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Articolo metodologico

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

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DOI:

10.3791/54968

⸱

24 dicembre 2016

 ,  , 
1Division of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck

In questo articolo

Sommario

Qui, dimostriamo come i monociti vengono isolati mediante separazione di biglie magnetiche dalle cellule mononucleate del sangue periferico dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue umano anticoagulato. Dopo un'incubazione di 5 giorni, i monociti umani vengono differenziati in cellule dendritiche immature e sono pronti per le procedure sperimentali in un contesto non clinico.

Abstract

Le cellule dendritiche (DC) riconoscono strutture estranee di diversi agenti patogeni, come virus, batteri e funghi, attraverso una varietà di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR) espressi sulla loro superficie cellulare e quindi attivano e regolano l'immunità.

La funzione principale delle DC è l'induzione dell'immunità adattativa nei linfonodi presentando antigeni tramite molecole MHC I e MHC II ai linfociti T naive. Pertanto, le DC devono migrare dalla periferia ai linfonodi dopo il riconoscimento di agenti patogeni nei siti di infezione. Per gli esperimenti in vitro o le strategie di vaccinazione con DC, vengono utilizzate di routine DC derivate da monociti. Queste cellule mostrano somiglianze nella fisiologia, nella morfologia e nella funzione con le cellule dendritiche mieloidi convenzionali. Sono generati dalla stimolazione dell'interleuchina 4 (IL-4) e del fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) di monociti isolati da donatori sani. Qui, dimostriamo come i monociti vengono isolati e stimolati dal sangue umano anticoagulato dopo l'arricchimento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) mediante centrifugazione in gradiente di densità. I monociti umani sono differenziati in DC immature e sono pronti per le procedure sperimentali in un contesto non clinico dopo 5 giorni di incubazione.

Introduzione

Le cellule dendritiche (DC) sono le più importanti cellule specializzate che presentano l'antigene del nostro sistema immunitario. Immaturo DC (IDC) risiedono nella pelle o nei tessuti delle mucose e sono quindi tra le prime cellule immunitarie per interagire con gli agenti patogeni invasori. DC rappresentano il ponte tra l'innato e il sistema immunitario adattativo 1, dal momento che possono attivare T e cellule B risposte dopo il rilevamento degli agenti patogeni. Inoltre, contribuiscono a risposte immunitarie pro-infiammatorie causa della secrezione di elevate quantità di citochine, come IL-1β, IL-6 e IL-12. DC attivare anche le cellule NK e attirare altre cellule immunitarie al sito di infezione da parte di chemiotassi.

DC può essere diviso in cellule immature dendritiche (IDC) e cellule dendritiche mature (MDC) 2 sulla base della loro morfologia e funzione. Dopo il riconoscimento di antigeni estranei da uno dei molti recettori pattern recognition (ad esempio, recettori toll-like, tipo Clectine, o complemento recettori) abbondantemente espresso sulla superficie delle cellule, iDCs subiscono grandi cambiamenti e cominciano a maturare. Durante questo processo di maturazione, i recettori per la cattura di antigene sono down-regolati, mentre molecole essenziali per la presentazione dell'antigene sono regolate up-3. DC mature up-regolazione dei complesso maggiore di istocompatibilità I e II (MHC I e II), molecole co-stimolatorie come CD80 e CD86, che sono essenziali per la presentazione dell'antigene e l'attivazione dei linfociti T. Inoltre, l'espressione del recettore delle chemochine CCR7 sulla superficie cellulare viene indotta, che permette la migrazione delle DC dai tessuti periferici ai linfonodi. La migrazione è facilitata dalla "rolling" di DC lungo un ligando chemochina 19 (CCL19 / MIP-3b) e chemochine ligando 21 (CCL21 / SLC) gradiente ai linfonodi 4-6.

