Peptide di derivazione Metodo di Trasporto geni e proteine ​​Attraverso cellulari e barriere organelli in Piante

Sommario

I metodi esistenti per la modifica delle piante hanno un'applicabilità limitata. La nuova tecnologia derivata dai peptidi qui proposta promette semplicità ed efficienza nell'introduzione di proteine o geni esogeni nei compartimenti intracellulari desiderati di piante intatte.

Abstract

La capacità di introdurre proteine esogene ed esprimere (o sottoregolare) geni specifici nelle piante fornisce un potente strumento per la ricerca di base e per nuove applicazioni nel campo della biotecnologia vegetale. I metodi praticabili attualmente esistenti per il trasferimento di proteine o geni nelle cellule vegetali, vale a dire l'Agrobacterium e il bombardamento di microproiettili, presentano svantaggi di bassa frequenza di trasformazione, gamma di ospiti limitata o un costo elevato di attrezzature e microvettori. Il seguente protocollo delinea un metodo semplice e versatile, che impiega peptidi progettati razionalmente come agenti di consegna per una varietà di carichi a base di acidi nucleici e proteine nelle piante. I peptidi sono stati selezionati come strumenti per lo sviluppo del sistema grazie alla loro biodegradabilità, alle dimensioni ridotte, alle proprietà diversificate e regolabili, nonché alla capacità di ottenere l'accesso intracellulare/organellare. Vengono descritte la preparazione, la caratterizzazione e l'applicazione di formulazioni ottimizzate per ogni tipo dell'ampia gamma di carichi consegnati (DNA plasmidico, DNA o RNA a doppio filamento e proteine). Vengono inoltre discussi i passaggi critici all'interno del protocollo, le possibili modifiche e le limitazioni esistenti del metodo.

Introduzione

L'ingegneria genetica vegetale è convenzionalmente utilizzata per trasferire tratti benefici alle piante. Negli ultimi anni, questa tecnologia è stata applicata per convertire le piante in bio-fabbriche per la produzione di proteine importanti dal punto di vista farmaceutico e di valore commerciale, molte delle quali non possono essere sintetizzate chimicamente e sono molto costose da produrre utilizzando sistemi animali o microbici¹. Con l'introduzione di nuovi geni, il metabolismo della pianta può essere manipolato per la produzione di vari biofarmaci come anticorpi, enzimi metabolici, ormoni, antigeni o vaccini².

Le tecnologie consolidate di trasferimento genico per le piante sono la somministrazione mediata da Agrobacterium ³, il bombardamento con microproiettili rivestiti di DNA (biolistica)⁴ e l'elettroporazione⁵ o il trattamento con polietilenglicole⁶ dei protoplasti. Le tecniche che richiedono protoplasti sono generalmente evitate perché richiedono tempo, sono ingombranti e producono risultati incoerenti⁷. Di conseguenza, praticamente tutto il lavoro di modifica delle piante attualmente utilizza Agrobacterium o microproiettili per il trasferimento genico. Il metodo Agrobacterium è più ampiamente utilizzato ma non applicabile a molte specie vegetali economicamente importanti. Nel frattempo, il bombardamento a microproiettile è più versatile a causa di un'ampia gamma di piante sensibili, ma richiede attrezzature specializzate e spesso causa gravi danni ai tessuti. Inoltre, questi metodi coinvolgono un meccanismo di somministrazione casuale (biolistica) o complesso (Agrobacterium) e hanno tassi di trasformazione variabili⁸. Pertanto, è necessaria una nuova tecnologia di trasformazione delle piante che sia semplice ma efficace e applicabile a diversi tipi di piante.

Attualmente, le piante sono soggette a modificazione genetica principalmente attraverso la consegna di DNA esogeno che codifica un tratto desiderato, piuttosto che attraverso la consegna diretta di una proteina bersaglio. La maggiore stabilità del DNA rispetto alle proteine è un vantaggio primario; tuttavia, i potenziali problemi associati alla consegna del DNA includono l'inserimento casuale di DNA esogeno nel genoma della pianta e la trasmissione non intenzionale di geni di resistenza agli antibiotici a batteri patogeni attraverso il trasferimento genico orizzontale⁹. Ai fini dell'editing del genoma, la capacità di modificare i genomi delle piante senza introdurre DNA estraneo nelle cellule può eludere le preoccupazioni normative relative alle piante geneticamente modificate. Pertanto, una strategia alternativa priva di DNA per la modifica delle piante mediante la somministrazione diretta di proteine sarà in grado di soddisfare queste esigenze.

