Method Article

Sviluppo di un modello diretto Pulp-capping di valutazione dei polpa dentale guarigione delle ferite e riparativa dentina formazione nei topi

DOI:

10.3791/54973

⸱

January 12th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Shapiro Family Laboratory of Viral Oncology and Aging Research, The UCLA School of Dentistry, 2UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, 3David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un metodo passo-passo di eseguire incappucciamento diretto su topi denti per la valutazione della polpa guarigione della ferita e la formazione dentina riparativa in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La polpa dentale è un organo vitale di un dente completamente protetto da smalto e dentina. Quando la polpa è esposta a causa di lesioni cariogene o iatrogene, viene spesso ricoperta con materiali biocompatibili per accelerare la guarigione delle ferite pulpare. L'obiettivo finale è quello di rigenerare la dentina riparativa, una barriera fisica che funziona come un "sigillo biologico" e protegge il tessuto pulpare sottostante. Sebbene questa procedura di incappucciamento diretto della polpa sia stata a lungo utilizzata in odontoiatria, il meccanismo molecolare alla base della guarigione delle ferite pulpari e della formazione riparativa della dentina è ancora poco compreso. Per indurre la dentina riparativa, l'incappucciamento della polpa è stato eseguito sperimentalmente in animali di grandi dimensioni, ma meno nei topi, presumibilmente a causa delle loro piccole dimensioni e delle conseguenti difficoltà tecniche. Qui, presentiamo un metodo dettagliato e passo dopo passo per eseguire una procedura di incappucciamento della polpa nei topi, inclusa la preparazione di una cavità simile a quella di Classe I, il posizionamento di materiali per l'incappucciamento della polpa e la procedura di restauro utilizzando il composito dentale. Il nostro modello murino di polp-capping sarà determinante nello studio dei meccanismi molecolari fondamentali della guarigione delle ferite pulpali nel contesto della dentina riparativa in vivo, consentendo l'uso di topi transgenici o knockout che sono ampiamente disponibili nella comunità di ricerca.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le carie dentali sono una delle malattie orali più diffuse e la principale causa di interventi chirurgici alla dentizione in quasi tutti gli individui1,2. La prognosi degli interventi chirurgici e dei restauri di un dente dipende in gran parte da una corretta risposta pulpare e da una guarigione della ferita. Infatti, le carie dentali che penetrano in profondità attraverso lo smalto e la dentina portano spesso all'esposizione del tessuto pulpare sottostante che è spesso "tappato" con materiali dentali, come l'idrossido di calcio (Ca(OH)2) o i cementi idraulici calcio-silicato (HCSC), compresi gli aggregati di triossido minerale (MTA). L'obiettivo finale di tale procedura di polp-capping è quello di accelerare la guarigione delle ferite pulpali rigenerando la dentina riparativa, una barriera fisica che funziona come un "sigillo biologico" per proteggere il tessuto pulpare sottostante e per aumentare l'aspettativa di vita del dente e la salute orale generale. Tuttavia, il meccanismo alla base della guarigione delle ferite pulpari e della formazione riparativa della dentina non è completamente compreso.

Per comprendere meglio i meccanismi di guarigione delle ferite pulpali e la formazione riparativa della dentina in vivo, sono stati precedentemente utilizzati diversi animali, tra cui scimmie, cani e maiali3-5. Tra questi, i ratti sono spesso usati perché sono di dimensioni relativamente più piccole rispetto agli altri animali, ma i loro denti sono abbastanza grandi da eseguire l'incappucciamento diretto della polpa senza alcuna difficoltà tecnica6-10. Questi modelli animali sono alternative ideali agli studi sull'uomo per esaminare le risposte pulpari e la formazione riparativa della dentina. Tuttavia, il loro utilizzo è limitato a studi osservazionali a livello cellulare e forniscono scarsamente informazioni meccanicistiche durante la formazione riparativa della dentina a livello molecolare.

