Utilizzando cristallografia a raggi X, Biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule T del recettore Riconoscimento di cancro antigeni

Sommario

Qui, descriviamo i metodi che comunemente impieghiamo in laboratorio per determinare come la natura dell'interazione tra il recettore delle cellule T e gli antigeni tumorali, presentati dagli antigeni dei leucociti umani, governa la funzionalità delle cellule T; questi metodi includono la produzione di proteine, la cristallografia a raggi X, la biofisica e gli esperimenti funzionali sulle cellule T.

Abstract

I linfociti T citotossici CD8+ umani (CTL) sono noti per svolgere un ruolo importante nel controllo dei tumori. Per svolgere questa funzione, il recettore delle cellule T (TCR) espresso sulla superficie cellulare deve riconoscere funzionalmente i peptidi derivati dal tumore (pHLA) ristretti dall'antigene leucocitario umano (HLA). Tuttavia, noi e altri abbiamo dimostrato che la maggior parte dei TCR si lega in modo sub-ottimale agli antigeni tumorali. Scoprire i meccanismi molecolari che definiscono questo scarso riconoscimento potrebbe aiutare nello sviluppo di nuove terapie mirate che aggirano queste carenze. In effetti, le terapie attuali che mancano di questa comprensione molecolare non sono state universalmente efficaci. Qui, descriviamo i metodi che comunemente impieghiamo in laboratorio per determinare come la natura dell'interazione tra TCR e pHLA governi la funzionalità delle cellule T. Questi metodi includono la generazione di TCR solubili e pHLA e l'uso di questi reagenti per la cristallografia a raggi X, l'analisi biofisica e la colorazione delle cellule T antigene-specifiche con multimeri pHLA. Utilizzando questi approcci e guidati dall'analisi strutturale, è possibile modificare l'interazione tra TCR e pHLA e quindi testare come queste modifiche influiscono sul riconoscimento dell'antigene delle cellule T. Questi risultati hanno già contribuito a chiarire il meccanismo di riconoscimento delle cellule T di un certo numero di antigeni tumorali e potrebbero indirizzare lo sviluppo di peptidi alterati e TCR modificati per nuove terapie antitumorali.

Introduzione

Cristallografia a raggi X è stata e continuerà ad essere, una tecnica estremamente potente per comprendere la natura delle interazioni ligando-recettore. Visualizzando queste interazioni in dettaglio atomico, non solo è possibile divulgare i meccanismi molecolari che regolano molti processi biologici, ma è anche possibile modificare direttamente interfacce contatti beneficio terapeutico. Accoppiato con tecniche come la risonanza plasmonica di superficie e Calorimetria isotermica di titolazione (solo per citarne un paio), tali modifiche possono poi essere analizzati biofisico, per valutare l'impatto diretto sulla affinità di legame, cinetiche di interazione, e la termodinamica. Infine, effettuando esperimenti funzionali in tipi di cellule interessate, un quadro dettagliato dell'impatto molecolare e funzionale delle modifiche alle interazioni recettore-ligando possono essere raccolte, fornendo informazioni molto specifiche meccanicistico. In generale, questi tipi di metodi forniscono un'immagine atomico risoluzione permettendo scoraggiare minazione di come i sistemi biologici lavorare, con implicazioni connesse per i progressi diagnostici e terapeutici.

Il nostro laboratorio utilizza abitualmente queste tecniche per studiare i recettori che mediano l'immunità umana a cellule T agli agenti patogeni e tumori, in autoimmunità, e durante il trapianto. Qui, ci concentriamo sulla risposta delle cellule T CD8 ⁺ umani al cancro, mediato da una interazione tra il recettore delle cellule T (TCR) e antigene leucocitario umano (HLA) peptidi tumorali derivate -restricted (Phla). Questo è importante perché, anche se le cellule T CD8 ⁺ sono in grado di indirizzare le cellule tumorali, noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che TCR anti-cancro subottimale si legano alla loro Phla cognate ^{1, 2.} Così, molti laboratori hanno tentato di alterare sia il TCR ^{3, 4, 5} o il ligando peptide ^6,class = "xref"> ^{7, 8} per aumentare l'immunogenicità e per meglio cellule tumorali bersaglio. Tuttavia, questi approcci non sono sempre efficaci e possono avere gravi effetti collaterali, tra cui fuori bersaglio tossicità ^{4, 9, 10.} Ulteriori ricerche esplorando i meccanismi molecolari che regolano il riconoscimento delle cellule T di antigeni tumorali sarà fondamentale per superare queste carenze.

Nel presente studio, ci siamo concentrati sulle risposte contro le cellule di melanoma autologhe da cellule T CD8 ⁺ specifiche per un frammento dell'antigene differenziazione dei melanociti glicoproteina 100 (gp100), gp100 _280-288, presentati da HLA-A * 0201 (il più comunemente -expressed classe Phla umana I). Questo antigene è stato un obiettivo ampiamente studiato per il melanoma immunoterapia ed è stato sviluppato come un cosiddetto peptide "eterocliti" in cui una valina sostituisce alaninain posizione di ancoraggio 9 per migliorare la stabilità Phla ^11. Questo approccio è stato utilizzato per migliorare l'induzione di CTL melanoma-reattiva in vitro ed è stato usato con successo in studi clinici ^12. Tuttavia, modifiche ai residui peptidici possono avere effetti imprevedibili sulla specificità delle cellule T, dimostra la scarsa efficacia della maggior parte dei peptidi heterolitic nella clinica ^{6, 13.} Infatti, un'altra forma eterocliti di gp100 _280-288, in cui i residui del peptide Glu3 sostituito da Ala, abrogata riconoscimento da parte di una popolazione policlonale di GP100 _280-288 cellule T specifico ^{d'14, 15.} Abbiamo precedentemente dimostrato che anche piccoli cambiamenti nei residui del peptide di ancoraggio possono alterare in modo sostanziale il riconoscimento delle cellule T in modo imprevedibile ^{6, 16.} Pertanto, lo studio ha analizzato costruireing un quadro più dettagliato di come le cellule T CD8 ⁺ riconoscono GP100 e come modifiche dell'interazione tra TCR e Phla potrebbe avere un impatto tale funzione.