Qui presentiamo un sistema basato su peptidi, originariamente sviluppato per la terapia genica umana^10-14, per la somministrazione mirata di geni o proteine esogene in piante intatte. I peptidi sono in grado di proteggere il DNA dalla degradazione della nucleasi e possono mediare il trasferimento genico attraverso le membrane cellulari e organellari^15-17. Hanno anche proprietà diverse e regolabili oltre ad essere non citotossici^18-20. Ancora più importante, con l'uso di peptidi, i geni possono essere indirizzati con precisione agli organelli intracellulari come i mitocondri²¹ o i plastidi (cloroplasti)²² per l'espressione, un compito non realizzabile mediante trasformazione biolistica o mediata da Agrobacterium. A seconda del tipo di carico, questa nuova tecnologia di modifica delle piante può essere sfruttata per fornire proteine²³ ed esprimere (plasmide^21,24 o DNA a doppio filamento²⁵) o sottoregolare (RNA a doppio filamento²⁶) geni specifici all'interno della pianta, in tutto il suo spazio citosolico^24-26 o all'interno di uno specifico compartimento organellare²¹. I peptidi carrier progettati sono costituiti da un dominio cationico sotto forma di polilisina (K₈) o polilisina-co-istidina (KH)₉ per il legame e/o la condensazione di carichi caricati negativamente, che è coniugato a sequenze penetranti nelle cellule (peptide BP100) o di transito mitocondriale (peptide Cytcox).

Protocollo

1. preparazione di formulazioni Peptide-Based

1. Preparare soluzioni di ciascun peptide come segue: (KH) ₉ -BP100 (1 mg / ml o 800 nM), Cytcox- (KH) ₉ (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) e (BP100) ₂ K ₈ (70 mM). Pesare la quantità necessaria di ciascun peptide in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere acqua ultrapura autoclavato per sciogliere il peptide. Mescolare bene pipettando ripetutamente fino ad ottenere una soluzione limpida.
2. Amplifica e purificare il DNA plasmide (pDNA), a doppia elica del DNA (dsDNA) e l'RNA a doppio filamento (dsRNA) secondo metodologie molecolari standard. In provette da 1,5 ml microcentrifuga, fare soluzioni di riserva con una concentrazione di 1 mg / ml (PDNA e dsDNA) o 400 Nm (dsRNA).
3. Preparare la soluzione proteica magazzino con una concentrazione di 7 pM, sciogliendo 1 mg di proteina (es., Alcool deidrogenasi, ADH) polvere in 1 ml di soluzione di carbonato di sodio (0,1 M, pH 9). Etichetta la proteina con FLe sonde luorescent come la rodamina B (RhB) secondo protocolli standard per consentire la visualizzazione microscopica della proteina consegnato nelle cellule.
4. Unire rispettivi componenti in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
   1. Per le formulazioni peptide-PDNA mira il citoplasma, aggiungere 6,4 ml di (KH) ₉ -BP100 (1 mg / ml) a 20 ml di pDNA (1 mg / ml) e mescolare bene pipettando. Lasciare il composto si stabilizzi per 15 minuti a 25 ° C. Aggiungere 773,6 ml di acqua ultrapura autoclavato per diluire la soluzione ad un volume finale di 800 microlitri. Utilizzare il costrutto pDNA progettata per l'espressione nucleare (P35S-RLuc-NOS, tabella 1).
   2. Per le formulazioni peptide-PDNA mira i mitocondri, aggiungere 6,6 ml di Cytcox- (KH) ₉ (1 mg / ml) a 20 ml di pDNA (1 mg / ml) e mescolare bene pipettando. Lasciare il composto si stabilizzi per 15 minuti a 25 ° C e aggiungere 2,4 ml di BP100 (1 mg / ml). Lasciare il composto si stabilizzi per 15 minuti a 256; C per altri 15 min. Aggiungere 771 ml di acqua ultrapura autoclavato per diluire la soluzione ad un volume finale di 800 microlitri. Utilizzare il costrutto pDNA progettata per l'espressione mitocondriale (pDONR-COX2: rluc, Tabella 1).
   3. Per le formulazioni peptide-dsDNA, aggiungere 5,1 ml di (KH) ₉ -BP100 (1 mg / ml) a 8 ml di dsDNA (1 mg / ml) e mescolare bene pipettando. Lasciare il composto si stabilizzi per 15 minuti a 25 ° C. Aggiungere 786,9 ml di acqua ultrapura autoclavato per diluire la soluzione ad un volume finale di 800 microlitri.
   4. Per le formulazioni peptide-dsRNA, aggiungere 50 ml di (KH) ₉ -BP100 (800 nm) a 50 ml di dsRNA (400 Nm) e mescolare bene pipettando. Lasciare il composto si stabilizzi per 15 minuti a 25 ° C. Aggiungere 700 ml di acqua RNase-free per diluire la soluzione ad un volume finale di 800 microlitri.
   5. Per le formulazioni peptide-proteina, aggiungere 16 ml di (BP100) ₂ K ₈ (70 micron) a 16 ml di ADH (7 micron) e mescolareben pipettando. Lasciare il composto si stabilizzi per 15 minuti a 25 ° C. Aggiungere 768 ml di acqua ultrapura autoclavato per diluire la soluzione ad un volume finale di 800 microlitri.
5. Lasciare le formulazioni di stabilizzarsi per 15 min a 25 ° C.