I recenti progressi tecnici nell'ingegneria genetica hanno fornito strumenti di ricerca inestimabili e indispensabili: topi che ospitano un gene sovraespresso o eliminato, che sono strumentali allo studio dei meccanismi molecolari delle malattie umane in vivo. Il numero di diversi ceppi di topi transgenici o knockout che sono strategicamente inducibili in modo specifico per le cellule è in continua crescita nella comunità scientifica. Pertanto, l'esame della guarigione delle ferite pulpali e della rigenerazione riparativa della dentina in questi topi aiuterebbe notevolmente ad accelerare la nostra comprensione di questi processi a livello molecolare. Tuttavia, l'uso dei topi è notevolmente attenuato, poiché l'esecuzione di una procedura di incappucciamento della polpa su un dente di topo è tecnicamente impegnativa a causa delle sue dimensioni in miniatura. Qui, presentiamo il nostro metodo riproducibile di eseguire il capping diretto della polpa nei topi per la valutazione della guarigione delle ferite pulpali e la formazione riparativa della dentina in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I topi sono stati acquistati da Jackson Laboratory e conservati in un Vivarium priva di agenti patogeni e la Divisione di Medicina di Laboratorio UCLA animali (àlam). Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida istituzionali approvate dal comitato per la ricerca degli animali del Cancelliere (ARC # 2016-037).

1. mouse anestesia

  1. Utilizzare otto settimane di età femminile topi C57 / BL6 (n = 3).
  2. Anestetizzare i topi utilizzando soluzioni (5 mg / kg di peso del mouse) ketamina (80-120 mg / kg di peso del mouse) / xilazina e somministrare per via intraperitoneale (ip) alla dose di 10 ml / kg.
  3. Preparare ketamina (80 - 120 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) soluzioni e somministrarli via intraperitoneale (ip) alla dose di 10 ml / kg.
  4. Verificare che i topi sono completamente anestetizzati eseguendo un pinch punta.

2. Procedura Pulp-tappatura

  1. Posizionare il supporto bocca nella bocca del mouse.
  2. Fissare il supporto bocca sul tavolo in modo che l'haL'annuncio è rivolto verso l'alto.
  3. Posizionare il microscopio (10X) sulla parte superiore della bocca in modo che il primo molare superiore è completamente visibile.
  4. Uso del ¼-tutto fresa in un manipolo ad alta velocità a 200.000 rpm, rimuovere la parte smalto del dente nel mezzo finché la polpa è visibile attraverso la dentina trasparente. Non esporre la polpa con la fresa.
  5. Utilizzo di un K-file di endodonzia # 15 (diametro di 150 micron), forare attraverso la dentina ed esporre la polpa.
    NOTA: Particolare attenzione dovrebbe essere presa in modo che i detriti dentina non viene spinto nella polpa. Ciò può essere evitato ruotando il file K trimestrale e quindi tirando il K-FILE out.
  6. Mescolare MTA con H 2 O sterile secondo le istruzioni del produttore. Consegnare e posizionare il MTA sulla polpa esposta con la punta di un esploratore. Utilizzare il lato posteriore del cono di carta (fine) per imballare la MTA nella polpa esposta con lievi colpetti. Il lato più spesso del punto di carta sia piatta e quindi consenteper il corretto condensazione del MTA nella polpa esposta.
  7. Etch il dente per 15 s posizionando il mordenzante acido fosforico al 35% dove solo copre il dente. Fare particolare attenzione a limitare il posizionamento del mordenzante, in quanto può irritare i tessuti gengivali.
    NOTA: Il mordenzante viene in una siringa e viene utilizzato per irruvidire superfici dentali in modo che gli adesivi dentali possono fluire in mediare bonding micromeccanica sul dente. Poiché sono viscoso, può essere indipendente applicando piccole quantità direttamente sul dente.
  8. Utilizzare aspirazione negativo-pressione per rimuovere il mordenzante. Utilizzare un batuffolo di cotone che viene leggermente imbevuto con H 2 O per rimuovere i residui del mordenzante. Ripetere questa operazione fino a quando il mordenzante viene completamente rimosso dal dente.
  9. Utilizzando un panno di aria compressa, asciugare delicatamente il dente.
  10. Applicare gli adesivi dentali utilizzando retro della punta di carta.
  11. Rendere lo strato adesivo sottile con aria compressa per 3 s.
  12. Cure gli adesivi dentali per 20 s utilizzando l'unità di polimerizzazione-luce.
  13. Posizionare il composito fluido in piccole quantità sul dente che è stato ricoperto con MTA. Utilizzare la punta di un esploratore di fluire il composito nelle scanalature dei denti.
  14. Curare il composito per 30 s usando una unità fotopolimerizzabile per polimerizzare esso. Verificare che il composito è completamente guarito e duro con l'esploratore.