Qui, abbiamo generato, forme solubili altamente pure di due TCR specifici per gp100 _280-288 presentati da HLA-A * 0201 (A2-YLE), nonché le forme naturali e alterati di Phla. Questi reagenti sono stati utilizzati per generare cristalli di proteine ​​per risolvere la struttura atomica ternaria di un TCR umana in complesso con forma eterocliti di A2-YLE, nonché due dei pHLAs mutanti in forma unligated. Abbiamo poi utilizzato un approccio di scansione peptide per dimostrare l'impatto delle sostituzioni peptidici il TCR eseguendo approfondita esperimenti biofisici. Infine, abbiamo generato una linea di cellule T CD8 + geneticamente modificati, ri-programmati per esprimere uno dei TCR specifici A2-YLE-, per eseguire esperimenti funzionali per testare l'impatto biologico delle varie modifiche peptidici. Questi dati dimostrano che anche Modìfiche di peptide residui che si trovano al di fuori del motivo di legame TCR può avere imprevedibili effetti a catena sui residui peptidici adiacenti che abrogare vincolante TCR e il riconoscimento delle cellule T. I nostri risultati rappresentano il primo esempio dei meccanismi strutturali sottostanti riconoscimento cellule T di questo importante obiettivo terapeutico per il melanoma.

Protocollo

1. Protein Expression

1. Realizzare costrutti genici per la generazione di TCR solubili e pHLAs, come descritto in dettaglio in precedenza ^{17, 18.} Progettare ciascuna costruzione con un 5 'BamH1 e 3' sito EcoR1 di restrizione per l'inserimento nel vettore pGMT7.
2. Transform coli Rosetta (DE3) pLysS E. con un vettore plasmidico pGMT7 derivato contenente la sequenza codificante la proteina di interesse incubando 1 ml di 50-200 ng / ml plasmide con 5 ml di E.coli per 5 minuti a 4 ° C , 2 min a 42 ° C e 5 min a 4 ° C, e la piastra durante la notte a 37 ° C su una piastra di agar LB supplementato con 50 mg / L carbenicillina.
3. Raccogliere singole colonie e crescere a 37 ° C e 220 rpm in 30 mL di TYP mezzi (16 g / L di triptone, 16 g / estratto di lievito L, e 5 g / L HK ₂ O ₄₎ integrato con 100 pM carbenicillina fino sospensione raggiunge un de otticansity (OD ₆₀₀₎ compreso tra 0,4 e 0,6.
4. Indurre la produzione di proteine ​​in un mL un'aliquota 5 con l'introduzione di 0,5 mm isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) per 3 ore. Mantenere 20 ml di sospensione con e senza induzione di elettroforesi gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE) analisi e macchiare il gel.
5. Aggiungere colture starter a 1 L di TYP supplementato con 100 pM carbenicillina e crescere cellule come sopra descritto al punto 1.3 fino alla sospensione raggiunge un OD ₆₀₀ tra 0,4 e 0,6.
6. Indurre l'espressione di proteine ​​per 3 ore con 0,5 mM IPTG. Centrifugare le cellule per 20 min a 3000 xg e versare con cautela il surnatante.
7. Sciogliere il pellet in 40 ml di tampone di lisi (10 mM Tris, pH 8,1; 10 mM cloruro di magnesio, MgCl _2; 150 mM NaCl e 10% glicerolo), ultrasuoni in ghiaccio per potere 30 min a 60% utilizzando un 2 s intervallo , e incubare a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti con 0,1 g / L DNasi.
8. Trattare il suspensione contenente le proteine ​​in forma di corpi di inclusione (IB) con 100 ml di tampone di lavaggio (0,5% Triton X-100; 50 mM Tris, pH 8,1, 100 mM NaCl e 10 mM EDTA).
9. Centrifugare il campione per 20 minuti a 4 ° C e 8.000 xg e versare cautamente il surnatante. Risospendere il pellet in 100 ml di tampone risospensione (50 mM Tris, pH 8,1, 100 mM NaCl, e 10 mM EDTA, pH 8.1), centrifugare come prima a 8.000 xg, e versare con cautela il surnatante.
10. Infine, sciogliere il precipitato in 10 ml di tampone guanidina (6 M guanidina; 50 mM Tris, pH 8,1, 2 mM EDTA, pH 8,1 e 100 mM NaCl) e misurare la concentrazione di proteine ​​a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro.