2. Caratterizzazione di formulazioni Peptide-Based

1. Trasferire ogni soluzione (800 ml) in una vaschetta per dispersione della luce dinamica (DLS) analisi. Determinare il diametro e polidispersità indice idrodinamico di complessi formati con un Nanosizer zeta, utilizzando un 633 nm laser He-Ne a 25 ° C con un angolo di rilevamento retrodiffusione di 173 °.
2. misurazioni seguente formato, trasferire ciascuna soluzione (800 ml) in una cella capillare piegato per misure potenziali zeta a parametri di default di costante dielettrica, indice di rifrazione e la viscosità dell'acqua a 25 ° C.
3. Osservare un piccolo volume di soluzione complessa, utilizzata per l'analisi DLS, mediante microscopia a forza atomica (AFM). Cassetta 10 ml di soluzione complessa sulla superficie spaccati appena esposto di un foglio di mica e lasciare la mica all'aria secca durante la notte in un piatto di plastica coperto petri.
4. Acquisire un'immagine dei complessi in aria a 25 ° C utilizzando un cantilever silicio con costante elastica di 1,3 N / m in modalità ^27,28 maschiatura.

3. L'infiltrazione di foglie delle piante

1. Utilizzare 3 settimane vecchi impianti terreno coltivati (Arabidopsis thaliana ^24, Nicotiana benthamiana ²⁴ o pioppo ^26). Trasfezione almeno 3 foglie per servire come triplice copia per la quantificazione dell'espressione genica o la consegna di proteine.
2. Caricare un 1 ml siringa di plastica senza ago con 100 ml di soluzione completa per la trasfezione di una foglia. Posizionare la punta della siringa sulla superficie abassiale della foglia.
3. Premere la punta della siringa contro la foglia leggermente spingere il pistone della siringa lentamente esercitando una contropressione con l'ibarretta NDICE di una mano lattice guantata dal lato opposto. infiltrazione successo può osservare come la diffusione di una zona impregnato d'acqua nella foglia. Etichettare le foglie infiltrati per facilitarne l'identificazione.
4. Incubare la foglia transfettate per durate ottimizzati dopo infiltrazione con peptide-pDNA (12 ore), il peptide-dsDNA (12 ore), il peptide-dsRNA (9-48 ore) e peptide-proteina (6 ore) formulazioni nelle seguenti condizioni: 16 luce hr / 8 ore buio a 22 ° C per A. thaliana e pioppo, o 24 ore di luce costante a 29 ° C per N. benthamiana.