3. Post-op cura

  1. Somministrare Carprofen (5 mg / kg) per via sottocutanea (SC) immediatamente dopo la procedura pulp-capping.
  2. Mettere i topi su una piastra elettrica a bassa potenza per tenere gli animali al caldo prima che si svegliano.
  3. Riportare i topi per vivaio per l'edilizia abitativa.

4. Tissue Procurement

  1. Dopo 5 - 6 settimane eutanasia i topi mediante dislocazione cervicale in una condizione di anestesia completa con isoflurano.
  2. Rimuovere con attenzione il mascellare superiore fuori dalla base del cranio e metterlo in un tubo da 50 ml. Fissare il entire mascellare che contiene sia il dente pasta-livellata e dente uncapped controlaterale in 4% paraformaldeide in PBS, pH 7,4, a 4 ° C per una notte, e quindi memorizzare in una soluzione di etanolo al 70%.
    NOTA: Paraformaldeide è tossico e cancerogeno. L'uso corretto paraformaldeide deve essere monitorata come descritto nelle procedure operative standard (SOP).
  3. Eseguire la scansione del mascelle mouse utilizzando la scansione μCT. Per fissare il mascelle durante la scansione, avvolgere i campioni con una garza imbevuta con il 70% di etanolo e metterli nel tubo di coltura cellulare da 15 ml.

5. μCT Scansione

  1. Preparare i campioni per la scansione μCT. In breve, avvolgere i campioni con una garza imbevuta con il 70% di etanolo e fissarli in un generico coltura cellulare tubo conico da 15 ml. Montare il tubo sul palco scansione μCT, come indicato nelle istruzioni del produttore.
  2. Impostare la sorgente di raggi X per una corrente di 145 μA, una tensione di 55 kVp, e un tempo di esposizione di 200 ms.
  3. Eseguire acquisizione di immagini con lo scanner μCT con una risoluzione di 20 micron e con un filtro Al 0,5 mm.
  4. Ricostruire l'immagine e visualizzarla 11.
  5. Una volta che la scansione μCT, avviare la decalcificazione con 5% EDTA e 4% di saccarosio in PBS (pH 7,4) per 2 settimane.