2. Phla e TCR ripiegamento

1. Per i ripiega Phla, miscelare 30 mg di HLA-A2 (o HLA-A2 con un tag biotina) IBs, 30 mg di β2m IBs e 4 mg di peptide per 30 minuti a 37 ° C in un bagno d'acqua in un volume finale 6 mL di tampone guanidina integrato con 10 mM ditiotreitolo(DIGITALE TERRESTRE).
2. Avviare ripiegamento proteico diluendo la miscela precedente in 1 L di tampone HLA ripiegare pre-raffreddata (50 mM Tris, pH 8,1, 400 mM L-arginina, 2 mM EDTA, pH 8,1, 6 mM cisteamina e 4 mM cistamina).
3. Lasciare l'HLA ripiegare agitazione a 4 ° C per 3 ore e poi trasferisce in un kDa MWCO 12,4 (peso molecolare cut-off) tubo di dialisi e Dializzare due volte per 24 ore contro 20 L di 10 mM Tris, pH 8,1.
4. Per i ripiega TCR, miscelare 30 mg di TCR catena α IBS e 30 mg di TCR catena β IBs per 30 minuti a 37 ° C in un bagno d'acqua in 6 mL di tampone guanidina supplementato con 10 mM DTT.
5. Avviare ripiegamento proteico diluendo la miscela denaturato TCR in 1 L di tampone pre-raffreddata TCR ripiegare (50 mM Tris, pH 8,1; 2,5 M urea, 2 mM EDTA, pH 8,1, 6 mM cisteamina e 4 mM cistamina) per 3 h.
6. Trasferire il ripiegare in un tubo di dialisi 12,4 kDa MWCO e dializzare due volte per 24 ore contro 20 L di 10 mM Tris, pH 8,1.
7. Filtrare sia il Phla o TCR refolds usando un filtro a membrana da 0,45 micron per le fasi di purificazione.

3. Purificazione da Fast Protein cromatografia liquida (FPLC)

1. Caricare la preparazione refold filtrato (sia Phla o TCR) su un 7,9 mL, 50 um anionico colonna di resina a scambio pre-equilibrata con 20 ml di 10 mM Tris, pH 8.1 su un sistema di cromatografia flessibile ed intuitiva.
2. Eluire la proteina a 5 mL / min con un gradiente salino (0-500 mM NaCl in 10 mM Tris, pH 8,1, su 8 volumi di colonna) e raccogliere frazioni da 1 ml.
3. Analizzare le frazioni corrispondenti alla proteina di interesse mediante SDS-PAGE, raggruppare le frazioni contenenti la proteina di interesse insieme, e concentrarli fino a 500 microlitri con 10-kDa MWCO 20 o 10 kDa MWCO 4 mediante centrifugazione per 20 minuti a 4000 xg , scartando il flusso passante.
4. Caricare i preparati proteici concentrati in un mL ciclo 2 iniezione su una colonna di cromatografia di esclusione 24 dimensione mL pre-equilibrata con l'applicazioneBuffer ropriate eluizione: tampone fosfato salino (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM NaCl; 3,4 mM EDTA, e 0,005% di tensioattivo), o buffer di cristallo (10 mM Tris, pH 8,1, e 10 mM NaCl ).
5. Eluire proteine ​​ad una portata di 0,5 ml / min oltre 1 colonna Volume; raccogliere 1 frazioni mL contenenti la proteina di interesse verificato per SDS-PAGE.
   NOTA: Questi metodi sono stati utilizzati per generare solubili PMEL17 TCR e GP100 TCR, così come tutti i pHLAs utilizzati in questo studio: HLA-A * 0201 con YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), o YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).

4. risonanza plasmonica di superficie (SPR) Analisi

1. Eseguire analisi dell'equilibrio vincolante o analisi termodinamica utilizzando un sistema di analisi interazioni molecolari dotato di CM5 chip del sensore ^19.
2. Attivare il chip CM5 da flowing 1: 1 miscela di 100 mM N-idrossisuccinimmide (NHS) e 400 mM 1-etil 3--(3-dimetilpropil) -carboiimide (EDC) per 10 minuti a una velocità di flusso di 10 ml / min ed a 25 ° C.
3. Caricare circa 5.000 unità di risposta (RU) di streptavidina (110 ml di 200 mg / ml a 10 mM acetato, pH 4,5) per covalente collegano alla superficie del chip in tutti e quattro portate cellule e utilizzare 100 ml di 1 M etanolammina cloridrato per disattivare eventuali gruppi reattivi rimanenti.
4. Coppia di circa 500-600 UR di Phla, a ~ 1 mM in tampone commerciale (fornito dal produttore), al chip sensore CM5 ad una portata lenta di 10 microlitri / min per assicurare una distribuzione uniforme sulla superficie del chip.
5. Saturare la superficie del chip con 1 mM biotina in tampone commerciale (fornita dal produttore) per 60 s.
6. Iniettare dieci diluizioni seriali di TCR solubili oltre pertinenti portate cellule ad una elevata portata di 30 microlitri / min a 25 ° C.
7. Calcolare la costante di equilibrio vincolante(K _D (E)) valori utilizzando una misura lineare curva (y = (P1x) / (P2 + x)) ^20.
   NOTA: le unità y = risposta, x = concentrazione analista, P1 = r _max, P2 = K _D.
8. Eseguire l'analisi cinetiche ipotizzando un 1: 1 Langmuir vincolante e adattare i dati utilizzando un algoritmo globale-fit nel pacchetto software ^2.
9. Eseguire termodinamica esperimenti ripetendo questo metodo alle seguenti temperature: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C e 30 ° C ^19.
10. Utilizzare i valori K _D determinati da SPR a temperature diverse per calcolare DeltaG ° utilizzando l'equazione termodinamico standard (DeltaG ° = -RTlnK _D) ^19.
    NOTA: R = costante dei gas, T = temperatura in K, ln = logaritmo naturale.
11. Calcolare i parametri termodinamici secondo l'equazione di Gibbs-Helmholtz (DeltaG ° = d H - TΔS °) ^19.
12. Tracciare le energie di legame liberi, DeltaG ° (DeltaG ° = -RTlnK _D), contro temperatura (K) utilizzando una regressione non lineare per adattare l'equazione a tre parametri (y = d H + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) ^19.
    NOTA: y = temperatura in K, x = DeltaG °.

