A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

Sommario

Questo articolo descrive il protocollo per la coltura a bassa densità primari neuroni ippocampali crescono su vetrini invertiti su un monostrato gliale. Gli strati neuroni e gliali sono separati da perline di cera di paraffina. I neuroni coltivati ​​con tale metodo adatto per imaging ottico ad alta risoluzione e saggi funzionali.

Abstract

La capacità di sondare la struttura e la fisiologia delle singole cellule nervose in coltura è fondamentale per lo studio della neurobiologia, e consente flessibilità nella manipolazione genetica e chimica delle singole cellule o reti definite. Tale facilità di manipolazione è semplice nel sistema di coltura ridotta rispetto al tessuto cerebrale intatto. Mentre esistono molti metodi per l'isolamento e la crescita di questi neuroni primari, ognuno ha i suoi limiti. Questo protocollo descrive un metodo per la coltura a bassa densità ed elevata purezza roditori embrionali neuroni dell'ippocampo su vetrini, che vengono poi sospesa su un monostrato di cellule gliali. Questo 'coltura a sandwich' consente esclusiva crescita a lungo termine di una popolazione di neuroni pur consentendo supporto trofico dal monostrato gliale sottostante. Quando i neuroni sono in età sufficienti o livello di maturità, i coprioggetti neuroni possono essere capovolte-out del piatto gliali e usati nell'imaging o saggi funzionali. neuroni grown con questo metodo tipicamente sopravvivere per diverse settimane e sviluppare ampie pergole, connessioni sinaptiche, e le proprietà di rete.

Introduzione

Il cervello è organizzato in reti complesse di neuroni. Il contributo dei singoli neuroni per attività di rete e la funzione cerebrale può essere studiato alterazione selettiva della loro composizione molecolare e perturbazione delle loro proprietà fisiologiche. Genetica e chimica manipolazione di singoli neuroni è senza dubbio più facile nei neuroni in coltura che in tessuto cerebrale intatto, libera da eterogeneità cellulare di quest'ultimo e la complessità. Neuroni in coltura sviluppano assonale ben definita e arbors dendritiche e formano estese connessioni sinaptiche con l'altro.

Mentre la cultura neurone da animali adulti o da altre regioni del sistema nervoso è possibile, colture ippocampali embrionali sono spesso preferiti a causa della loro popolazione cellulare piramidale definita e densità relativamente bassa gliale ^{1, 2.} neuroni dell'ippocampo coltivati ​​a bassa densità in coltura sono particolarmente amenable allo studio della localizzazione subcellulare, il traffico di proteine, di polarità neuronale e lo sviluppo delle sinapsi. Neuroni in coltura sono anche stati ampiamente impiegati in studio dei processi molecolari nella plasticità sinaptica ^{3, 4, 5, 6.} Preparati cultura Neuron da topi con delezioni genetiche globali che non sopravvivono dopo la nascita sono stati particolarmente utili nello studio ruoli cellulari e sinaptici di alcuni geni ^7.

Come nel cervello, in coltura neuroni dell'ippocampo sono dipendente dal sostegno trofico dalle cellule gliali. Questo complica la loro cultura, e ha portato allo sviluppo di diversi metodi con cui questo supporto è fornita. Un metodo comunemente usato comporta placcatura neuroni direttamente su un monostrato di cellule gliali ^8, o che consentono cellule gliali contaminanti dal hipp acquisitatessuto ocampal a proliferare e formare un monostrato sotto i neuroni ^9. Mentre questo metodo ha trovato un certo successo, l'impurità della cultura neuronale risultante è svantaggioso per esperimenti di imaging. Un altro metodo comunemente usato di cultura neurone è lasciare-out l'alimentatore gliali strato del tutto, e invece fornire supporto trofico nella forma di un mezzo di crescita definito ^10.

Qui, descriviamo il "sandwich" o il metodo "Banker" della cultura neurone ^{2, 11.} Questo metodo comporta placcatura neuroni ippocampali su vetrini, che vengono poi sospesa su un monostrato di cellule gliali separate da perline di cera di paraffina. Questo facilita coltura a lungo termine di una popolazione omogenea di neuroni senza contaminare glia pur consentendo supporto trofico dal monostrato gliale sottostante. Quando i neuroni sono in età sufficiente o livello di maturità,i coprioggetti neuroni possono essere capovolte-out del piatto gliali e usati nell'imaging o saggi funzionali.