6. Trattamento dei tessuti e la colorazione

  1. Incorporare i tessuti decalcificati in paraffina. Prima di embedding, tagliare mascellare effettuando un taglio sagittale immediatamente anteriore al primo molare. Mentre incorporamento, posizionare questa superficie verso il basso, in modo tale che la sezione longitudinale del primo molare è la superficie di taglio.
  2. Utilizzando il microtomo, preparare 5 scivoli micron di spessore. Le aree polpa-tappatura solito coincidono con la radice distopalatal (DP), che può essere utilizzato come punto di riferimento. Determinare l'area precisa di interesse esaminando l'istologia sotto il microscopio ottico e confrontando le immagini μCT.
  3. Per colorazione H & E, deparaffinize e reidratare i vetrini con xilene (2x) ed etanolo in serie diluito (100% EtOH 2x, il 95% EtOH 2x, e il 70% EtOH 1x).
  4. Sciacquare i vetrini con acqua corrente.
  5. Macchia con la soluzione ematossilina per 2,5 minuti e risciacquare con acqua di rubinetto.
  6. Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 1 min.
  7. Macchia con la soluzione Eosina per 1 minuto e sciacquare con acqua di rubinetto.
  8. Disidratare con etanolo serialmente diluito (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x, e il 100% EtOH 3x) e xilene (3x).
  9. Montare i vetrini con soluzione di montaggio.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, abbiamo dimostrato le procedure passo-passo per eseguire polpa di tappatura su topi denti. Uno degli aspetti chiave della polpa di tappatura nei topi è di avere l'apparato adeguato. A questo proposito, avendo il microscopio con un ingrandimento di potenza 10X è essenziale (Figura 1A). Per creare una preparazione di Classe-I-come nel dente, abbiamo utilizzato una fresa da ¼ di giro in un manipolo elettrico ad alta velocità a 200.000 giri al minuto (Figura 1B)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Attualmente, ci sono diversi modelli sperimentali differenti disponibili per convalidare gli effetti in vivo di materiali dentali, ponteggi, o fattori di crescita sulla differenziazione delle cellule staminali odontogena polpa dentale (DPSCs) 13. Questi modelli includono ectopica trapianto autologo di DPSCs in un organo, come la capsula renale, o il trapianto sottocutaneo di DPSCs in topi immunocompromessi con ponteggi 14,15. Tuttavia, questi metodi sono limitate dal fatto che il loro effe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato sostenuto da R01DE023348 (RHK) da NIDCR / NIH e la Research Grant Facoltà (RHK) dal Consiglio per la ricerca del Senato Accademico della divisione di Los Angeles della University of California.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Stereomicroscopio BM-LEDMEIJI TechnoMicroscope 
Optima MCX-LED Bien Air Dental1700588-001Motore elettrico a motore
isofluranoHenry schein salute animaleNDC 11695-0500-2
Fresa rotonda da 1/4Brasseler001092T0
Lima K endodonticaRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
Punto cartaHenry schein100-3941
Ultra-EtchUltradent prodotto Inc.Mordenzante all'acido fosforico
OptiBond SoloPlusKerr29669Adesivi
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115Unità di illuminazione polimerizzante
Tinta di caratterizzazioneBiscoT-14012Composito fluido
SkyscanBreuker1275uCT scanner
MicromThermoHM355SMicrotomo
Ematossilina-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16Soluzione di montaggio