5. Calorimetria isotermica di titolazione (ITC)

1. Effettuare esperimenti ITC utilizzando un calorimetro di titolazione isotermica. Iniettare 30 pM Phla nella cella del calorimetro e di carico 210 pM solubile TCR nella siringa. Utilizzare le seguenti condizioni tampone: 20 mm Hepes (pH 7,4) contenente 150 mM NaCl.
2. Eseguire 20 iniezioni TCR, ciascuna di un volume 2 microlitri. Calcolare d H e K _D utilizzando il software di analisi.

6. Cristallizzazione, raccolta dati di diffrazione, e modello Refinement

1. Eseguire prove di cristallizzazione utilizzando un robot cristallizzazione.
2. Crescere cristalli di vapo diffusione a 18 ° C tramite la tecnica calo seduto in una piastra a 96 pozzetti con un serbatoio contenente 60 ml di tampone cristallizzazione (acqua madre) ^21.
3. Concentrare il Phla solubile a circa 10 mg / ml (0,2 mM) in tampone cristallo facendo girare a 3000 xg in una centrifuga concentratore cut-off di peso molecolare 10 kDa.
4. Per le strutture co-complesso, mescolare il TCR e Phla in un rapporto 1: 1 molare per ottenere una soluzione proteica di circa 10 mg / ml (0,1 mM).
5. Aggiungere 200 nL di Phla sola, o 1: 1 rapporto molare della miscela di TCR e Phla, a 200 nL di ciascuna soluzione serbatoio dalla schermata di cristallizzazione utilizzando un robot cristallizzazione e segnare per cristalli al microscopio dopo 24 h, 48 h, 72 h, e poi una volta a settimana.
6. Harvest cristalli singoli di montarli manualmente in crio-loop sotto un microscopio e crio-raffreddare immergendo e la loro memorizzazione in azoto liquido (100 K).
   NOTA: Caricamento cristalli prende un po 'di PRACTice, e decidere quali cristalli sono abbastanza buono per la raccolta dei dati viene con l'esperienza. Come regola generale, il più grande e più regolare il cristallo, il migliore.
7. Raccogliere dati in un flusso di gas di azoto a 100 K.
   NOTA: questi dati è stata acquisita presso il Diamond Light Source (DLS) impianto di scienza di sincrotrone nazionale nel Regno Unito.
8. Analizzare i dati stimando le intensità di riflessione con xia2 utilizzando sia ²² MOSFLM e XDS pacchetti ^23, e poi scalare i dati con SCALA o AIMLESS ²⁴ e il pacchetto CCP4 ^25.
9. Risolvere le strutture con la sostituzione molecolare utilizzando PHASER ^26.
10. Regolare il modello con COOT ²⁷ e perfezionare il modello con REFMAC5 ^28.
11. Preparare rappresentazioni grafiche con PyMOL ^29.
12. Calcolare i contatti utilizzando il "contatto"programma nel pacchetto CCP4. Utilizzare un cut-off 4 A per van der Waals e un 3.4 un cut-off per i legami idrogeno e ponti salini.
13. Calcola complementarità superficie utilizzando il programma "SC" nel pacchetto CCP4.
14. Calcolare l'angolo di incrocio del complesso TCR-Phla, come descritto ^30.
    NOTA: Per questo studio, i dati di riflessione e le coordinate finali del modello sono stati depositati presso la banca dati PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4 e A2 -YLE-5A PDB: 5EU5).

Risultati

Utilizzando i metodi di cui sopra, abbiamo generato solubile TCR (Tabella 1) e le molecole Phla per condurre una approfondita analisi molecolari di gp100 _280-288 riconoscimento da parte delle cellule T CD8 ^+. Un sistema di espressione di E. coli modificato è stato utilizzato per generare insolubile IBs per ogni catena separata sia del TCR (catene alfa e beta) e pHLAs (catena α e β2m). Questo metodo ha il vantaggio di essere relativamente economico e facile da installare e genera grandi rese di proteine ​​(100-500 mg / L di coltura). Inoltre, le proteine ​​insolubili sono altamente stabili se conservati a -80 ° C. Abbiamo poi utilizzato una tecnica di ripiegamento e di purificazione consolidata per generare funzionali, omogenee, proteine ​​solubili. Questo metodo è utile per generare proteine ​​per biofisiche, strutturali e cellulari esperimenti, nonché reagenti che possono essere utilizzati per la diagnostica o terapeutica.

(Tabella 2). Questo test ha dimostrato che residui nel peptide erano più importante per il legame TCR. Ad alta risoluzione Analisi di affinità di legame con questa tecnica sono estremamente utile per determinare meccanismi biologici che controllano le interazioni proteina-proteina, nonché per analizzare l'affinità di legame di molecole terapeutiche.

