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Summary

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Abstract

Le cellule che muoiono per apoptosi, di cui anche la morte delle cellule, come regolamentato, acquisire più nuove attività che consentono loro di influenzare la funzione di cellule vive adiacenti. attività vitali, come la sopravvivenza, la proliferazione, la crescita e la differenziazione, sono tra le molte funzioni cellulari modulati dalle cellule apoptotiche. La capacità di riconoscere e rispondere alle cellule apoptotiche sembra essere una caratteristica universale di tutte le cellule, indipendentemente stirpe o organo dell'origine. Tuttavia, la diversità e la complessità della risposta di cellule apoptotiche mandati che grande cura essere presa in sezionare gli eventi di segnalazione e percorsi responsabili per qualsiasi particolare risultato. In particolare, si deve distinguere tra le molteplici meccanismi con cui le cellule apoptotiche possono influenzare vie di segnalazione intracellulare nelle cellule responder vitali, tra cui: il riconoscimento mediata dal recettore della cellula apoptotica, rilascio di mediatori solubili dalla cellula apoptotica, e / o impegno della phagomacchinari cytic. Qui, forniamo un protocollo per identificare gli eventi di segnalazione intracellulare che sono indotti in cellule responder vitali a seguito della loro esposizione a cellule apoptotiche. Uno dei principali vantaggi del protocollo sta nella sua attenzione alla dissezione del meccanismo con cui le cellule apoptotiche modulano la segnalazione di eventi all'interno delle cellule che rispondono. Mentre il protocollo è specifico per una linea condizionale immortalate rene di topo prossimale cella tubolare (cellule BU.MPT), è facilmente adattabile alle linee di cellule che non sono di origine epiteliale e / o derivato da organi diversi dal rene. L'uso di cellule morte come stimolo introduce diversi fattori unici che possono ostacolare la rilevazione di eventi di segnalazione intracellulare. Questi problemi, così come le strategie per ridurre al minimo o evitare loro, sono discusse all'interno del protocollo. L'applicazione di questo protocollo dovrebbe aiutare la nostra conoscenza in espansione della grande influenza che le cellule morte o morenti esercitano sui loro vicini in tempo reale, sia in salute e in DiseaSE.

Introduction

L'apoptosi, o morte cellulare regolamentato ^1, contribuisce in modo essenziale al mantenimento e sviluppo dei tessuti. Visto più semplicemente, permette di apoptosi età, danneggiati, o le cellule in eccesso per essere eliminati senza danno ai tessuti circostanti ^2,3. Il contributo di apoptosi all'omeostasi del tessuto, tuttavia, è notevolmente più dinamica e variegata. Le cellule che muoiono per apoptosi acquisire molteplici nuove attività, sia secreta e cellulo-associati, che consentano loro di influenzare la funzione di cellule vive adiacenti ^4-10. Studi precedenti focalizzati sulla capacità delle cellule apoptotiche per sopprimere l'infiammazione ^11-16, ma le cellule apoptotiche anche modulano una vasta gamma di funzioni cellulari, tra cui tali attività vitali come la sopravvivenza ^4,9,10, la proliferazione ^4,9,10, differenziazione ^17, la migrazione ^18, e la crescita ^19. Inoltre, questi effetti non sono limitati a fagociti professionali, come macrofagis, ma si estendono a quasi tutti i tipi e le linee cellulari, comprese le cellule tradizionalmente non fagocitiche, come le cellule epiteliali ed endoteliali ^{7,9,10,18-21.}

