Qui, dimostriamo come i monociti vengono isolati mediante separazione di biglie magnetiche dalle cellule mononucleate del sangue periferico dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue umano anticoagulato. Dopo un'incubazione di 5 giorni, i monociti umani vengono differenziati in cellule dendritiche immature e sono pronti per le procedure sperimentali in un contesto non clinico.
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Articolo metodologico
Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule dendritiche (DC) riconoscono strutture estranee di diversi agenti patogeni, come virus, batteri e funghi, attraverso una varietà di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR) espressi sulla loro superficie cellulare e quindi attivano e regolano l'immunità.
La funzione principale delle DC è l'induzione dell'immunità adattativa nei linfonodi presentando antigeni tramite molecole MHC I e MHC II ai linfociti T naive. Pertanto, le DC devono migrare dalla periferia ai linfonodi dopo il riconoscimento di agenti patogeni nei siti di infezione. Per gli esperimenti in vitro o le strategie di vaccinazione con DC, vengono utilizzate di routine DC derivate da monociti. Queste cellule mostrano somiglianze nella fisiologia, nella morfologia e nella funzione con le cellule dendritiche mieloidi convenzionali. Sono generati dalla stimolazione dell'interleuchina 4 (IL-4) e del fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) di monociti isolati da donatori sani. Qui, dimostriamo come i monociti vengono isolati e stimolati dal sangue umano anticoagulato dopo l'arricchimento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) mediante centrifugazione in gradiente di densità. I monociti umani sono differenziati in DC immature e sono pronti per le procedure sperimentali in un contesto non clinico dopo 5 giorni di incubazione.
Introduzione
Le cellule dendritiche (DC) sono le più importanti cellule specializzate che presentano l'antigene del nostro sistema immunitario. Immaturo DC (IDC) risiedono nella pelle o nei tessuti delle mucose e sono quindi tra le prime cellule immunitarie per interagire con gli agenti patogeni invasori. DC rappresentano il ponte tra l'innato e il sistema immunitario adattativo 1, dal momento che possono attivare T e cellule B risposte dopo il rilevamento degli agenti patogeni. Inoltre, contribuiscono a risposte immunitarie pro-infiammatorie causa della secrezione di elevate quantità di citochine, come IL-1β, IL-6 e IL-12. DC attivare anche le cellule NK e att....
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Protocollo
Etica dichiarazione: consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti donatori di sangue dall'Istituto Centrale per Blood Transfusion & Dipartimento immunologica, Innsbruck, Austria. L'uso di esemplari rimasti anonimi per scopi scientifici è stato approvato dal Comitato Etico della Medical University di Innsbruck.
1. Arricchimento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)
- Concentrazione di PBMC mediante centrifugazione.
- Aprire il pacchetto sangue e diviso in provette da centrifuga da 50 ml sterili secondo la quantità di sangue ricevuta.
- Se necessario, regolare il volume a ....
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Risultati
Dopo centrifugazione del sangue anti-coagulato con un cuscino di saccarosio, cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono arricchite in interfase sopra del mezzo gradiente di densità (Figura 1). Dopo che i PBMC sono disegnate fuori, analisi FACS viene eseguita per caratterizzare le diverse popolazioni di cellule all'interno delle PBMC utilizzando marcatori lignaggio (ad esempio, CD3 per i linfociti T, CD14 per i monociti, e CD19 per i linfociti B).
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Discussione
Questo protocollo descrive la generazione di cellule dendritiche derivate da monociti (MDDCs) attraverso l'isolamento di monociti umani da sangue anti-coagulato utilizzando un saggio a base di nanoparticelle magnetiche. In questo protocollo, le fasi di centrifugazione sono eseguite a monte della procedura di isolamento cellulare, che porta ad un arricchimento della frazione PBMC. Sebbene le cellule sono persi durante la centrifugazione, di sovrapporre il contenuto di un pacchetto di sangue intero sul mezzo gradiente.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il nostro tecnico Karolin Thurnes, Divisione di Igiene e Microbiologia Medica, e la Dott.ssa Annelies Mühlbacher e il Dott. Paul Hörtnagl, Istituto Centrale per la Trasfusione di Sangue e il Dipartimento di Immunologia, per il loro prezioso aiuto e supporto riguardo a questo manoscritto. Ringraziamo il Fondo austriaco per la scienza per aver sostenuto questo lavoro (P24598 a DW, P25389 a WP).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Clone CD19 anti-umano di topo APC HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| Clone CD83 anti-umano di topo APC HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Particelle magnetiche CD14 anti-umane | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (frazione di albumina V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar Piastre a pozzetti multipli trasparenti con trattamento TC | Costar | 3506 | |
| Mezzi di gradiente di densità: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10 ml Pipetta sierologica | Corning | 357551 | |
| Falcon 25 ml Pipetta sierologica | Corning | 357525 | |
| Falcon 50 ml Provetta da centrifuga in PP ad alta chiarezza | Corning | 352070 | |
| Falcon Provette a fondo tondo | Corning | 352054 | |
| FITC Topo anti-umano CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Colorante fantasma viola 510 (reagente per la vitalità cellulare) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| FBS (siero fetale bovino) inattivato a caldo, origine approvata dall'UE (Sud America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | --- | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Tampone di isolamento: BD IMag Buffer (10x) | BD Biosciences | 552362 | |
| Soluzione di L-glutammina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Provette per microcentrifuga, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Topo Anti-Umano CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Topo Anti-Umano CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
Riferimenti
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Tur....
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Ristampe e permessi