Abbiamo poi cristallizzato un solubile TCR specifico per il melanoma (PMEL17 TCR) in complesso con un Phla modificata tumore-derivato (A2-YLE-9V) per studiare il modo di rilegatura a risoluzione atomica (figure 1 e 2 e Tabella 3). Questi esperimenti forniscono la visualizzazione diretta dell'interfaccia legame tra due molecole, creando un origing informazioni chiave su i principi alla base che governano l'interazione. Abbiamo eseguito un ulteriore analisi termodinamica dell'interazione utilizzando sia SPR e ITC, rivelando i contributi energetici che hanno permesso (figure 3) vincolante. Queste analisi sono state ulteriormente supportato da una descrizione ad alta risoluzione dell'impronta di contatto tra le due proteine (Figura 4 e Tabella 4).

Abbiamo poi risolto le strutture delle molecole Phla unligated, presentando forme mutate del peptide, rivelando che un interruttore molecolare potrebbe spiegare perché alcune mutazioni abrogati TCR vincolante (figure 5).

Nel complesso, queste tecniche forniti nuovi dati che dimostrano il meccanismo che spiega come le cellule T riconoscono un antigene melanoma di derivazione che è un obiettivo importante per terapie anti-cancro. Più in generale, queste tecnichepuò essere utilizzato per indagare su qualsiasi interazione recettore-ligando, scoprire nuovi meccanismi biologici che potrebbero essere oggetto di nuovi progressi terapeutici.

Figura 1: densità Analisi Plot. Gli spettacoli colonna sinistra omettono mappe in cui il modello è stato affinato in assenza del peptide. Densità differenza è sagomato a 3.0 sigma, contorni positivi sono mostrati in verde, e contorni negativi sono di colore rosso. La colonna di destra mostra la mappa osservato a 1,0 sigma (mostrato come una maglia grigia intorno rappresentazioni bastone delle catene proteiche) dopo successivo affinamento utilizzare le restrizioni di simmetria non cristallografiche automatiche applicate da REFMAC5. (A) Il modello per PMEL17 TCR-A2-YLE-9V con il TCR CDR3 loop di colore blu (catena α) e arancione (catena β) e il peptide in verde. (B) Il modello per A2-YLE conil peptide di colore verde scuro. (C) Il modello per A2-YLE-3A con il colore arancione peptide (per A2-YLE-3A, c'erano 2 molecole nell'unità asimmetrica, ma questi erano praticamente identiche in termini di mappe Omettere e densità, in modo che solo copiare 1 è mostrato qui). (D) Il modello per A2-YLE-5A con il peptide di colore rosa. Ristampato con il permesso di riferimento ^31. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Panoramica del PMEL17 TCR in complesso con A2-YLE-9V. Rappresentazione (A) del fumetto del complesso PMEL17 TCR-A2-YLE-9V. Il TCR è di colore nero; loop TCR CDR sono mostrati (rosso, CDR1α, verde scuro, CDR2α, blu, CDR3α, giallo, CDR1β, aqua, CDR2 ^6 ;; arancio, CDR3β); e HLA-A * 0201 è raffigurato in grigio. Il peptide YLE-9V è rappresentata da bastoncini verdi. (B) di superficie e bastone rappresentazioni di residui del PMEL17 TCR CDR loop (codice colore come in A) che contatto con la superficie A2-YLE (A2, grigio, YLE-9V, bastoni verdi). La linea diagonale nera indica l'angolo di incrocio del TCR rispetto all'asse lungo del peptide YLEPGPVTV (46.15 °). (C) Contatto impronta del PMEL17 TCR sulla superficie A2-YLE-9V (A2, grigio); viola e verde (di superficie e bastoncini) indicano l'HLA-A * 0201 e residui YLE, rispettivamente contattati dalla TCR gp100. Cut-off di 3.4 Å per legami di idrogeno e 4 A per van der Waals. Ristampato con il permesso di riferimento 31. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi termodinamica del PMEL17 Interaction TCR-A2-YLE. (A) PMEL17 TCR equilibrio vincolante risposte a A2-YLE a 5, 12, 18, 25, e 37 ° C in nove a dieci diluizioni seriali TCR. SPR dati grezzi e muro (assumendo 1: 1 vincolante Langmuir) sono mostrati nel riquadro di ogni curva e sono stati utilizzati per calcolare _K e K _off valori utilizzando un algoritmo globale-fit (BIAevaluation 3.1). La tabella mostra equilibrio poroso (K _D (E)) e costanti cinetiche poroso (K _D (K) = K _off / _K) per ogni temperatura. L'equilibrio di legame costante (K _D, micron) i valori sono stati calcolati utilizzando un fit lineare (y = (P1x) / (P2 + x)). (B) i parametri termodinamici sono stati calcolati secondo l'equazione di Gibbs-Helmholtz (DeltaG ° = d H ° - TΔS °). Le energie libere di legame, DeltaG ° (DeltaG ° = -RTlnK _D), sono state tracciate contro di temperatura (K) utilizzando una regressione lineare per adattare l'equazione a tre parametri (y = d H ° + ΔCp ° * (x-298) -x * ΔS ° -x * ΔCp ° * ln (x / 298)). Entalpia (d H °) e l'entropia (TΔS °) a 298 K (25 ° C) sono mostrati in kcal / mol e sono stati calcolati da una regressione non lineare della temperatura (K) tracciate contro l'energia libera (DeltaG °). (C) isotermica di titolazione calorimetrica (ITC) misure per l'interazione TCR-A2-YLE PMEL17. Entalpia (d H °) e l'entropia (TΔS °) a 298 K (25 ° C) sono mostrati in kcal / mole. Ristampato con il permesso di riferimento ^31. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