La risposta specifica delle cellule vive adiacenti a seguito dell'esposizione ad apoptosi delle cellule dipende da molteplici fattori che riguardano sia le cellule che rispondono vitali e le cellule apoptotiche stessi. Ad esempio, nonostante l'esposizione a cellule apoptotiche inibisce la proliferazione di entrambi macrofagi murini e renali prossimali cellule epiteliali tubolari (PTECs), questi due tipi di cellule differiscono notevolmente nella loro risposta di sopravvivenza di cellule apoptotiche ^4,6,9,10. Apoptotico cellule favoriscono la sopravvivenza di macrofagi, ma inducono la morte apoptotica delle PTECs ^4,6,9,10. In particolare, la risposta di cellule apoptotiche può differire anche tra rispondendo cellule dello stesso lignaggio, a seconda degli organi della cellula risponde di origine ¹⁰ (ad esempio, PTECs renali rispetto epiteliali mammariecellule) o stato di attivazione ²² (ad esempio, neutrofili). Viceversa, le cellule apoptotiche possono evocare risposte differenti nella stessa cella a seconda della natura del apoptotico di stimolo ^10,23 o la fase di apoptosi ^10,14.

Data la diverseness e la complessità della risposta di cellule apoptotiche, grande cura deve essere presa in sezionare gli eventi di segnalazione e percorsi responsabili per qualsiasi particolare risultato. In primo luogo, le risposte che richiedono l'interazione fisica diretta tra cellule vitali e apoptosi devono essere differenziati da quelli ottenuti con mediatori solubili rilasciati o generate dal cellulare per apoptosi ^3,6-10. Se è richiesta l'interazione fisica, poi un ulteriore differenziazione deve essere eseguita. eventi di segnalazione possono dipendere riconoscimento mediata dal recettore della cellula apoptotica, indipendentemente successiva engulfment, o assorbimento fagocitaria, indipendente dal recettore specifico che lega la cellula apoptotica 3-7,9,10,19. In quest'ultimo caso, la risposta non è specifico per cellule apoptotiche, e può essere attivato da qualsiasi materiale fagocitaria ^4,6.

L'importanza di queste distinzioni può ancora essere apprezzato contrapponendo le risposte dei macrofagi e PTECs renali. Per entrambi i tipi di cellule, l'esposizione a cellule apoptotiche altera l'attività della chinasi pro-sopravvivenza Akt. La modulazione dipende interazione fisica, poiché la separazione di rispondere e cellule apoptotiche da una membrana di policarbonato 0,4 micron abolisce la risposta ^4,9,10,19. Tuttavia, la risposta di PTECs è mediata da recettori e indipendente fagocitosi, considerando che la risposta dei macrofagi è guidato da fagocitosi ^4,9,10,19. Questa conclusione è rafforzata dal fatto che l'esposizione a sfere di lattice, uno stimolo fagocitaria neutra, non ha alcun effetto sulle attività di Akt in PTECs, ma imita l'effetto di cellule apoptotiche nei macrofagi ^4,9.

"> Anche se meno ben studiato, le cellule che muoiono da necrosi, o morte cellulare accidentale ^1, modulano anche la funzione delle cellule vitali vicina ^3-10,19. Come le cellule apoptosi, le cellule necrotiche esercitano i loro effetti attraverso una varietà di meccanismi, in particolare la perdita dei contenuti intracellulari attraverso la loro rottura membrana cellulare ^3,5,6,9,24. Molte cellule, tra cui PTECs e macrofagi, possiedono recettori non concorrenti distinti per le cellule morte da necrosi ^5,9. impegno di questi recettori induce eventi di segnalazione che sono spesso opposti a quelli indotti mediante impegno dei recettori per le cellule apoptotiche ^4-10,19. ad esempio, in PTECs, cellule necrotiche aumentano fosforilazione di Akt, mentre le cellule apoptotiche diminuiscono fosforilazione ^9,10,19.

