazione 9.
  3. Sintetizzare cDNA da 2 mg di RNA totale mediante trascrittasi inversa secondo il protocollo del produttore (incubare a 42 ° C per 1 ora e quindi inattivare l'enzima a 70 ° C per 5 min).
  4. Eseguire la PCR con primer specifici per i marcatori di differenziazione condrogeniche 10.

3. La colorazione per rilevare la sovraespressione di condrogenico differenziazione Marker Proteine

  1. pellet cellulari paraffina-embedding
    1. Il giorno 21,utilizzare una pipetta per raccogliere le palline sferoide e lavarli con PBS 1x.
    2. Fissare il pellet sferoidali per immersione in paraformaldeide al 4% per 24 ore.
      Attenzione: Paraformaldeide è altamente tossico. Evitare il contatto con gli occhi, la pelle o le mucose. Ridurre al minimo l'esposizione e evitare l'inalazione durante la preparazione. Indossare dispositivi di protezione adeguati.
    3. Eliminare il fissativo e lavare il pellet di cellule con acqua deionizzata (DW).
    4. Mettere uno strato di garza sulla cassetta e trasferire i pellet fisse con una pipetta. Coprire il pellet piegando la garza e chiudere il coperchio della cassetta.
    5. Disidratare il pellet.
      1. Immergere il pellet in 70% di etanolo (EtOH) per 5 minuti a temperatura ambiente.
      2. Immergere il pellet in 80% EtOH per 5 minuti a RT.
      3. Immergere il pellet in 95% EtOH per 5 minuti a RT.
      4. Immergere i pellets in 100% EtOH per 5 minuti a RT. Ripetere due volte.
      5. Immergere i pellets in 100% xilene per 15 minuti a RT. Ripetere twiCE.
    6. Incorporare i pellet cellulari fissati in paraffina a 56 ° C in uno stampo; il pellet possono essere incorporati in paraffina utilizzando sistemi di lavorazione dei tessuti specializzati automatizzati.
    7. Tagliare 5 sezioni micron di spessore dal pellet cellulare in paraffina utilizzando un microtomo rotativo.
    8. Float sezioni nel 50% EtOH e poi trasferirli in un bagno d'acqua a 50 ° C utilizzando una diapositiva.
    9. Posizionare le sezioni galleggianti su vetrini.
  2. Safranina O e Alcian colorazione blu
    1. Reidratare il sezioni di paraffina.
      1. Immergere i vetrini in xilene per 15 min. Ripetere due volte.
      2. Immergere i vetrini in 100% EtOH per 5 min. Ripetere due volte.
      3. Immergere i vetrini in 90% EtOH per 5 min.
      4. Immergere i vetrini in 80% EtOH per 5 min.
      5. Immergere i vetrini in 70% EtOH per 5 minuti, e poi lavare in PBS 1x.
    2. Macchiare le sezioni reidratati con soluzione di safranina O 1% e il 3% blu Alcian per30 minuti.
    3. Eliminare la soluzione colorante e lavare le sezioni con DW.
    4. Macchiare le sezioni con soluzione ematossilina / eosina (di contrasto) per 1 min.
    5. Eliminare la soluzione colorante e lavare le sezioni con DW.
    6. Mettere una goccia di mezzo di montaggio sul vetrino dopo aver rimosso l'acqua residua. posizionare con cura il vetrino (cellule rivolto verso il basso) sul vetrino che contiene il mezzo di montaggio.
    7. Lasciare i vetrini si asciughino per 2-3 ore a temperatura ambiente.
    8. Acquisire immagini utilizzando un microscopio in campo chiaro (microscopio verticale automatizzato, 50X e 200X).
  3. test di immunofluorescenza
    1. Reidratare sezioni come descritto nella sezione 3.2.1.
    2. Immergere i vetrini in tampone citrato di sodio (10 mM sodio citrato, 0,05% Tween 20, pH 6,0), e quindi di mantenere ad una temperatura sub-bollente per 10 minuti usando un forno a microonde.
    3. Raffreddare i vetrini per 20 minuti a temperatura ambiente e poi lavarle con acqua del rubinetto.
    4. Incubare i vetrini a 3%H 2 O 2 (in 1x PBS) per 15 minuti, e poi lavare con acqua corrente per 15 minuti 11.
    5. Bloccare i vetrini con tampone di bloccaggio (10% di siero normale di capra in PBS) per 1 ora.
    6. Aspirare la soluzione di saturazione, e quindi applicare un anticorpo primario diluito con 5% di siero normale di capra sulle diapositive.
    7. Incubare i vetrini notte a 4 ° C.
    8. Lavare i vetrini tre volte in 1x PBS per 5 minuti ciascuna.
    9. Incubare i vetrini in anticorpo secondario coniugato a un fluorocromo diluito con 5% di siero normale di capra per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
    10. Lavare i vetrini tre volte in PBS 1x per 5 minuti ciascuna al buio.
    11. Incubare i vetrini con DAPI (1 mg / ml) per 10 minuti, e poi lavarli due volte in 1x PBS per 5 minuti ciascuna.
    12. Mettere una goccia di mezzo di montaggio sul vetrino dopo aver rimosso l'acqua residua. posizionare con cura il vetrino (cellule rivolto verso il basso) sul supporto di montaggio.
    13. Lasciare i vetrini si asciughino per 2-3h al buio a temperatura ambiente.
    14. Visualizza le diapositive utilizzando microscopia a fluorescenza (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X e 200X ingrandimento) 12.