4. Valutazione di Transfection efficienza

1. Asportare l'intera foglia transfettate di impianti più piccoli (ad es., A. thaliana), o una sezione di 1 cm ² della regione infiltrato per impianti più grandi (ad es., N. benthamiana).
2. Per gli esperimenti di trasfezione utilizzando Renilla luciferasi (Rluc) giornalista vettore, determinare il transfectioefficienza n quantitativamente utilizzando un kit di Rluc Assay.
   1. Mettere ogni foglia escissa o sezione foglia in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 100 ml di 1 × Rluc Assay Lysis Buffer per provetta. Allo stesso modo, preparare lisati di foglie di controllo non transfettate (triplice copia).
   2. Macinare la foglia con un pestello omogeneizzazione e incubare il lisato risultante a 25 ° C per 6 - 10 ore.
   3. Centrifugare il lisato a 12.470 × g in una microcentrifuga per 1 min. Trasferimento 20 ml di lisato eliminato ad un bene in una micropiastra a 96 pozzetti, e utilizzare il volume rimanente per la quantificazione della concentrazione totale di proteine ​​utilizzando un kit di test BCA Protein secondo il protocollo del produttore.
   4. Aggiungere 100 ml di 1 × Rluc Assay Substrate (diluito con il tampone Rluc Assay) nel pozzo e mescolare lentamente pipettaggio. Posizionare la micropiastra in un lettore di micropiastre multimodale e avviare la misurazione.
   5. Sottrarre la luminescenza di fondo (media del non-trasfettate triplice copia) dalla luminescenza di ogni campione sperimentale. Calcolare il rapporto di fotoluminescenza (unità di luce relativa, RLU) per la quantità di proteina (mg).
3. Per gli esperimenti di trasfezione utilizzando verde proteina fluorescente (GFP) vettore giornalista o la proteina fluorescente (ad es., ADH-RhB), osservare la fluorescenza utilizzando un microscopio confocale a scansione laser.
   1. Tagliare i bordi di una foglia intera (per facilitare la rimozione di spazi aerei), mentre una foglia sezionata può essere utilizzato così com'è. Rimuovere lo stantuffo di una siringa da 10 ml e posizionare ogni sezione escissa foglia o foglia nella siringa.
   2. Sostituire il pistone e spingere delicatamente sul fondo della siringa senza schiacciare la foglia. Attingere l'acqua nella siringa fino a circa mezzo pieno.
   3. Puntare la siringa verso l'alto e spingere lo stantuffo per eliminare l'aria dalla siringa attraverso la punta. Coprire la punta della siringa e tirare lentamente lo stantuffo per espellere l'aria dal leaf. Ripetere questa operazione più volte fino a quando la foglia appare traslucido.
   4. Coprire la superficie di un vetrino da microscopio con nastro adesivo. Tagliare un'area quadrata sul nastro abbastanza grande per accogliere il campione foglia con una lama, e sbucciare il pezzo quadrato di nastro adesivo fuori con le pinze per creare una camera di campione. Il nastro servirà come distanziale fra il vetrino e coprioggetto.
   5. Posizionare la foglia nella camera con la superficie abaxial rivolta verso l'alto e riempire la zona di camera rimanente con acqua. Sigillare la foglia all'interno della camera con vetrino coprioggetti e fissare i bordi del coprioggetto con nastro adesivo.
   6. Esaminare il campione foglia utilizzando il microscopio confocale a scansione laser sotto un obiettivo 40X o di un obiettivo ad immersione 63X acqua. GFP o RhB fluorescenza possono essere visualizzate a lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nm o 555 nm, rispettivamente.

Risultati

Una serie di carichi di acidi nucleici e proteine ​​sono state introdotte con successo in diversi impianti che utilizzano i peptidi studiati come vettori di consegna. Interazioni elettrostatiche tra peptidi cationici e carichi caricati negativamente portato alla formazione di complessi trasfezione che può essere infiltrato direttamente in pianta foglie con una siringa senza ago (Figura 1). Formulazioni ottimizzate (empiricamente determinati in questi studi ^21,23-26) per la trasfezione di cellule vegetali sono elencati nella Tabella 1, in cui è rappresentata ciascuna tipologia della vasta gamma di carichi trasportati (pDNA, dsDNA, dsRNA e proteine). I diametri medi di tutte le formulazioni basati su peptidi erano nella gamma approssimativa di 150 - 300 nm. Sulla base di analisi di DLS, tutte le formulazioni visualizzati polidispersità relativamente bassa dimensione, indicando che gli aggregati del peptide-carico formate hanno una distribuzione uniforme dimensioni. Le morfologie dicomplessi tra peptide e pDNA (Figura 2A) o proteine (Figura 2B), in mica, sono state ripreso mediante AFM. Omogenei complessi globulari sono stati osservati per entrambe le combinazioni peptide-PDNA e peptide-proteina, in accordo con i dati derivati ​​dalla misurazione DLS. In termini di potenziale zeta di complessi (Tabella 1), pDNA- e complessi dsDNA-derivati avuto oneri netti di superficie negativa mentre complessi dsRNA basati avevano una carica superficiale quasi neutro. complessi peptide-proteina, d'altra parte, sono state caricate positivamente.