Qui, descriviamo un protocollo per identificare gli eventi di segnalazione intracellulare indotti in PTECs renali vitali attraverso il riconoscimento mediata dai recettori di PTECs apoptotici adiacenti <sup> 9,10,19. Mentre il protocollo è specifico per una linea cellulare PTEC condizionalmente immortalate noto come cellule BU.MPT ^{9,10,19,25,26,} è facilmente adattabile alle linee di cellule che non sono di origine epiteliale e / o derivato da organi diversi il rene. È importante sottolineare che l'uso di cellule apoptotiche come stimolo cella pone talune difficoltà inerenti sperimentali non presenti con ligandi solubili. Il più importante di questi è che le cellule apoptotiche devono essere aggiunti come sospensione piuttosto che come soluzione. Queste difficoltà, così come le strategie per ridurre al minimo o evitare loro, sono discusse all'interno del protocollo. Quasi tutte le tecniche descritte nel protocollo sono semplici e standard per coltura cellulare. Il vantaggio di questo protocollo sta nella sua attenzione alle molteplici meccanismi con cui le cellule apoptotiche modulano la trasduzione del segnale all'interno delle cellule che rispondono. Questi meccanismi comprendono l'associazione tramite i determinanti di superficie o colmare le molecole a specifici recettori sulla ricellule spondente, il rilascio di mediatori solubili e / o l'innesto della macchine fagocitaria. cellule necrotiche sono inclusi in tutti gli esperimenti per garantire che i risultati sono specifici per la modalità di morte cellulare, e non una risposta generalizzata cellule morte. Un approccio attento, come raccomandato in questo protocollo, è fondamentale per la nostra comprensione dell'influenza continua espansione che le cellule morenti esercitano sui loro vicini in tempo reale, sia in salute e malattia.