ong> Figura 4: Il PMEL17 CDR Loops Focus on Peptide residui Pro4, Val7, e Thr8. (A) Rappresentazione schematica dei contatti tra il peptide YLE-9V e residui ciclo PMEL17 CDR (codice colore come nella Figura 2A). I numeri in basso del pannello mostrano i contatti totali tra il TCR e il peptide. (B) I contatti tra la PMEL17 TCR e il peptide YLE-9V (bastoncini verdi) che mostra il van der Waals (nero linee tratteggiate) e legami a idrogeno (rosso linee tratteggiate) fatte dal TCR CDR3α (blu), CDR1β (giallo) , CDR2β (acqua), e CDR3β (arancione) loop. Nel pannello inferiore è una vista ravvicinata dei contatti tra YLE Pro4, Val7, e Thr8, rispettivamente, e residui di anello TCR CDR (colore bastoni codificato come in Figura 1A). Cut-off di 3.4 Å per legami di idrogeno e 4 A per van der Waals. Ristampato con il permesso di riferimento ^31.rge.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Confronto conformazionale di YLE, YLE-3A, e A2-YLE-5A Peptidi Presentato da HLA-A * 0201. (A) YLE (bastoni verde scuro) e YLE-3A (bastoncini d'arancio) allineamento peptide dalla sovrapposizione di HLA-A * 0201 α1 elica (cartone grigio). residui in scatola indicano la mutazione di Glu3 in un alanina. I riquadri mostrano come la sostituzione Glu3Ala provoca uno spostamento in posizione (freccia nera) di Pro4 prossimo residuo nella struttura A2-YLE-3A rispetto alla struttura A2-YLE. (B) YLE (bastoncini di colore verde scuro) e YLE-5A (bastoni rosa) allineamento peptide dalla sovrapposizione di HLA-A * 0201 α1 elica (cartone grigio). I residui scatola indicano la mutazione di glicina 5 in una alanina. Ristampato con il permesso di riferimento ^{Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.}

TCR	CDR1α	CDR2α	CDR3α	CDR1β	CDR1β	CDR1β
PMEL17	DSAIYN	IQSSQRE	CAVLSSGGSNYKLTFG	SGHTA	FQGTGA	CASSFIGGTDTQYFG
gp100	TSINN	IRSNERE	CATDGDTPLVFG	LNHDA	SQIVND	CASSIGGPYEQYFG
	KALYS	LLKGGEQ	CGTETNTGNQFYFG	SGHDY	FNNNVP	CASSLGRYNEQFFG
296	DSASNY	IRSNVGE	CAASTSGGTSYGKLTFG	MNHEY	SMNVEV	CASSLGSSYEQYFG

Tabella 1: Allineamento di TCR CDR3 Regioni della PMEL17, gp100, MPD, e 296 TCR specifici GP100. Ristampato con il permesso di riferimento ^31.

sequenza peptidica	peptide	PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Affinity K D	gp100 TCR TRAV17 TRBV19 Affinità K D
YLEPGPVTA	YLE	7.6 ± 2 micron	26.5 ± 2.3 micron
YLEPGPVT V	YLE-9V	6.3 ± 1.2 micron	21.9 ± 2.4 micron
A LEPGPVTA	YLE-1A	15.9 ± 4.1 micron	60,6 ± 5,4 micron
YL A PGPVTA	YLE-3A	No binding	No binding
YLE A GPVTA	YLE-4A	19,7 ± 1,3 micron	144,1 ± 7,8 micron
YLEP A PVTA	YLE-5A	> 1 mM	> 1mM
YLEPG A VTA	YLE-6A	11.4 ± 2.7 micron	954.9 ± 97.8 micron
YLEPGP A TA	YLE-7A	31.1 ± 4 micron	102.0 ± 9.2 micron
YLEPGPV A A	YLE-8A	38.1 ± 7.4 micron	121.0 ± 7.5 micron

Tabella 2: Analisi Affinity (K _D) di PMEL17 TCR e TCR gp100 di gp100 _280-288 varianti del peptide. Ristampato con il permesso di riferimento ^31.

