Articolo metodologico

Condrogenico Differenziazione induzione di cellule staminali derivate da tessuto adiposo per gravità centrifuga

DOI:

10.3791/54934

⸱

24 febbraio 2017

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

In questo articolo

Sommario

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Lo stress meccanico può indurre la differenziazione condrogenica delle cellule staminali, fornendo un potenziale approccio terapeutico per la riparazione della cartilagine compromessa. Presentiamo un protocollo per indurre la differenziazione condrogenica di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) utilizzando la gravità centrifuga (CG). L'upregolazione di SOX9 indotta dalla CG porta allo sviluppo di fenotipi condrogenici.

Abstract

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La cartilagine compromessa non può guarire naturalmente. Attualmente, la terapia più avanzata per i difetti della cartilagine è il trapianto di condrociti differenziati da cellule staminali utilizzando citochine. Sfortunatamente, la differenziazione condrogenica indotta da citochine è costosa, dispendiosa in termini di tempo e associata a un alto rischio di contaminazione durante la differenziazione in vitro. Tuttavia, gli stimoli biomeccanici fungono anche da fattori regolatori cruciali per la condrogenesi. Ad esempio, lo stress meccanico può indurre la differenziazione condrogenica delle cellule staminali, suggerendo un potenziale approccio terapeutico per la riparazione della cartilagine compromessa. In questo studio, abbiamo dimostrato che la gravità centrifuga (CG, 2.400 × g), uno stress meccanico facilmente applicabile per centrifugazione, induce la sovraregolazione della regione Y che determina il sesso (SRY)-box 9 (SOX9) nelle cellule staminali di derivazione adiposa (ASC), inducendole ad esprimere fenotipi condrogenici. Le ASC centrifugate esprimevano livelli più elevati di marcatori di differenziazione condrogenica, come l'aggrecano (ACAN), il collagene di tipo 2 alfa 1 (COL2A1) e il collagene di tipo 1 (COL1), ma livelli più bassi di collagene di tipo 10 (COL10), un marcatore di condrociti ipertrofici. Inoltre, è stata osservata la formazione di aggregati condrogenici, un prerequisito per la condrogenesi, nelle ASC centrifugate.

Introduzione

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Difetti di cartilagine articolare non guariscono naturalmente. Di conseguenza, trapianto di cellule staminali è stata proposta come un approccio promettente per la riparazione della cartilagine compromessa. Tuttavia, questo metodo richiede sia l'acquisizione di un numero sufficiente di cellule staminali e l'induzione di queste cellule a subire differenziazione condrogenico. Il midollo osseo (BM) è stato ampiamente utilizzato come fonte di cellule staminali, ma l'isolamento delle cellule da BM ha due principali svantaggi: invasività e di rendimento insufficiente. A causa della sua facilità di acquisizione, tessuto adiposo è fonte preferibile di cellule sta....

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Protocollo

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Questo protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università Cattolica di Corea (KC16EAME0162) ed eseguito secondo le direttive NIH. Tutti i tessuti sono stati ottenuti con il consenso informato scritto.

1. centrifuga carico gravitazionale e la cultura Pellet

  1. coltura cellulare e la raccolta
    1. ASC Culture (P2-P3, vedere elenco dei materiali) in Modified medio-basso livello di glucosio Eagle Dulbecco (DMEM-LG) supplementato con siero 10% fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S) a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO 2.
    2. Quando le cellule ....

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Risultati

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gravità centrifuga induce la sovraespressione di marcatori di differenziazione condrogeniche in cellule staminali derivate da tessuto adiposo.

Per determinare il grado di forza di gravità centrifuga atta ad indurre la differenziazione condrogenico, ASC sono state stimolate con diversi gradi di CG (0, 300, 600, 1200, e 2400 xg) per 15 min. Dopo la stimolazione, le ASC sono stati ri-seminate su piastre di coltura e coltivate per.......

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Discussione

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Lo stato stemness delle cellule è molto importante per la sovraespressione CG-indotta SOX9. Nel nostro studio, espressione SOX9 potrebbe essere indotta da CG ASC precoce passaggio (2-3), ma non in ASC dopo-passaggio. E 'stato riportato che, durante la coltivazione, ASC contengono cellule CD34 + fino a 3 passaggi 16. ASC tendono a perdere l'espressione di CD34 come le cellule sono diversi passaggi, con conseguente bassa risposta al CG.

Con forza di gravità cent.......

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Dichiarazioni

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Dichiariamo di non avere conflitti di interesse associati a questo lavoro.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (numero di sovvenzione: HI14C2116) e dal Fondo di Ricerca del Seoul St. Mary's Hospital, l'Università Cattolica della Corea.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Plasticware
100 mm PiattoTPP93100
Piatto da 60 mmTPP93060
50 mL Tubo cornicoSPL50050
15 mL Tubo cornicoSPL50015
10 mL Pipetta monousoFalcon7551
5 mL Pipetta monousoFalcon7543
ASC Materiali per terreni di coltura
DPBSLife Technologies14190-144
DMEM Tecnologie per la vita a basso contenuto di glucosio11885-084terreni di base per la crescita
Penicilina StreptomicinaSigma AldrichP43331%
Siero fetale bovinoLife Technologies16000-04410%
PBS/1 mM EDTALife Technologies12604-039
Materiali per terreni di differenziazione condrogenica
DMEM High glucoseLife Technologies11995mezzi di base per differenziazione condrogenica
Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (100x)Life Technologies11140-050
DesametasoneSigma AldrichD2915100 nM
Penicilina StreptomicinaLife TechnologiesP43331%
Fetale Siero Bovino LifeTechnologies16000-0441%
Ascorbato-2-fosfatoSigma AldrichA896050 μ g/mL
L-prolinaSigma AldrichP560750 μ g/mL
ITSBD1%
TGF&beta umano; 1Peprotech100-2110 ng/mL
Materials
18 mm Vetro di coperturaSuperiorHSU-0111580
4% ParaformaldyhydeTech & InnovazioneBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
Siero bovino Albuminavettoriale LabSP-5050
Anti-Collagene II anticorpoabcam ab34712Anticorpo
secondario IgG (H+L) anti-coniglio 1:100, Alexa Fluor 594 Sonda molecolare coniugataA-11037Sonda molecolare DAPI 1:200
D1306
Reagente antidissolvenza in oro prolungatoInvitrogenP36934
rivestitoHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
CloroformioSigma Aldrich366919
IsopripilalcolMillipore109634
EtanoloDuksan64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Kit di sintesiThermo ScientficK1622
i-Taq DNA polimerasiiNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
stella di caricoDyne BioA750
AgarosioSigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) Marcatore a scala del DNAEnzimicheDM003
Cellule staminali umane di derivazione adiposa (ASC)Cellule
354352 Vetro per vetrini , MASTER cattoliche

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
  2. Erickson, G. R., et al.

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Espressione di SOX9Collagene di tipo 2Espressione di AggrecanoColtura in micromassaInclusione in paraffinaColorazione con Safranina OColorazione con Blu di Alcian

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