Protocol

1. preparati Nota: In questo protocollo, due o più linee cellulari o colture cellulari primarie, sono preparati in modo indipendente in condizioni specifiche. Queste preparazioni sono cellule in apoptosi (Protocollo 1), le cellule necrotiche (protocollo 2), e le cellule responder sani (protocollo 3). Dopo la preparazione indipendenti, cellule apoptotiche o necrotiche vengono aggiunti alle cellule responder e la trasduzione del segnale risultante viene monitorato (protocolli 4, 5 e 6). Preparare terreni di coltura e reagenti Preparare 500 ml di terreno di coltura A (per l'uso quando cresce cellule in condizioni permissive, vedi sezione 1.2), combinando il seguente: 1x Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 4,5 g / L di glucosio, 584 mg / L ʟ-glutammina, 110 mg / L di sodio piruvato, 100 unità / ml di penicillina-streptomicina, 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), e 10 unità / ml di interferone-γ (IFN-γ). Preparare 500 ml di terreno di coltura B (per l'uso when cellule siero-morire di fame in condizioni non permissive, vedi sezione 1.2) omettendo FBS e IFN-γ dalla ricetta di terreno di coltura A. Per crescere le cellule in condizioni non permissive (prima di siero-fame), aggiungere il 10% v / v FBS alla cultura medio B. Preparare 0,4% (v / v) paraformaldeide, pH 7,2, in tampone fosfato salino di 1x Dulbecco (DPBS) dal 4% paraformaldeide magazzino per il fissaggio di cellule morte. Nota: Paraformaldeide è tossico, e appropriato si deve usare cautela nel suo utilizzo. cellule BU.MPT Culture Scongelare da azoto liquido una fiala di cellule BU.MPT. Nota: BU.MPT è tubolare cellule epiteliali linea di topi renale prossimale (PTEC) derivata da un topo transgenico recante un (ts) mutazione termosensibile (tsA58) del grande antigene tumorale SV40 (TAG) sotto il controllo del mouse maggiore complesso di istocompatibilità (MHC) H-2K b classe I promotore 25,26. cellule piastra su polystyr sterileene plasma sottovuoto gas trattati piatti di coltura tissutale (~ 5 x 10 6 cellule per 100 piatto mm di diametro). Crescere le cellule in condizioni permissive in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera. Nota: le condizioni permissivi, che sono definiti come la cultura a 33-37 ° C in presenza di IFN-γ, consentono espressione stabile del transgene TAg tsA58-mutato. A differenza di colture primarie di topo PTEC renale, che non sopravvivono più di un singolo passaggio o due, BU.MPT coltivato in condizioni permissive possono essere diversi passaggi indefinitamente. Cellule Passage almeno tre volte dopo lo scongelamento prima di utilizzarli in un esperimento. Per le celle di passaggio, aggiungere 1 ml di 0,05% tripsina per ogni piatto 100 mm, e incubare in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera a 37 ° C per 5 minuti. Neutralizzare la tripsina con l'aggiunta di 10 ml di terreno A. Aspirare le cellule staccate, e dividere 1: 3 a 1: 5 in nuovi 100 mm TISS polistirene sterile plasma sottovuoto gas trattatopiatti della cultura dell'UE. Aggiungere mezzo A per portare il volume fino a un totale di 10 ml per piastra a 100 mm. In preparazione per uso sperimentale come rispondere cellule, crescere le cellule a confluenza in un umidificata al 5% (v / v) atmosfera di CO 2 in condizioni non permissive (cioè a 39 ° C in assenza di IFN-γ [media B contenente 10% v / v FBS]). Nota: In condizioni non permissive, espressione del transgene TAg tsA58-mutato è inibita da> 95%, e le cellule si comportano come BU.MPT colture primarie di PTEC di rene di topo. 2. Preparazione di cellule apoptotiche BU.MPT (protocollo 1) Nota: Questo protocollo è specifico per le cellule BU.MPT come fonte di cellule apoptotiche e staurosporine come metodo di induzione di apoptosi. In alternativa, un'altra linea cellulare, o colture primarie, possono essere utilizzati come fonte di cellule apoptotiche, con l'apoptosi indotta da protoco standardizzatals per quel particolare tipo di cellula e metodo di induzione di apoptosi. Dopo il passaggio sul diametro di 100 mm polistirene sterile plasma sottovuoto gas trattati piastre di coltura tissutale, crescono le cellule BU.MPT a confluenza in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera in condizioni permissive (cioè a 37 ° C in terreno di coltura A a 10 ml per piatto 100 mm), come descritto nella sezione 1.2.3. Risciacquare il monostrato cellulare aderente tre volte con mezzo di coltura B, utilizzando 10 ml per risciacquo. Indurre apoptosi incubando le cellule