Questo protocollo dimostra l'isolamento delle isole murine e la semina su un impalcatura decellulare. Isole supportate da ponteggi sono state trapiantate nel pad di grasso epididimo di topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ). Isole sopravvissute al sito di trapianto e invertite la condizione iperglicemica.
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Articolo metodologico
Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il trapianto delle isole è stato clinicamente dimostrato efficace nel trattamento del diabete di tipo 1. Tuttavia, l'attuale strategia intraepatica di trapianto può comportare reazioni sanguigne intere acute e provocare un cattivo ingrasso di isole. Qui riportiamo un robusto protocollo per il trapianto di isole nel sito di trapianto extraepatico, il pad di grasso epididimo (EFP), in un modello di topi diabetici. Viene descritto un protocollo per isolare e purificare isole a rendimenti elevati da topi C57BL / 6J, nonché un metodo di trapianto eseguito da isole isolanti su un basamento decellulato (DCS) e implantarli sul sito EFP in topi sintesi C57BL / 6J resi diabetici Da streptozotocina. L'innesto DCS contenente 500 isole ha invertito la condizione iperglicemica entro 10 giorni, mentre gli isolotti liberi senza DCS hanno richiesto almeno 30 giorni. La normoglicemia è stata mantenuta fino a 3 mesi fino a quando l'innesto è stato esplorato. In conclusione, DCS ha potenziato l'inserimento di isole in tIl sito extraepatico dell'EFP, che potrebbe essere facilmente recuperato e potrebbe fornire una piattaforma riproducibile e utile per indagare i materiali dello scaffold, così come altri parametri di trapianto necessari per un successo nell'inserimento delle isole.
Introduzione
Il diabete mellito di tipo 1 (T1D) è un disturbo endocrino autoimmune in cui le cellule delle isole vengono ablate dal sistema immunitario, rendendo i pazienti dipendenti dall'iniezione di insulina esogena per tutta la vita. Il protocollo di Edmonton rappresenta una pietra miliare negli studi clinici del trapianto di isole; Isole sono state infuse attraverso la vena portale e trapiantate nel sito intraepatico 1 . Tuttavia, due principali ostacoli, inadeguate fonti di isole donatrici e una scarsa assunzione di isole, impediscono l'ampio successo del trapianto di isole 2 . Di solito, isolotti devono essere raccolt....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Pechino (IACUC, IACUC no COE-LuoY-1).
1. Isolazione Isolamento
- Preparazione di reagenti e attrezzature.
- Ricostituire la polvere di collagenasi P (2 U / mg) in HBSS per ottenere una soluzione da 5 mg / mL e filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere i batteri. Preparare soluzioni da 0,6 ml di aliquota di collagenasi P in 15 ml di tubi conici e conservare a -20 ° C.
NOTA: Durante l'uso, ogni aliquota viene diluita con HBSS per dare 6 ml di soluzioni di lavoro con concentrazioni fin....
- Ricostituire la polvere di collagenasi P (2 U / mg) in HBSS per ottenere una soluzione da 5 mg / mL e filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere i batteri. Preparare soluzioni da 0,6 ml di aliquota di collagenasi P in 15 ml di tubi conici e conservare a -20 ° C.
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Risultati
Il nostro metodo di bloccaggio, eseguito utilizzando un morsetto emostatico microscopico, è semplice e risparmio di tempo rispetto alla tecnica di ligation della sutura. Ci sono voluti circa 4 ore per isolare e purificare circa 1.200 isole da 6 topi. Gli isolotti freschi isolati hanno tipicamente avuto una periferia ruvida sotto un microscopio ottico ( Figura 3A ). Una volta che le isole recuperate dal processo di isolamento, sembravano brillanti e stretti e.......
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Discussione
La perfusione del pancreas e il tempo di digestione sono due parametri chiave che influenzano la resa e la qualità delle isole. Moskalewski ha segnalato per la prima volta l'uso di una miscela di collagenasi grezzo per la digestione del pancreas di guinea pig macinato 11 . Lacy et al. Ha segnalato l'iniezione di enzimi nel sistema del condotto per perfezionare il pancreas, che ha notevolmente aumentato il rendimento delle isole 12 . La perfusione duttale d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero ringraziare Wei Zhang da Guanhao Biotech per fornire gli scaffali decellulari. Ringraziamo Xiao-hong Peng per le discussioni utili. Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente dalla National Science Foundation della Cina (progetto n.31322021).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Forbice da dissezione | Ningbo Medical Pinze Ningbo Medical | ||
| Rete metallica da 0,5 mm di diametro | Ningbo Medical | ||
| 70 μ filtro per cellule m | Falcon | 352350 | |
| Pinza emostatica arteriosa | Ningbo Medical | ||
| Pinza emostatica microscopica | Ningbo Medical Pinza emostatica Ningbo Medical | ||
| Suture | |||
| JINHUAN | Con | ||
| ago Clip per ferita | Ningbo Medical | ||
| Cotton fioc | Ningbo Medical | ||
| Garza Ningbo | sterili Ningbo Medical | ||
| Siringa Ningbo Medical | |||
| 10mL | JINGHUAN | ||
| Siringa da 1 ml | JINGHUAN | ||
| Ago endovenoso 27G | JINGHUAN | 0,45x15 RWSB | |
| 1,5 mL tubo Eppendorf | Axygen | ||
| 15mL tubo conico | Corning | 430791 | |
| 50mL tubo conico | Corning | 430829 | |
| 35mm Non trattato Peri-piatti | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μ m filter | Pall | PN4612 | |
| Pipetta sierologica da 10 mL | Corning | 4488 | |
| Riempitrice per pipette S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipetta (2-20μ L) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Microscopio da dissezione | Centrifuga Olympus | SZ61 | |
| Eppendorf | 5810R | ||
| Hank' s soluzione salina bilanciata | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenasi P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucosio | Gibco | A24940-01 | |
| Glucometro | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillina-streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocina | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Cloralio idrato | J& K | C0073 | |
| Citrato di sodio | Sigma | 71497 | |
| Acido citrico | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 settimane | VitalRiver | Beijing, Cina | |
| Ponteggio decellularizzato | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, Cina |
Riferimenti
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al.
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Ristampe e permessi