Protocollo

Tutti gli esperimenti e protocolli che utilizzano animali da laboratorio sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di Manitoba animali ed erano conformi alle linee guida del Canadian Council on Animal Care.

1. Preparazione di strumenti, Tamponi e soluzioni

1. Sterilizzare in autoclave tutte le apparecchiature dissezione, pipette Pasteur in vetro, le punte delle pipette, apparecchio filtrante, e acqua deionizzata.
2. Preparare un 20% (w / v; 1,1 M) soluzione madre di glucosio in acqua deionizzata e filtro-sterilizzare. Conservare a 4 ° C.
3. Preparare una soluzione 100 mM di piruvato di sodio in acqua deionizzata e filtro-sterilizzare. Conservare a 4 ° C.
4. Preparare la soluzione salina bilanciata calcio-magnesio e privo di Hank (HBSS-CMF) facendo una soluzione di 10% HBSS (10x), 10 mM HEPES, e 100 U / ml di penicillina-streptomicina in acqua deionizzata. Conservare a 4 ° C per non più di 1 a 2 mesi.
5. Preparare 10 mg / mL deossiribonucleasi I (DNasi) in CMF-HBSS,e poi filtrare-sterilizzare e conservare a -20 ° C.
6. Preparare mezzo gliale facendo una soluzione di 30 mM glucosio (dalla soluzione sterile), 95 U / ml di penicillina-streptomicina, e 10-15% di siero bovino della crescita (BGS) in Minimum Essential Medium (MEM).
   NOTA: Come indicato nel protocollo, una soluzione di 5% BGS può essere utilizzato, se necessario per rallentare la proliferazione cellulare. Cavallo siero può essere usato al posto di BGS, ma si noti che ogni partita deve essere testato prima dell'utilizzo a causa di variazione inter-lotti. Conservare la soluzione preparata a 4 ° C per non più di 1 a 2 mesi. Anche se molti laboratori utilizzano FBS, abbiamo costantemente osservato che la crescita gliali in BGS è così robusta come in FBS. BGS è derivato da siero di vitello fetale che è integrato con componenti chimicamente definite. Inoltre, BGS è sostanzialmente più economico di FBS.
7. Preparare la crescita neurone e mezzo di mantenimento (Neurobasal-B27, ETE) facendo una soluzione di 1x B27 supplemento e 0,5 mM di L-glutammina in 500 mL Neurobasal Medium. Conservare a 4 ° C per non più di 1 a 2 mesi. L-glutammina può essere sostituito con Glutamax, che è stato suggerito di essere più stabili nel mezzo di crescita.
8. Preparare il neurone placcatura mezzo facendo una soluzione di 30 mM glucosio (dalla soluzione sterile), 1 mM sodio piruvato (dalla soluzione sterile), e il 10% in BGS MEM. Conservare a 4 ° C per non più di 1 a 2 mesi.
9. Preparare una soluzione di 1 mM citarabina (Ara-C) e filtro-sterilizzare. Aliquotare in 1 porzioni ml e conservare a -20 ° C.
10. Preparare una soluzione di 100 mM APV in 100 mN sterilizzata per filtrazione NaOH. Conservare a -20 ° C.
11. Sciogliere 1 mg / ml di poli-L-lisina in tampone borato, pH 8,5 (50 mM di acido borico e 12 mM borace) e filtro-sterilizzare. Aliquotare e conservare a -20 ° C. Invece di poli-L-lisina, si può usare poli-L-ornitina che può essere meno tossico per le cellule.