nel mezzo di coltura B contenenti staurosporine, un inibitore della proteina chinasi non selettivo, a 1 mg / ml per 3 h in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 atmosfera a 37 ° C. Aspirare il mezzo di staurosporine contenente contenente "galleggianti" apoptosi delle cellule che si sono staccati dalla monostrato. Centrifugare questo mezzo per 10 min a 500 xg, scartare il surnatante, il pellet lavare tre volte con mezzo di coltura B, eaggiungere il pellet torna a cellule raccolte nel passaggio successivo, 2.5. Staccare i restanti cellule aderenti da passi 2.3 e 2.4 con l'aggiunta di 5 mm (acido etilendiamminotetraacetico) EDTA in 1x Ca 2 + – e Mg 2 + -free DPBS a 1 ml per piatto per 5 min. Aspirare il mezzo di EDTA contenente contenente cellule apoptotiche staccate, e in comune le cellule staccate con i "galleggianti" apoptosi delle cellule dal punto 2.4 in una sterile 15 ml provetta di polistirene centrifuga. Lavare le cellule apoptotiche tre volte mediante centrifugazione per 10 min a 500 xg e risospensione in 10 ml di 1x Ca + 2 – e Mg + 2 senza glutine DPBS a lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere le cellule apoptotiche in fresco terreno di coltura B a ~ 5 x 10 6 cellule per mL prima dell'uso per stimolare le cellule responder. In alternativa, fissare cellule apoptotiche lavata in 0,4% (v / v) in paraformaldeide 1x DPBS per 30 minuti, e poi lavare tre volte con culturamedio B, prima della sospensione nel terreno di coltura B. Se del caso, confermare l'induzione di apoptosi in citometria a flusso utilizzando una preparazione separata di cellule apoptotiche (o riservando alcune celle per questo scopo), come descritto in precedenza 6,9,10,15. Nota: I primi apoptosi delle cellule hanno le membrane delle cellule intatte, e appaiono come ioduro di propidio (PI), le cellule -negative e annessina V-positivo di diminuzione dimensione della cella (rispetto a cellule vitali). Tardo apoptosi delle cellule hanno le membrane cellulari non intatte, e appaiono come cellule PI-positivi e annessina V-positivo di diminuzione dimensione della cella. Utilizzando il protocollo attuale, preparazioni tipiche contengono ~ 85% apoptotico precoce e ~ 15% di cellule fine apoptotici. Aggiungere cellule apoptotiche al BU.MPT cellule responder (Protocollo 3) in un rapporto apoptotico-to-responder cellule di 1: 1, direttamente o dopo fissazione di cellule apoptotiche per 30 minuti con 0,4% (v / v) in paraformaldeide 1x DPBS . Nota: la fissazione per apoptosi prima della stimolazione dei responders dovrebbenon influenzare i risultati, a meno che gli eventi di segnalazione osservati sono dovuti al rilascio di un mediatore solubile (Tabella 1). 3. Preparazione di cellule necrotiche BU.MPT (protocollo 2) Nota: Questo protocollo è specifico per le cellule BU.MPT come fonte di cellule necrotiche, e riscaldamento come metodo dell'induzione necrosi. In alternativa, un'altra linea cellulare, o colture primarie, possono essere utilizzati come fonte di cellule necrotiche, con necrosi indotta da protocolli standardizzati per quel particolare tipo di cellula e metodo di induzione necrosi. Dopo il passaggio sul diametro di 100 mm polistirene sterile plasma sottovuoto gas trattati piastre di coltura tissutale, crescono le cellule BU.MPT a confluenza in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera in condizioni permissive (cioè a 37 ° C in terreno di coltura A a 10 ml per piatto), come descritto nella sezione 1.2.3. Risciacquare il monostrato cellulare aderente tre volte con terreno di coltura B, utilizzando10 ml per risciacquare. Staccare le cellule con l'aggiunta di 5 mM EDTA a 1x Ca + 2 – e Mg + 2 senza glutine DPBS a 1 ml per piatto per 5 min. Aspirare il mezzo di EDTA contenente contenente cellule indipendenti, e aggiungere la sospensione cellulare ad una sterile 15 ml provetta di polistirene centrifuga. Lavare le cellule tre volte mediante centrifugazione per 10 min a 500 xg e risospensione in 10 ml di Ca + 2 – e Mg + 2 senza glutine DPBS a lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere le cellule in coltura fresco medio B a ~ 5 x 10 6 cellule per ml. Indurre necrosi riscaldando le cellule a 70 ° C per 45 minuti in un bagno d'acqua, delicatamente vortex la sospensione cellulare ogni 10 min. Incubare le cellule per 2 h in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 atmosfera a 37 ° C. Delicatamente vortice la sospensione cellulare ogni 15 min. Se del caso, confermare l'induzione di necrosi mediante citometria a flusso utilizzando una preparazione separata di Necellule crotic (o riservando alcune cellule per questo scopo), come precedentemente descritto 6,9,10,15. Nota: le cellule necrotiche sono rotto le membrane cellulari, e appaiono come cellule PI-positivo di una maggiore dimensione della cella (relativi a cellule vitali). Utilizzando il protocollo attuale, preparazioni tipiche contengono ≥ 95% delle cellule necrotiche. In alternativa, l'induzione di necrosi e perdita di integrità della membrana può essere confermata da Trypan blu colorazione. 