Le efficienze di peptide-pDNA e formulazioni del peptide-dsDNA nel mediare la trasfezione di A. thaliana o N. benthamiana come sistemi modello di piante sono stati valutati quantitativamente e qualitativamente. Il saggio di espressione genica RLuc è stato impiegato per la quantificazione dei livelli di espressione genica (Tabella 1), quindi per questo esperimento pDNA odsDNA codificante il gene RLuc deve essere utilizzato per complessazione con i rispettivi peptidi carrier. Utilizzando la (KH) ₉ -BP100 / formulazione pDNA, consegna nucleare mirata ed espressione di pDNA può essere realizzato, dopo un periodo di incubazione di 12 ore, con una RLU / Valore mg stimato di circa 1 × 10 ^5. Per la consegna mitocondriale-mirata ed espressione di pDNA, una combinazione di peptidi, Cytcox- (KH) ₉ e BP100, è necessario per la formazione del complesso. Con lo stesso periodo di incubazione ottimizzata di 12 ore, tuttavia, un livello molto più basso di trasfezione (circa 1 × 10 ³ RLU / mg) è stato raggiunto. Nel frattempo, è stato richiesto simile periodo di incubazione (12 ore) e il livello di espressione genica (circa 1 × 10 ³ RLU / mg) / registrata per i complessi dsDNA-based, anche formulata utilizzando il (KH) ₉ -BP100 peptide. valutazioni qualitative di espressione genica sono stati eseguiti da osservazione microscopica diretta di foglie trattati con complessi preparEd usando pDNA o dsDNA codificante il gene reporter GFP. In cellule trasfettate con i complessi non mirati peptide-PDNA, diffondere fluorescenza verde in corrispondenza con l'espressione della GFP è stato chiaramente osservato e ha trovato di localizzare nel citoplasma (Figura 3A). chiare differenze nel modello di localizzazione di fluorescenza GFP sono stati evidenti in cellule infiltrate con complessi peptide-PDNA mitocondriali mirati. Qui, puntiformi fluorescenza verde che colocalize con la macchia mitocondriale era visibile, confermando la specificità dell'espressione genica esclusivamente nel compartimento mitocondriale di cellule (Figura 3B).

Nel caso di formulazioni peptide-proteina, coniugazione del carico proteine ​​(ADH) per un fluoroforo (FR) permetterà la visualizzazione della proteina erogata nel compartimento intracellulare. Nel giro di un breve periodo di incubazione di 6 ore, è stato trovato per essere distribuito in tutto ADH-RhB proteine ​​(blu)citoplasma e vacuolo di cellule infiltrate (Figura 3C). Nel frattempo, rapida ed efficace down-regolazione dell'espressione genica potrebbe essere realizzato in diversi impianti che utilizzano formulazioni peptide-dsRNA. Nel primo esperimento, foglia A. thaliana è stato infiltrato con peptide-dsRNA Complessi di mettere a tacere il gene calcone sintasi (CHS) responsabile di antociani (pigmento rosso) biosintesi in condizioni di siccità. La differenza nella comparsa di A. thaliana lascia in condizioni normali (Figura 3D, a) e le condizioni di siccità (Figura 3D, b) ha fornito un facile mezzo per valutare CHS silenziamento utilizzando la formulazione peptide-dsRNA ottimizzata (freccia 1 indica la regione infiltrato). Nel secondo esperimento, complessi peptide-dsRNA sono stati infiltrati nelle foglie di transgenico A. thaliana che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP). Un apparente riduzione della espressione YFP potrebbe essere visto nelle cellule epidermiche 9 ore post-trasfezione (Figura 3E, F). L'efficacia della formulazione nell'espressione genica down-regolazione in un sistema diverso impianto (pioppo, 12 hr dopo la trasfezione) è stato inoltre verificato (figura 3G, H).