parametri	PMEL17 TCR-A2-YLE-9V	A2-YLE	A2-YLE-3A	A2-YLE-5A
Codice PDB </ Strong>	5EU6	5EU3	5EU4	5EU5
statistiche dataset
gruppo spaziale	P1	P1 21 1	P1	P1 21 1
parametri di cella Unità (A)	a = 45.52, b = 54.41, c = 112.12, a = 85,0 °, b = 81.6 °, 72.6 ° g =	a = 52.81, b = 80.37, c = 56.06, b = 112.8 °	a = 56.08, b = 57.63, c = 79.93, a = 90,0 °, b = 89,8 °, g = 63.8 °	a = 56.33, b = 79.64, c = 57.74, b = 116,2 °
sorgente di radiazione	DIAMOND I03	DIAMOND I03	DIAMOND I02	DIAMOND I02
Lunghezza d'onda (Å)	0,9763	0.9999	0,9763	0,9763
measuPortata Risoluzione rossa (A)	51,87-2,02	45,25-1,97	43,39-2,12	43,42-1,54
Outer Risoluzione Shell (Å)	2,07-2,02	2,02-1,97	2,18-2,12	1,58-154
riflessione osservato	128.191 (8.955)	99.442 (7.056)	99.386 (7.463)	244.577 (17.745)
riflessi unici	64.983 (4.785)	30.103 (2.249)	49.667 (3.636)	67.308 (4.962)
Completezza (%)	97,7 (96,7)	98,5 (99,3)	97.4 (96.7)	99,6 (99,9)
moltiplicità	2.0 (1.9)	3.3 (3.1)	2.0 (2.1)	3.6 (3.6)
I / Sigma (I)	5.5 (1.9)	7.2 (1.9)	6,7 (2.3)	13 (2.3)
Rpim (%)	5.7 (39.8)	8.8 (44.7)	8.7 (41.6)	4,5 (35,4)
R merge (%)	7.8 (39.6)	9,8 (50,2)	8.7 (41.6)	5.0 (53.2)
statistiche raffinatezza
Risoluzione (Å)	2.02	1.97	2.12	1.54
Non ci sono riflessioni utilizzati	61688	28557	47153	63875
No riflessione in Rfree set	3294	1526	2514	3406
R cryst (no cut-off) (%)	18.1	19,7	17.2	17,0
R gratis	22.2	25.5	21.1	20.1
Radice scarto quadratico medio dalla geometria ideale
lunghezze di legame (A)	0,018 (0,019) *	0,019 (0,019) *	0,021 (0,019) *	0,018 (0,019) *
angoli di legame (°)	1.964 (1.939) *	1.961 (1.926) *	2.067 (1.927) *	1.914 (1.936) *
Nel complesso coordinare errore (Å)	0,122	0,153	0.147	.055
Ramachandran Statistiche
più favorita	791 (96%)	371 (98%)	749 (99%)	384 (98%)
Permesso	32 (4%)	6 (2%)	10 (1%)	5 (1%)
Valori anomali	2 (0%)	3 (1%)	1 (0%)	2 (0%)

Tabella 3: riduzione dei dati e raffinatezza statistiche (sostituzione molecolare). Ristampato con il permesso di riferimento ^31. I valori tra parentesi sono per la shell più alta risoluzione.

^OH

HLA / residui peptide	residui TCR	No. vdW (≤4Å)	No. H-bond (≤3.4Å)
Gly62	αGly98	3
	αSer99	1
Arg65	αSer99	2
Arg65 O	αAsn100 Nδ2	2	1
Arg65 NH1	βAsp58 Oδ2		1
	βSer59	8
Lys66	αGly98	1
	αSer99	4
	αAsn100	4
Ala69	αAsn100	2
	βAla56	2
Gln72 Nε2	βGln51 O	3	1
	βGly54	7
	βAla55	1
Thr73	βGln51	1
Val76	βGln51	3
	βGly52	2
Lys146	βPhe97	3
	βIle98	3
Ala150	βIle98	1
	βAsp102	3
Val152	βIle98	1
Glu154	αTyr32	1
Gln155 N	αTyr32 OH	4	1
Gln155 Oε1	βThr101 N	10	1
αGly97 O	1	1
	αGly98	1
	αSer96	1
Glu3	αTyr101	1
Pro4	αSer96	1
	αSer99	1
	αAsn100	4
Pro4 O	αTyr101 N	14	1
Gly5	αTyr101	3
	βGly100	2
Val7	βIle98	7
	βGly99	2
	βGly100	2
Thr8	βThr31	5
	βGln51	1
	βPhe97	1
Thr8 N	βIle98 O	6	1

Tyr1

Tabella 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V contatto Table. Ristampato con il permesso di riferimento ^31.

Discussione

I protocolli descritti qui forniscono un quadro per la dissezione molecolare e cellulare di risposte delle cellule T nel contesto di una malattia umana. Anche se il cancro è stato l'obiettivo principale di questo studio, abbiamo utilizzato metodi molto simili a indagare le risposte delle cellule T a virus ^{32, 33, 34, 35, 36, 37} e durante l'autoimmunità ^{38, 39, 40.} Inoltre, abbiamo usato queste tecniche in modo più ampio per comprendere i principi molecolari che governano cellule T riconoscimento dell'antigene ^{2, 19, 41, 42.} In effetti, la natura imprevedibile di modifiche al peptide residui, anche quellial di fuori della dei residui di contatto TCR, il riconoscimento impatti delle cellule T ha importanti implicazioni per la progettazione di peptidi eterocliti. Questi risultati hanno contribuito direttamente allo sviluppo di nuove terapie cellule T, i vaccini peptidici ^{6, 43} e TCR alta affinità artificiali ^{3, 4, 5, 20, 44,} nonché della diagnostica potenziate ^{45, 46, 47.}

Passaggi critici all'interno del protocollo
La generazione di una proteina altamente pura, funzionale è essenziale per tutti i metodi descritti nel presente documento.

Modifiche e risoluzione dei problemi
Le difficoltà nel generare proteine ​​altamente puro spesso interessano la espressione altamentepuro al, insolubile IBs dal sistema di espressione di E. coli. Di solito, la modifica del protocollo di espressione (ad esempio, inducendo a differenti densità ottiche, utilizzando diversi ceppi di E. coli, o con diverse formazioni di media) risolve questi problemi.