4. Preparazione di cellule BU.MPT risponditore (protocollo 3) Nota: Questo protocollo è specifico per le cellule BU.MPT come fonte di cellule responder. In alternativa, un'altra linea cellulare, o colture primarie, possono essere utilizzate come cellule responder. Prima di uso sperimentale, quiescenza può essere indotta durante la notte dai protocolli standardizzati all'interno del laboratorio. Crescere le cellule BU.MPT a 100 mm piatti di coltura di tessuti sterili in condizioni permissive in terreno di coltura A a 10 ml per piatto fino a raggiungere ~85% di confluenza. cultura Aspirare media A, e lavare le cellule tre volte con terreno di coltura B a 10 ml per risciacquo. Serum-fame le cellule durante la notte per 18 a 24 h in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera in condizioni non permissive (cioè a 39 ° C in terreno di coltura B a 10 ml per piastra), come descritto nella sezione 1.2 .4, per indurre quiescenza. In alternativa, far crescere le cellule in terreno di coltura B più il 10% (v / v) di FBS a 39 ° C per un giorno prima di morire di fame le cellule siero durante la notte in terreno di coltura B senza FBS. Etichettare un piatto di coltura di tessuti separata di cellule confluenti BU.MPT per ogni condizione sperimentale. Includere i seguenti sei condizioni: la stimolazione dei responder BU.MPT vitali con fattore sia veicolo o epidermico di crescita (EGF) per 15 minuti, a seguito della loro esposizione per 30 minuti per entrambi non le cellule, le cellule apoptotiche, o cellule necrotiche. Nota: L'esposizione a cellule morte può stimolare o inibire il livello di attività di un giVen molecola di segnalazione. La stimolazione è più rilevata sopra un basso basale (ad esempio, assenza di EGF), che è meglio rilevato inibizione da un alto basale (ad esempio, presenza di EGF). Poiché l'effetto della stimolazione con le cellule morte è a priori sconosciuta, si raccomanda di effettuare tutti gli studi sia in assenza e presenza di EGF. 5. stimolazione delle cellule risponditore con apoptosi e cellule necrotiche (protocollo 4) Aspirare terreno di coltura B dai piatti pre-etichettati di riposo (siero-fame) BU.MPT cellule responder (Protocol 3). Nota: Dopo la cultura durante la notte in condizioni non permissive, le cellule BU.MPT dovrebbe comportarsi come colture primarie di PTEC di rene di topo. Per piatto 100 mm, aggiungere 2 ml di uno dei seguenti: terreno di coltura B (non le cellule); sospensione cellulare per apoptosi a ~ 5 x 10 6 cellule per ml in terreno di coltura B (Protocollo 1); o sospensione cellulare necrotico ~ 5 x 10 6 cellule per ml in terreno di coltura B (protocollo 2). Distribuire la sospensione 2 mL di cellule morte uniformemente sul piatto 100 mm, e mantenere il tempo per loro di depositarsi minimo. Per raggiungere questo obiettivo, distribuire il drop dead sospensione cellulare a goccia ad un'ampia pipetta punta su tutta la superficie dei piatti cellule responder. Utilizzare un volume di 2 ml come compromesso tra minimizzando il tempo di assestamento ed evitando la formazione di grumi di cellule morte. Nota: L'uso di una sospensione di cellule morte come stimolo comporta una serie di considerazioni particolari, descritte di seguito in maggior dettaglio (Tabella 2 e Discussione). Ottenere un rapporto cellulare dead-to-responder di ~ 1: 1 con l'aggiunta di 2 ml di cellule morte a ~ 5 x 10 6 cellule per ml in un piatto mm confluenti 100, che contiene ~ 10 x 10 6 cellule. In alternativa, al fine di stabilire la dose dipendenza di eventi di segnalazione osservati, variare il rapporto di morti cellule responder continuo mediante diluizione progressiva cultoure medio B delle sospensioni di cellule morte preparati in protocolli 1 e 2. Mescolare delicatamente i piatti, poi incubare a 37 ° C in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera. Dopo 30 min, stimolare le cellule responder sia con veicolo o 50 nM EGF, secondo la