Dopo la migrazione, MDCS presentano l'antigene processato per naïve cellule CD4 + e CD8 +, quindi initiating una risposta immunitaria adattativa contro l'invasore patogeno 7. Questa interazione con le cellule T nei linfonodi è anche associato con la diffusione del virus 8. Altri studi in vitro hanno rivelato che le cellule dendritiche catturare e trasferire l'HIV a cellule T e che questo risultati di trasmissione in una infezione vigorosa 9-12 in modo efficiente. Questi esperimenti evidenziano che in vivo HIV sfrutta DC come navette dalla periferia ai linfonodi. Durante presentazione dell'antigene, DC secernono interleuchine chiave che determinano la differenziazione delle cellule T helper effettrici, e quindi il risultato della intera risposta immunitaria contro il microbo è determinata in questo interazione. Oltre a tipo 1 (Th1) e tipo 2 cellule (Th2) T effettrici, altri sottoinsiemi di cellule T CD4 + helper (ad esempio, il tipo 17 (Th17) e di tipo 22 (cellule Th22) T) sono state descritte, e la loro induzione e la funzione sono stati studiati a fondo. DC sono inoltre coinvolti inla generazione di cellule T regolatorie (Tregs) 13,14. Queste cellule sono immunosoppressiva e possono fermare o down-regolare l'induzione o la proliferazione delle cellule T effettrici e sono quindi di fondamentale importanza per lo sviluppo di immunità e la tolleranza.

DC convenzionali umani (CDC) comprendono diversi sottoinsiemi di cellule con una origine mieloide (vale a dire, Cellule di Langerhans (LCS) e per via cutanea e DC interstiziali) o di origine linfoide (ad esempio, cellule dendritiche plasmacitoidi (pDCs)). Per gli esperimenti in vitro o strategie di vaccinazione DC, DC derivate da monociti sono abitualmente utilizzati come modello per DC dermici. Queste cellule mostrano somiglianze nella fisiologia, la morfologia e la funzione di cellule dendritiche mieloidi convenzionali. Esse sono generate mediante aggiunta di interleuchina 4 (IL-4) e granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF) di monociti isolati da donatori sani 12,15-18. Le cellule dendritiche possono anche essere isolati direttamente da cutanee o mucose biopsie, o può anche be sviluppato da cellule progenitrici ematopoietiche isolate da campioni di sangue del cordone ombelicale ottenuti ex utero CD34 +. Qui, si dimostra come i monociti sono isolati e stimolati dal sangue umano anti-coagulato dopo cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di arricchimento mediante centrifugazione in gradiente di densità. Dopo incubazione per 5 giorni, monociti umani in condizioni specifiche sono differenziati in iDCs e sono pronti per le procedure sperimentali in un ambiente non clinico.

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Protocollo

Etica dichiarazione: consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti donatori di sangue dall'Istituto Centrale per Blood Transfusion & Dipartimento immunologica, Innsbruck, Austria. L'uso di esemplari rimasti anonimi per scopi scientifici è stato approvato dal Comitato Etico della Medical University di Innsbruck.

1. Arricchimento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

  1. Concentrazione di PBMC mediante centrifugazione.
    1. Aprire il pacchetto sangue e diviso in provette da centrifuga da 50 ml sterili secondo la quantità di sangue ricevuta.
    2. Se necessario, regolare il volume a 50 ml per ogni tubo con sterile Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (D-PBS).
    3. Porre i tubi in una centrifuga e girare a 400 xg per 15 min a temperatura ambiente (RT) senza freno.
    4. Disegnare lo strato superiore contenente plasma e piastrine con una sterile pipetta 10 ml sierologica, lasciando il boundary strato indisturbato.
      NOTA: Se plasma autologo invece di FCS è utilizzato per integrare il mezzo di coltura, il plasma deve essere raccolto e calore inattivato in questa fase.
    5. Raccogliere le cellule mononucleate (strati limite) da due 50 ml provette da centrifuga e trasferirli in una provetta sterile da 50 ml con una sterile 10 ml pipetta sierologica.
    6. Regolare il volume a 50 ml per ogni tubo con sterile D-PBS.
    7. Porre i tubi in una centrifuga e girare a 400 xg per 15 minuti a RT senza freno.
    8. Aspirare lo strato superiore contenente il plasma e piastrine utilizzando una pipetta sterile 10 ml sierologica, lasciando lo strato limite indisturbati.
    9. Raccogliere le cellule mononucleate (strati limite) dai tubi centrifuga da 50 ml e trasferirli in due provette sterili 50 ml di raccolta utilizzando una sterile 10 ml pipetta sierologica.
    10. Regolare il volume a 50 ml per ogni tubo con sterile D-PBS.
  2. Separazionedi PBMC di centrifugazione in gradiente di densità (Figura 1).
    1. Preparare quattro 50 ml tubi e pipetta 15 ml di terreno gradiente di densità in ogni provetta.
    2. Prendere 25 ml di pool cellule / sangue dal tubo di raccolta (fase 1.1.10) e sovrapporre con attenzione il gradiente di densità media.
    3. Porre i tubi in una centrifuga e girare a 700 xg per 30 min a RT senza freno.
  3. Raccolta e depurazione delle PBMC.
    1. Aspirare lo strato superiore contenente il plasma e piastrine utilizzando una pipetta sterile 10 ml sierologica, lasciando lo strato PBMC indisturbati.
    2. Raccogliere l'interfase PBMC da tutte le provette e in comune le cellule in due sterili provette da 50 ml con una sterile 25 ml pipetta sierologica.
    3. Regolare il volume a 50 ml per ogni tubo con sterile D-PBS. Porre i tubi in una centrifuga e girare a 400 xg per 15 min a 4 ° C con il freno.
    4. Aspirare il surnatante e risospendere ilcellule in sterili D-PBS. In comune le cellule da entrambi i tubi e regolare il volume a 50 ml con sterile D-PBS.
    5. Collocare le provette nella centrifuga e girare a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.
    6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in sterili D-PBS. Regolare il volume a 50 ml con sterile D-PBS e pipetta 50 microlitri di una provetta da 1,5 ml contenente 450 ml di D-PBS.
    7. Vortex la provetta da 1,5 ml vigorosamente e contare le cellule in una camera di Neubauer o qualsiasi altro strumento conteggio delle cellule.
    8. Porre i tubi 50 ml nella centrifuga e girare a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.