Figura 1: Formulazioni Peptide-based per la consegna di acidi nucleici e proteine in carichi piante viventi.
I peptidi carrier progettati sono costituiti da policationi coniugati con penetrante cellulare o sequenze di transito organellari. Policationi consentono vincolanti e / o condensa di carichi carica negativa così come fuga dal vano endosomal seguente internalizzazione nelle cellule. Consegna delle merci nelle cellule e, successivamente, a organelli specifici è mediata da sequenze di cellule penetrante e sequenze di transito organellari, rispettivamente. I vari carichi che potrebbero essere successfully erogato nella pianta includono acidi nucleici come pDNA, dsDNA e dsRNA, nonché proteine ​​modello come albumina di siero bovino (BSA), alcol deidrogenasi (ADH) e citrino (una variante della proteina fluorescente gialla). Molecole bioattive sono in grado di formare complessi trasfezione con coniugati peptide tramite interazioni elettrostatiche, che vengono introdotti in foglie delle piante da siringa infiltrazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: morfologie del Formulazioni Peptide-base.
(A) AFM ampiezza immagine di (KH) ₉ -BP100 formulazione / pDNA a N / P 0.5. (B) Altezza immagine AFM di (BP100) ₂ K ₈ / formulazione ADH a molare ratio 10. riprodotto con permesso da fonti pubblicate ^23,24. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Valutazione della microscopica Transfection efficienze usando formulazioni Peptide-based ottimizzati.
(A) espressione citosolico GFP (green), chiaramente distinto da autofluorescenza cloroplasto (rosso), è stato osservato nelle cellule del mesofillo spugnoso di A. thaliana foglie infiltrato con (KH) ₉ formulazione -BP100 / pDNA (N / P 0,5; 12 ore ). (B) l'espressione della GFP (verde) è stato rilevato nei mitocondri (rosso) nelle cellule epidermiche di foglia di A. thaliana infiltrati con Cytcox- (KH) ₉ / BP100 / formulazione pDNA (N / P 0,5 per ogni peptidee; 12 ore). immagini ingrandite di mitocondri con espressione GFP sono mostrati nel pannello estrema destra. (C) Consegna di ADH-RhB (blu) nelle cellule del mesofillo spugnoso di A. thaliana foglie mediata da (BP100) ₂ K ₈ in un rapporto molare di peptidi / proteine 10, visualizzate 6 ore post-infiltrazione. (D) foglie A. thaliana prima (a) e dopo (b) il trattamento con (KH) ₉ -BP100 / formulazione dsRNA (rapporto molare 2; 48 ore), che ha portato alla soppressione della via di biosintesi delle antocianine. Una formulazione analoga contenente GFP5 dsRNA stato infiltrato nella foglia come controllo negativo (c). Frecce 1 e 3 indicano l'area infiltrati mentre le frecce 2 e 4 indicano la zona non infiltrata all'interno della foglia. (E) A. thaliana lascia esprimere la proteina fluorescente gialla (YFP) e (F) la fluorescenza YFP diminuita dopo infiltrazione con (KH) ₉ -BP100 / formulazione dsRNA (rapporto molare 2; 9 ore). (G) foglie di pioppo transgenici che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) e (H) la diminuzione YFP fluorescenza dopo infiltrazione con (KH) ₉ formulazione -BP100 / dsRNA (rapporto molare 2; 12 ore). Riprodotto con il permesso di fonti pubblicate ^21,23,24,26. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Variazione Peptide-to-DNA (N / P) Rapporto e l'effetto sulle proprietà biofisiche di complessi.
Con l'aumento del peptide al rapporto di DNA, le formulazioni a base di peptidi diminuiscono in termini di dimensioni, mentre il loro valore di transizione zeta-potenziale da negativo a positivo./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: caratterizzazione e valutazione di diverse formulazioni del peptide-based. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.

Tabella 2: un confronto di peptide-based e altre tecnologie esistenti DNA di consegna per le Piante intatto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.

Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo che sono stati identificati empiricamente sono discussi. Con l'infiltrazione della siringa, le formulazioni a base di peptidi vengono introdotti gli spazi aerei all'interno del foglio della pianta attraverso gli stomi. Per garantire l'assimilazione massima della soluzione, il processo di infiltrazione deve essere effettuata quando le piante sono in condizioni favorevoli alla stomi ie., Dotate di acqua sufficiente e durante il periodo di luce. Per quanto riguarda la preparazione di complessi trasfezione, per formulazioni che coinvolgono una combinazione di due peptidi (consegna DNA mitocondriale targeting), la sequenza per aggiunta di ciascun componente è cruciale e non dovrebbe essere invertito.

Ci sono molte modifiche plausibili alla procedura. Un'altra opzione per l'infiltrazione di cellule vegetali è l'uso di infiltrazione sotto vuoto, che è in grado di introdurre la soluzione complesso in piante intere e / o tessuti parziali inclusimeristemi apicali. Per questa procedura alternativa, piantine vengono immersi nella soluzione di trasfezione, e in base alla pressione generata dal vuoto, i complessi peptide-carico vengono forzati attraverso gli stomi e nelle cellule vegetali (Yoshizumi, T., dati non pubblicati).

Espressione genica transitoria, sulla base di studi utilizzando cellule animali, ha dimostrato di aumentare con più elevate concentrazioni di DNA ^29-31. È importante notare che il rapporto di peptide di DNA influisce sulle proprietà biofisiche (dimensioni, carica superficiale) di complessi (figura 4), che influenza l'efficienza di trasfezione; di conseguenza, il rapporto ottimale deve essere mantenuta anche con una maggiore concentrazione di DNA.

Uno dei principali vantaggi nell'uso di peptidi come agente di consegna gene / proteina è che la sua sequenza è suscettibile di sintonizzazione ad espletare una funzione desiderata. Ad esempio, il dominio mitocondriale targeting del peptide carrier descritto in questo Study possono essere sostituiti con sequenze cloroplastici o perossisomiali targeting per la localizzazione di questi organelli. Mentre trasformazione cloroplasto è possibile in diverse piante usando biolistics ^32-34, né l'Agrobacterium né il metodo biolistic potrebbe introdurre geni nei mitocondri o altri organelli oltre il nucleo (Tabella 2).

Non ci sono limitazioni host-gamma rigidi per trasfezione peptide-based, a differenza del metodo basata su Agrobacterium (Tabella 2). Finora, formulazioni per la trasfezione di A. thaliana, N. benthamiana e pioppo sono stati ottimizzati (tabella 1), ma il metodo può essere applicato anche per la Nicotiana tabacum, pomodoro cultivar Micro-Tom, il riso (sulla base di esperimenti preliminari), e altre piante mono e dicotiledoni.

Finora, non vi è alcun limite noto dimensioni transgene quando peptidi sono utilizzati unvettori s trasfezione. Al contrario, grandi molecole di DNA sono stati trovati per ridurre l'efficienza di trasformazione di Agrobacterium metodi mediata ^35,36, ed un limite superiore per dimensione per transgeni di circa 200 kb è stato segnalato ^37-39. Utilizzando biolistics, invece, grandi frammenti di DNA possono essere tranciate durante la preparazione o la consegna in piante ^38. Sebbene nessun limite superiore è stato determinato per la trasformazione biolistica finora, vincoli fisici sono stati trovati per limitare le dimensioni di DNA che possono essere trasferiti a molto meno di 150 kb ^40. I principali vantaggi di utilizzare il sistema di peptide-based per il trasferimento di geni rispetto agli approcci esistenti che impiegano sia Agrobacterium o bombardamento microproiettili, di cui sopra, sono riassunti nella tabella 2.

Esistono alcune limitazioni per questo metodo così com'è. In primo luogo, mirato consegna di pDNA di organelli specifici, come l'mitochondria, è stato dimostrato possibile da una semplice combinazione di sequenze cellule penetrante e organello transito DNA-binding sebbene l'efficienza era basso. espressione del transgene potrebbe essere rilevato, mediante microscopia confocale, solo in una piccola popolazione di mitocondri all'interno delle cellule. Quindi, sono necessarie ulteriori modifiche: (i) migliorare la traslocazione di più complessi attraverso la membrana cellulare / organelli, e (ii) migliorare la dissociazione e trasferimento di pDNA dal peptide carrier nel organello di destinazione per l'espressione. In secondo luogo, con questo sistema di consegna DNA, l'espressione transiente dei geni reporter esogeni stata ottenuta con successo nel compartimento citosolico e mitocondriale di cellule. incorporazione stabile e l'espressione dei geni introdotti nel genoma centrale nucleare / organelli non sono stati ancora stabilito, tuttavia, per l'assenza di opportune strategie di selezione.