pre-etichettatura del piatto cultura. Incubare per 15 minuti a 37 ° C in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera. Lavare via le cellule morte con l'aggiunta di 5 ml di ghiacciata 1x DPBS, agitando il piatto, e aspirando il liquido di lavaggio. Ripetete tre volte. Subito posizionare i piatti cellule responder in ghiaccio per ulteriori elaborazioni. Preparare lisati cellulari Preparare tampone di lisi cellulare contenente le seguenti: 1 × Tris tamponata salina (TBS), 10 mM di sodio pirofosfato, 0.5% w / v desossicolato, 0,1% w / v SDS, 10% glicerolo, e fluoruro di sodio 25 mM. Immediatamente prima di lisi cellulare, aggiungere la seguente nell'esatto ordine dato al indLe concentrazioni icated: mini senza EDTA inibitore della proteasi cocktail (1 compressa ogni 10 ml di tampone di lisi), 10% (v / v) Triton X-100, 1 mM ditiotreitolo (DTT), 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), e 10 mM orthovanadate di sodio. Aggiungere 700 ml di tampone di lisi cellulare ghiacciata ogni 100 mm piatto di cellule responder appena stimolate su ghiaccio a partire dal punto 5.7. Raschiare le cellule con un raschietto cellulare e trasferire il lisato di pre-raffreddata 1,5 microtubi mL. Mantenere i tubi in ghiaccio per 15 min. lisati Sonicare su ghiaccio con 10 impulsi di 20 Hz, meno di un secondo ogni durata. Evitare la creazione di schiuma all'interfaccia gas / liquido, in quanto questo può surriscaldare i campioni. Completamente immergere la sonda sonicatore nelle microprovette contenenti lisati prima di accendere il sonicatore, e passare il sonicatore prima di rimuovere la sonda dai lisati. Centrifugare a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C, trasferire il surnatante in microtubi fresco pre-raffreddata, E conservare a -70 ° C. Eseguire gel elettroforesi e immunoblotting su supernatanti di lisati, come precedentemente descritto 6,9,10,15. 6. Prevenire diretto contatto fisico tra Target e responder Utilizzando un semipermeabile in policarbonato a membrana (protocollo 5) Preparare le cellule responder BU.MPT secondo il protocollo 3, con una sola eccezione; crescere le cellule in coltura tissutale polistirene sterili trattati cluster da 12 pozzetti. In pozzetti selezionati, posizionare un sistema di supporto permeabile contenente una membrana di policarbonato 0,4 micron per impedire l'interazione fisica tra le cellule morte e responder. Include pozzetti di controllo senza membrana nello stesso esperimento. Aspirare terreno di coltura B da pozzi sperimentali di cellule BU.MPT responder siero-fame. Seguire protocollo 4 per la stimolazione delle cellule responder con cellule apoptotiche o necrotiche, con le seguenti modifiche: Per ben del 12-bene cluster, aggiungere 0,1 mL di uno dei seguenti: terreno di coltura B (non le cellule); sospensione cellulare per apoptosi a ~ 5 x 10 6 cellule per ml in terreno di coltura B (Protocollo 1); o sospensione cellulare necrotico al ~ 5 x 10 6 cellule per ml in terreno di coltura B (protocollo 2). Nota: Come ben confluenti di un cluster 12 pozzetti contiene ~ 0,5 x 10 6 cellule, l'aggiunta di 0,1 ml di cellule morte a ~ 5 x 10 6 cellule per ml produce un rapporto cellulare-to-responder morta di ~ 1: 1. Per pozzetti contenenti il ​​sistema di supporto permeabile, aggiungere le cellule morte in cima alla membrana di policarbonato 0,4 micron all'interno del sistema di supporto permeabile, quindi non c'è interazione fisica diretta tra cellule morte e responder. 7. L'inibizione della fagocitosi con Citocalasina D (Protocollo 6) Preparare le cellule responder BU.MPT secondo il protocollo 3. Preparare il citoscheletro inibitore citocalasina D in Dimethyl solfossido (DMSO) a 4 mg / ml (1.000 ×). Aggiungere i piatti pre-etichettati delle cellule responder BU.MPT o 10 ml di veicolo (DMSO) o 10 ml di citocalasina D per ottenere una concentrazione finale di 4 mg / ml a 10 ml di terreno di coltura B. Nota: A questa concentrazione di citocalasina D, la fagocitosi da parte delle cellule BU.MPT e una linea cellulare di macrofagi è stata inibita da ≥90% 9,10. Incubare per 2 ore a 37 ° C in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera. Seguire protocollo 4 per la stimolazione delle cellule responder con cellule apoptotiche o necrotiche. Se del caso, confermare l'inibizione della fagocitosi delle cellule morte mediante citometria di flusso utilizzando una preparazione separata di cellule morte e responder (o celle riservate a questo scopo), come descritto in precedenza 9,10.