Limitazioni della tecnica
Queste tecniche utilizzano molecole proteiche solubili (TCR e Phla) che normalmente vengono espressi sulla superficie cellulare. Pertanto, è importante garantire che / risultati biofisici strutturali sono coerenti con approcci cellulari per confermare significato biologico.

Importanza della tecnica rispetto ai metodi esistenti / alternativi
Attraverso l'uso di cristallografia a raggi X e biofisica giustificati attraverso l'analisi funzionale, noi e altri hanno dimostrato che il TCR specifico per epitopi tumorali sono generalmente caratterizzati da bassi affinità di legame ^48. Questa bassa affinità TCR può aiutare a spiegare il motivo per cui le cellule T are non naturalmente efficace a chiarire il cancro. Ad alta risoluzione delle strutture atomiche di complessi tra TCR anti-cancro e antigeni tumorali affini stanno iniziando a rivelare le basi molecolari per questa affinità debole. Inoltre, questi studi sono utili per determinare i meccanismi che sono alla base degli interventi terapeutici volti a superare questo problema, semina futuri miglioramenti ^16. In questo studio, abbiamo esaminato la prima struttura di un αβTCR presenti naturalmente in complesso con un gp100 HLA-A * 0201-ristretta melanoma epitopo. La struttura, combinata con un esame biofisico approfondito, ha rivelato la modalità generale vincolante dell'interazione. Abbiamo anche scoperto un interruttore molecolare, inaspettato, che si è verificato in una forma mutata del peptide, che ha abrogato TCR vincolante (valutata mediante risonanza plasmonica di superficie) e CD8 ⁺ riconoscimento delle cellule T (esperimenti funzionali). E 'stato possibile solo per dimostrare questo nuovo meccanismo di HLA Presentati antigeneon utilizzando i metodi descritti ad alta risoluzione.

Le future applicazioni o direzioni Dopo aver imparato questa tecnica
Nel complesso, i nostri risultati dimostrano il potere della cristallografia a raggi X e metodi biofisici quando combinato con robuste analisi funzionali. Utilizzando questi approcci, è possibile sezionare meccanismi molecolari precise che governano riconoscimento dell'antigene T-cellule. Infatti, è anche possibile utilizzare questo approccio per risolvere la struttura di unligated TCR, dimostrando come cambiamenti conformazionali possono svolgere un ruolo durante antigene discriminazione ^{49, 50, 51.} Una migliore comprensione della natura altamente complesso e dinamico che è alla base delle interazioni TCR-Phla ha anche implicazioni evidenti per la progettazione della terapia. Poter direttamente "vedere" le molecole che vengono terapeuticamente mirati, nonché l'effetto che le modifiche hanno sulle antigene recognition, sarà chiaramente migliorare lo sviluppo di questi farmaci per il futuro. In questo studio, dimostriamo che anche modifiche in un singolo residuo peptide che non è fortemente impegnata da un TCR possono imprevedibilmente trasmettere modifiche strutturali ad altri residui del peptide HLA-bound, che, a sua volta, altera drasticamente riconoscimento T-cellule. Una comprensione più completa dei meccanismi molecolari utilizzati durante il riconoscimento dell'antigene T-cella sarà estremamente utile quando si progetta future terapie per una vasta gamma di malattie umane.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
S.O.C. media	Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit incubatore	Sanyo
carbenicillin	Sigma
IPTG
Quick Coomassie Stain SafeStain	Centrifuga Generon
Legend RT	Sorvall
Tris
Cloruro di magnesio Fisher	Arcos
NaCl
Glicerolo	Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070	Bandelin
DNAse
Triton	Sigma-Aldrich
EDTA			Guanidina di Fisher
nbsp;
NanoDrop ND1000	Thermo
Peptidi	Peptidi Ricerca
ditiotreitol	Sigma-Aldrich
L-arginina	Cisteamina SAFC
Cistamina di Fisher
Tubo per dialisi Fisher	Urea Sigma-Aldrich
	Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 μ m filtro a membrana	Pall
POROS 10/100 HQ	Biosistemi
Ä Sistema FPLC puro KTA	GE Healthcare Scienze
10 kDa MWCO Vivaspin 20	Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4	Colonna Sartorius
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences
Soluzione salina tampone fosfato	Oxoid
BIAcore tampone HBS			della vita di GE Healthcare
	Avidity
BIAcore T200	le scienze
	di GE Healthcare Streptavidina per le scienze
	Sigma-Aldrich
Microcal VP-ITC	GE Healthcare Scienze
Hepes	Sigma-Aldrich
Gryphon robot di cristallizzazione	Art Robbins Strumenti
Intelli-plate	Art Robbins Instruments
Schermi e reagenti per cristallizzazione	Dimensioni
75 cm2 pallone	Greiner Bio-One
0.22 μ m filtri	Miller-GP, provetta per ultracentrifuga Millipore
Ultra-Clear	Beckman Coulter
Optima L-100 XP con rotore SW28	Beckman Coulter
CD8 microsfere	Miltenyi Biotec
anti-CD3/CD28 Dynabeads	Microsfere anti-PE Invitrogen
	Miltenyi Biotec
CK medium, PHA	Alere Ltd
anti-TCRVβ mAb
dasatinib	Assone
MIP-1β e TNF&alfa; ELISA	R&
51Cr	PerkinElmer
1450 Contatore Microbeta	PerkinElmer