2. Isolamento dei monociti da Anti-CD14 umani Particelle Magnetiche

  1. Etichettatura di PBMC con particelle magnetiche.
    1. Regolare la concentrazione PBMC di 8 x 10 7 cellule / ml utilizzando tampone di isolamento.
    2. Vortex le particelle magnetiche CD14 anti-umano thoroughly e aggiungere 50 ml di particelle per ogni 1 x 10 7 PBMC.
    3. Mescolare la sospensione cellulare particella accuratamente ed incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  2. Separazione delle frazioni positive e negative.
    1. Regolare il volume fino a 12 ml utilizzando tampone di isolamento.
    2. Preparare sei tubi a fondo rotondo sterili e pipetta 2 ml di sospensione cellulare-particelle in ogni provetta.
    3. Porre immediatamente i tubi sul magnete. incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
    4. Mantenere i tubi sul magnete e con attenzione disegnare il sopranatante. Il surnatante contiene la frazione negativa.
    5. Rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere 2 ml di tampone di isolamento.
    6. Delicatamente risospendere le cellule pipettando su e giù.
    7. Posizionare i tubi di nuovo sul magnete. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    8. Mantenere i tubi sul magnete e con attenzione disegnare il sopranatante. Il surnatante contiene la frazione negativa.
    9. Rimuovere le provette dal magnete e aggiungere 2 ml di tampone di isolamento a ciascuna provetta. Delicatamente risospendere le cellule pipettando su e giù.
    10. Trasferire la frazione positiva ad una provetta sterile 50 ml e regolare il volume a 50 ml utilizzando sterile D-PBS.

3. La stimolazione dei monociti isolati con IL-4 e GM-CSF

  1. Posizionare il tubo nella centrifuga e centrifugata a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.
  2. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 50 ml di D-PBS.
  3. Pipettare 50 ml in una provetta da 1,5 ml contenente 450 ml di D-PBS. Vortex la provetta da 1,5 ml vigorosamente e contare le cellule in una camera di Neubauer o altro strumento conteggio delle cellule.
  4. Posizionare il tubo 50 ml nella centrifuga e centrifugata a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.
    NOTA: Se la frazione negativo, contenente linfociti del sangue periferico (PBL) è necessaria anche,, eseguire il lavaggio e il conteggio dei passi simili a ttubo della frazione positiva (punti 3.1-3.5).
  5. Regolare la concentrazione cellulare a 1 x 10 6 / ml con terreno di coltura pre-riscaldato (terreno RPMI 1640 supplementato con 10% soluzione inattivato al calore FBS e 1% L-Glutammina) e pipetta da 3 ml / pozzetto in piastre da 6 pozzetti.
    NOTA: Se si utilizza il plasma autologo inattivato al calore, sostituire il FCS 10% con il 1-5% di plasma autologo, a seconda del set-up sperimentale.
  6. Stimolare i monociti con umana ricombinante IL-4 (250 U / ml) e ricombinante GM-CSF umano (1.000 U / ml) pipettando citochine direttamente nel mezzo di coltura. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2.
  7. Re-stimolare le cellule con IL-4 (250 U / ml) e GM-CSF (1000 U / ml) dopo 48 ore pipettando citochine direttamente nel mezzo di coltura.
    NOTA: Se ci sono segni di acidificazione mostrato dall'indicatore di pH nel mezzo, sostituire la metà della media con terreno di coltura pre-riscaldato.
  8. Harvest immaturo cellule dendritiche il giorno 5 perdown-stream esperimenti pipettando le cellule coltivate su piastra da 6 pozzetti e in un tubo da centrifuga da 50 ml dopo pipettando mezzo di coltura su e giù alcune volte.
  9. Contare le cellule e macchiare un campione di monociti isolati con anticorpi anti-umani contro CD11b, CD11c, e DC-SIGN / CD209, insieme con un colorante vitalità cellulare. Per evitare legame aspecifico degli anticorpi durante la colorazione della superficie, l'uso di recettore Fc bloccare reagenti o siero bovino albumina buffer (BSA) è altamente raccomandato.
  10. Analizzare il campione utilizzando il colorante vitalità cellulare, secondo il protocollo del produttore, eseguendo citometria a flusso per valutare la purezza e la vitalità delle iDCs generati.