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dye, B., Thornton-Evans, G., Li, X., Iafolla, T. Dental caries and tooth loss in adults in the United States, 2011-2012. NCHS Data Brief. (197), 197(2015).
  2. Bagramian, R. A., Garcia-Godoy, F., Volpe, A. R. The global increase in dental caries. A pending public health crisis. Am J Dent. 22 (1), 3-8 (2009).
  3. Koliniotou-Koumpia, E., Tziafas, D. Pulpal responses following direct pulp capping of healthy dog teeth with dentine adhesive systems. J Dent. 33 (8), 639-647 (2005).
  4. Tarim, B., Hafez, A. A., Cox, C. F. Pulpal response to a resin-modified glass-ionomer material on nonexposed and exposed monkey pulps. Quintessence Int. 29 (8), 535-542 (1998).
  5. Tziafa, C., Koliniotou-Koumpia, E., Papadimitriou, S., Tziafas, D. Dentinogenic responses after direct pulp capping of miniature swine teeth with Biodentine. J Endod. 40 (12), 1967-1971 (2014).
  6. Dammaschke, T., Stratmann, U., Fischer, R. J., Sagheri, D., Schafer, E. A histologic investigation of direct pulp capping in rodents with dentin adhesives and calcium hydroxide. Quintessence Int. 41 (4), 62-71 (2010).
  7. Jegat, N., Septier, D., Veis, A., Poliard, A., Goldberg, M. Short-term effects of amelogenin gene splice products A+4 and A-4 implanted in the exposed rat molar pulp. Head Face Med. 3, 40(2007).
  8. Paterson, R. C., Radford, J. R., Watts, A. The response of the rat molar pulp of two proprietary calcium hydroxide preparations. Br Dent J. 151 (6), 184-186 (1981).
  9. Sela, J., Ulmansky, M. Reaction of normal and inflamed dental pulp to Calxyl and zinc oxide and eugenol in rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 30 (3), 425-430 (1970).
  10. Maurice, C. G., Schour, I. Experimental cavity preparations in the molar of the rat. J Dent Res. 34 (3), 429-434 (1955).
  11. Skyscan, N. V. NRecon user manual. , Available from: http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf (2011).
  12. Sohn, S., et al. The Role of ORAI1 in the Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J Dent Res. 94 (11), 1560-1567 (2015).
  13. Kim, S., Shin, S. J., Song, Y., Kim, E. In Vivo Experiments with Dental Pulp Stem Cells for Pulp-Dentin Complex Regeneration. Mediators Inflamm. 2015, 409347(2015).
  14. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  15. Yu, J., et al. Odontogenic capability: bone marrow stromal stem cells versus dental pulp stem cells. Biol Cell. 99 (8), 465-474 (2007).
  16. Zhu, X., et al. Transplantation of dental pulp stem cells and platelet-rich plasma for pulp regeneration. J Endod. 38 (12), 1604-1609 (2012).
  17. Iohara, K., et al. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 83 (8), 590-595 (2004).
  18. Saito, K., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Osteopontin Is Essential for Type I Collagen Secretion in Reparative Dentin. J Dent Res. , (2016).
  19. Hunter, D. J., et al. Wnt Acts as a Pro-Survival Signal to Enhance Dentin Regeneration. J Bone Miner Res. , (2015).
  20. Goldberg, M., Kulkarni, A. B., Young, M., Boskey, A. Dentin: structure, composition and mineralization. Front Biosci (Elite Ed). 3, 711-735 (2011).
  21. Nascimento, A. B., Fontana, U. F., Teixeira, H. M., Costa, C. A. Biocompatibility of a resin-modified glass-ionomer cement applied as pulp capping in human teeth). Am J Dent. 13 (1), 28-34 (2000).
  22. Bogen, G., Kim, J. S., Bakland, L. K. Direct pulp capping with mineral trioxide aggregate: an observational study. J Am Dent Assoc. 139 (3), 305-315 (2008).
  23. Miller, R. A., Nadon, N. L. Principles of animal use for gerontological research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 55 (3), 117-123 (2000).
  24. Shah, A., Song, M., Cao, Y., Kang, M. K., Kim, R. H. Osteoclasts are absent in pulpal and periapical inflammatory lesions. J Dent Res. 95, 1503(2016).
  25. Williams, D. W., et al. Impaired bone resorption and woven bone formation are associated with development of osteonecrosis of the jaw-like lesions by bisphosphonate and anti-receptor activator of NF-kappaB ligand antibody in mice). Am J Pathol. 184 (11), 3084-3093 (2014).
  26. McPherson, J. D., et al. A physical map of the human genome. Nature. 409 (6822), 934-941 (2001).
  27. Gregory, S. G., et al. A physical map of the mouse genome. Nature. 418 (6899), 743-750 (2002).
  28. Hilton, T. J. Keys to clinical success with pulp capping: a review of the literature. Oper Dent. 34 (5), 615-625 (2009).
  29. Holmdahl, R., Bockermann, R., Backlund, J., Yamada, H. The molecular pathogenesis of collagen-induced arthritis in mice--a model for rheumatoid arthritis. Ageing Res Rev. 1 (1), 135-147 (2002).
  30. Kalu, D. N., Chen, C. Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption. J Bone Miner Res. 14 (4), 593-601 (1999).
  31. Yokochi, T. A new experimental murine model for lipopolysaccharide-mediated lethal shock with lung injury. Innate Immun. 18 (2), 364-370 (2012).
  32. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Direct Pulp cappingPulpal Wound HealingReparative Dentin FormationMouse ModelCavity PreparationMTA PlacementDental CompositeMicro CT ScanHistological AnalysisDMP1 Staining

Related Articles