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Risultati

gravità centrifuga induce la sovraespressione di marcatori di differenziazione condrogeniche in cellule staminali derivate da tessuto adiposo.

Per determinare il grado di forza di gravità centrifuga atta ad indurre la differenziazione condrogenico, ASC sono state stimolate con diversi gradi di CG (0, 300, 600, 1200, e 2400 xg) per 15 min. Dopo la stimolazione, le ASC sono stati ri-seminate su piastre di coltura e coltivate per...

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Discussione

Lo stato stemness delle cellule è molto importante per la sovraespressione CG-indotta SOX9. Nel nostro studio, espressione SOX9 potrebbe essere indotta da CG ASC precoce passaggio (2-3), ma non in ASC dopo-passaggio. E 'stato riportato che, durante la coltivazione, ASC contengono cellule CD34 + fino a 3 passaggi 16. ASC tendono a perdere l'espressione di CD34 come le cellule sono diversi passaggi, con conseguente bassa risposta al CG.

Con forza di gravità cent...

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Dichiarazioni

Dichiariamo di non avere conflitti di interesse associati a questo lavoro.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (numero di sovvenzione: HI14C2116) e dal Fondo di Ricerca del Seoul St. Mary's Hospital, l'Università Cattolica della Corea.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Plasticware
100 mm PiattoTPP93100
Piatto da 60 mmTPP93060
50 mL Tubo cornicoSPL50050
15 mL Tubo cornicoSPL50015
10 mL Pipetta monousoFalcon7551
5 mL Pipetta monousoFalcon7543
ASC Materiali per terreni di coltura
DPBSLife Technologies14190-144
DMEM Tecnologie per la vita a basso contenuto di glucosio11885-084terreni di base per la crescita
Penicilina StreptomicinaSigma AldrichP43331%
Siero fetale bovinoLife Technologies16000-04410%
PBS/1 mM EDTALife Technologies12604-039
Materiali per terreni di differenziazione condrogenica
DMEM High glucoseLife Technologies11995mezzi di base per differenziazione condrogenica
Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (100x)Life Technologies11140-050
DesametasoneSigma AldrichD2915100 nM
Penicilina StreptomicinaLife TechnologiesP43331%
Fetale Siero Bovino LifeTechnologies16000-0441%
Ascorbato-2-fosfatoSigma AldrichA896050 μ g/mL
L-prolinaSigma AldrichP560750 μ g/mL
ITSBD1%
TGF&beta umano; 1Peprotech100-2110 ng/mL
Materials
18 mm Vetro di coperturaSuperiorHSU-0111580
4% ParaformaldyhydeTech & InnovazioneBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
Siero bovino Albuminavettoriale LabSP-5050
Anti-Collagene II anticorpoabcam ab34712Anticorpo
secondario IgG (H+L) anti-coniglio 1:100, Alexa Fluor 594 Sonda molecolare coniugataA-11037Sonda molecolare DAPI 1:200
D1306
Reagente antidissolvenza in oro prolungatoInvitrogenP36934
rivestitoHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
CloroformioSigma Aldrich366919
IsopripilalcolMillipore109634
EtanoloDuksan64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Kit di sintesiThermo ScientficK1622
i-Taq DNA polimerasiiNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
stella di caricoDyne BioA750
AgarosioSigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) Marcatore a scala del DNAEnzimicheDM003
Cellule staminali umane di derivazione adiposa (ASC)Cellule
354352 Vetro per vetrini , MASTER cattoliche

Riferimenti

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