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Risultati

Dopo centrifugazione del sangue anti-coagulato con un cuscino di saccarosio, cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono arricchite in interfase sopra del mezzo gradiente di densità (Figura 1). Dopo che i PBMC sono disegnate fuori, analisi FACS viene eseguita per caratterizzare le diverse popolazioni di cellule all'interno delle PBMC utilizzando marcatori lignaggio (ad esempio, CD3 per i linfociti T, CD14 per i monociti, e CD19 per i linfociti B).

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Discussione

Questo protocollo descrive la generazione di cellule dendritiche derivate da monociti (MDDCs) attraverso l'isolamento di monociti umani da sangue anti-coagulato utilizzando un saggio a base di nanoparticelle magnetiche. In questo protocollo, le fasi di centrifugazione sono eseguite a monte della procedura di isolamento cellulare, che porta ad un arricchimento della frazione PBMC. Sebbene le cellule sono persi durante la centrifugazione, di sovrapporre il contenuto di un pacchetto di sangue intero sul mezzo gradiente...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il nostro tecnico Karolin Thurnes, Divisione di Igiene e Microbiologia Medica, e la Dott.ssa Annelies Mühlbacher e il Dott. Paul Hörtnagl, Istituto Centrale per la Trasfusione di Sangue e il Dipartimento di Immunologia, per il loro prezioso aiuto e supporto riguardo a questo manoscritto. Ringraziamo il Fondo austriaco per la scienza per aver sostenuto questo lavoro (P24598 a DW, P25389 a WP).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Clone CD19 anti-umano di topo APC HIB19BD Biosciences555415
Clone CD83 anti-umano di topo APC HB15eBD Biosciences551073
BD Imag Particelle magnetiche CD14 anti-umaneBD Biosciences557769
BD ImagnetBD Biosciences552311
BSA (frazione di albumina V)Carl RothEG-Nr 2923225
Costar Piastre a pozzetti multipli trasparenti con trattamento TCCostar3506
Mezzi di gradiente di densità: Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare Bio-Sciences17-5442-03
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (D-PBS)Sigma-AldrichD8537
Falcon 10  ml Pipetta sierologicaCorning357551
Falcon 25  ml Pipetta sierologicaCorning357525
Falcon 50  ml Provetta da centrifuga in PP ad alta chiarezzaCorning352070
Falcon Provette a fondo tondoCorning352054
FITC Topo anti-umano CD3 Clone HIT3aBD Biosciences555339
Colorante fantasma viola 510 (reagente per la vitalità cellulare)Tonbo biosciences13-0870
GM-CSFMACS Miltenyi Biotec130-093-862
FBS (siero fetale bovino) inattivato a caldo, origine approvata dall'UE (Sud America)Gibco10500-064
Hettich Rotanta 460RHettich---
IL-4 CCPromoKineC-61401
Tampone di isolamento: BD IMag Buffer (10x)BD Biosciences552362
Soluzione di L-glutamminaSigma-AldrichG7513
Provette per microcentrifuga, 1,5 ml, SuperSpinVWR211-0015
PE Topo Anti-Umano CD14 Clone M5E2BD Biosciences555398
PE Topo Anti-Umano CD209 Clone DCN46BD Biosciences551265
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR0883
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020

Riferimenti

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