Representative Results

Nella figura 1, forniamo uno schema che descrive i tempi e le critiche passaggi necessari per la preparazione di cellule apoptotiche (Protocollo 1) e le cellule necrotiche (protocollo 2) e la stimolazione delle cellule responder con sospensioni di cellule apoptotiche e necrotiche (protocollo 4). Nella figura 2, forniamo risultati rappresentativi che mostrano l'effetto delle cellule apoptot…

Discussion

Forniamo qui un protocollo per caratterizzare gli eventi di segnalazione intracellulare indotte nelle cellule vitali a seguito della loro esposizione alle cellule in fase di apoptosi, o altre forme di morte cellulare. Il protocollo sottolinea i molteplici meccanismi attraverso i quali l'esposizione a cellule apoptotiche possono modulare vie di segnalazione intracellulare all'interno delle cellule responder vitali. Questi meccanismi sono: l'interazione (tramite ponte molecole o fattori determinanti della supe…

Materials

Cell culture materials
DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate	Mediatech (Manassas, VA)	10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum	GE Healthcare (Logan, UT)	SH30066.03	add 10% (v/v)  to the culture medium A
Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X	Life Technologies (Grand Island, NY)	10378-016	add 100 units/mL to the culture media A and B
γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli	Calbiochem, Millipore (Billerica, MA)	407303	add 10 units/mL to the culture medium A
Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic	Corning (Durham, NC)	353003	sterile, 100 mm diameter
Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom	Corning (Durham, NC)	352095	sterile, 15 mL
Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco	Fisher (Waltham, MA)	25300062	sterile, 100 mL
Name	Company	Catalog	Comments
Chemicals and inhibitors
Staurosporine, from Streptomyces sp.	Sigma (St. Louis, MO)	S4400	use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis
Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml]	Millipore (Billerica, MA)	EA140	use at 50 nM to stimulate responder cells
UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0	Life Technologies (Grand Island, NY)	15575-038	use 5 mM to detach adherent cells
Trypan blue solution, 0.4%	MP Biomedicals (Santa Ana, CA)	91691049	for dead cells staining
Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS	Affymetrix (Santa Clara, CA)	19943	use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco	Life Technologies (Grand Island, NY)	14040133	stock solution
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco	Life Technologies (Grand Island, NY)	14190367	stock solution
Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii	Sigma (St. Louis, MO)	C8273	use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma (St. Louis, MO)	D2650	solvent for cytochalasin D
Name	Company	Catalog	Comments
Cell lysis buffer ingredients
Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4	BioRad (Hercules, CA)	1706435	for cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	221368	10 mM for cell lysis buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	D6750	0.5% w/v for cell lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	L3771	0.1% w/v for cell lysis buffer
Glycerol	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	G5516	10% for cell lysis buffer
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	450022	25 mM for cell lysis buffer
Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet	Roche Diagnostics (Indianapolis, IN)	4693159001	for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer
Triton X-100	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	T8787	10% for cell lysis buffer
Dithiothreitol (DTT)	MP Biomedicals (Santa Ana, CA)	11DTT00005	1 mM for cell lysis buffer
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	MP Biomedicals (Santa Ana, CA)	4800263	1 mM for cell lysis buffer
Sodium orthovandate	MP Biomedicals (Santa Ana, CA)	2159664	10 mM for cell lysis buffer
Name	Company	Catalog	Comments
Equipment
Sorvall T6000B centrifuge	Du Pont (Wilmington, DE)	T6000B
Fisher Tissuemat, water bath	Fisher (Waltham, MA)
Sonic Dismembrator (sonicator), model 100	Fisher (Waltham, MA)
Miscellaneous
Cell counting chamber, Neubauer	Hawksley (Lancing, Sussex, UK)	AC2000
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II	Millipore (Billerica, MA)	CBA059	for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis
Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	T9661
Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane	Corning (Corning, NY)	3413	sterile, polystyrene, tissue culture treated
Name	Company	Catalog	Comments
Antibodies
Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody	Cell Signaling Technology	9331	rabbit polyclonal antibody
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) )	Cell Signaling Technology	2118	rabbit monoclonal antibody