Pur riconoscendo che ci sono aree di miglioramento o ulteriori dviluppo, la strategia peptide derivato da qui descritto rimane una tecnica semplice e versatile che ha aperto la strada per la consegna dei vari carichi in diversi tipi di piante.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Peptide (KH)9-BP100	Sintetizzato su misura dal RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequenza: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 peptide	Sintetizzato su misura dal RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequenza: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK
BP100 peptide	Sintetizzato su misura dal RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequenza: peptide KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9	Sintetizzato su misura dal RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequenza: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS e P35S-RLuc-TNOS	N/A	N/A	Codifica rispettivamente per la proteina fluorescente verde e i geni della luciferasi Renilla sotto il controllo del promotore costitutivo CaMV 35S (Rif: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp e pDONR-cox2:rluc	N/A	N/A	Codifica rispettivamente per la proteina fluorescente verde e i geni della luciferasi Renilla, sotto il controllo del promotore specifico mitocondriale cox2 (Rif: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (amplificato da pBI221-P35S-Rluc-TNOS)	N/A	N/A	Codifica rispettivamente per la proteina fluorescente verde e i geni della luciferasi Renilla sotto il controllo del promotore costitutivo CaMV 35S (Rif: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNA	N/A	N/A	Per il silenziamento mediato dall'interferenza dell'RNA della proteina fluorescente verde (Rif: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNA	N/A	N/A	Per il silenziamento mediato dall'interferenza dell'RNA della calcone sintasi (Rif: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
Siringhe di plastica da 1 ml e 10 ml	TERUMO Corporation	SS-01T, SS-10ESZ
Provetta per microcentrifuga da 1,5 ml	AS ONE Corporation	151212
Piastra a fondo piatto a 96 pozzetti	Asahi Glass Co., Ltd.	3860-096
Nastro adesivo	Sekisui Chemical Co., Ltd.	N. 835
Alcol deidrogenasi	Sigma-Aldrich Co., LLC.	A-7011
Microscopio a forza atomica	Seiko Instruments Inc.	SPI3800, microscopio a forza atomica SPA 300HV
	Hitachi High-Tech Science Corporation	AFM5300E
Kit di analisi delle proteine BCA	Thermo Fisher Scientific Inc.	23227
Cantilever	Hitachi High-Tech Science Corporation	K-A102001593
Microscopio a scansione laser confocale	Carl Zeiss	LSM700
Cork Borer	Sigma-Aldrich Co., LLC.	Z165220	Per l'escissione delle foglie in dischi di 1 cm di diametro
Vetrino coprioggetti	Matsunami Glass Ind., Ltd.	C02261
Cuvetta	Sarstedt	759116
Cella capillare piegata	Malvern Instruments, Ltd.
Forcipe	Shimizu Akira Inc.	Pestello di omogeneizzazione pincet 150
	Ieda Trading Corp.	9993
Mica	Nisshin EM Co., Ltd.	LC23Z
Microcentrifuga	Beckman Coulter	BKA46472
Lettore di micropiastre	Molecular Devices Corporation	Spectra MAX M3
Vetrino per microscopio	Matsunami Glass Ind., Ltd.
Pipetta	Eppendorf Research® plus	3120000909
Puntali per pipette	AS ONE Corporation	2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Piastra di Petri in plastica	AS ONE Corporation	1-7484-01
Kit di test Renilla Luciferase	Promega corporation	E2810
Isotiocianato	di rodamina BSigma-Aldrich Co., LLC.
Acqua senza RNasi	Qiagen	129112
Carbonato di sodio	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	199-01585
Lama chirurgica e manico	FEATHER Rasoio di sicurezza Co., Ltd.	Acciaio inossidabile n. 14 (lama), n. 3L (manico)
Tappo della punta della siringa	Musashi Engineering Inc.	Bilancia di pesatura NC-3E
	Potenziometro Sartorius	CPA225D
Zeta	Malvern Instruments, Ltd.	Zetasizer Nano-ZS