2. Preparazione Glia Culture

1. Preparare coltura cellulare astroglia corticale
   1. Ottenere cuccioli di ratto entro 24 ore dalla nascita. Posizionare i cuccioli sul ghiaccio anestetizzare loro.
   2. Spruzzare i cuccioli con il 70% di etanolo e di decapitarlo.
   3. Posizionare le testine in un piatto 100 mm su ghiaccio contenente 15 mL CMF-HBSS.
   4. Sezionare ogni cervello tagliando il cuoio capelluto, aprendo il cranio, tagliando il tronco cerebrale, e poi trasferire il cervello a 60 mm di Petri su ghiaccio contenente 3 mL CMF-HBSS.
   5. Separare gli emisferi cerebrali dalla dell'ippocampo e poi spogliare le meningi li circondano. Esercitare precauzioni adeguate per garantire la contaminazione minimo da fibroblasti meningei. fibroblasti meningei nella cultura può competere con glia per la crescita ed essere dannoso per la salute dei neuroni. Raccogliere tutti gli emisferi cerebrali in 60 mm Petri su ghiaccio contenente 5 ml di CMF-HBSS.
   6. Rimuovere la CMF-HBSS e poi tritare il tessuto corticale raccolto più finemente possibile utilizzare molle-forbici micro-dissezione.
   7. Aggiungere sufficiente CMF-HBSS per il tagliotessuti PED. Usando una pipetta Pasteur di vetro, trasferire i pezzi di tessuto in una provetta da 15 ml. Portare il volume totale di 12 ml con l'aggiunta di CMF-HBSS.
   8. Aggiungere 1,5 ml ciascuna del 2,5% tripsina e 10 mg / mL di soluzione DNasi. Incubare la miscela risultante a 37 ° C a bagnomaria per 12 min.
   9. Triturare il tessuto 10-15 volte usando una pipetta Pasteur di vetro, e in seguito incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 3 min.
   10. Filtrare il surnatante con foglio lente o una rete filtrante in una provetta da 50 ml contenente 5 ml di BGS. Questo viene fatto per rimuovere pezzi di tessuto non dissociato. In alternativa, utilizzare filtri cellulari disponibili in commercio.
   11. Aggiungere 13,5 ml di CMF-HBSS e 1,5 ml di 2,5% tripsina al tubo contenente i pezzi di tessuto rimanenti e in seguito incubare a 37 ° C in un bagno d'acqua per altri 10 min.
   12. Triturare il tessuto rimanente ancora una volta, e poi filtrare nuovamente la sospensione nella provetta da 50 ml contenente il filtrato iniziale. Avanti, sciacquare il lecarta ns con 3 mL di BGS. Il volume finale deve essere di circa 38 mL.
   13. Centrifugare la sospensione contenente le cellule gliali dissociate per 6 minuti a 130 x g. Eliminare attentamente il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro. Assicurarsi che le cellule pellet in fondo non sono disturbati. Il fondo del pellet appare leggermente rossastro contenenti componenti del sangue.
   14. Trasferire le cellule gliali in 1 ml di mezzo gliale in una nuova provetta, facendo attenzione a non disturbare la porzione rossastra del pellet.
   15. Aggiungere fino a 2 ml di terreno gliali ogni cucciolo per sospendere di nuovo il combinato dissociato cellule gliali. Ad esempio, se 10 cuccioli sono stati utilizzati, e quindi il volume totale risospensione sarebbero 20 mL.
   16. Preparare cultura beuta una compressa da 75 ^cm2 di cellule per cucciolo. Aggiungere 18 ml di pre-riscaldato medio gliale ad ogni pallone.
   17. Trasferire 2 ml di sospensione cellulare a ciascuna beuta e incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
   18. Dopo un giorno, sostituirli con 20 mL gliale medium. In questa fase, la cultura è un mix di gliali e di altri tipi di cellule indesiderate.
   19. Quattro giorni dopo la semina delle cellule, vigorosamente scuotere i palloni per staccare le cellule non-astrociti. Per fare questo, lavare i flaconi una volta con CMF-HBSS, e quindi aggiungere 10 ml fresca CMF-HBSS ad ogni pallone. Agitare vigorosamente i palloni 5-10 volte, e quindi aspirare al largo della CMF-HBSS. Risciacquare due volte con CMF-HBSS, e poi aggiungere 20 ml di media gliali.
       NOTA: Questo passaggio è fondamentale per garantire la rimozione di tipi di cellule non bersaglio, e non dovrebbe comportare la perdita delle astrociti desiderati.
   20. Sostituire con terreno gliale fresco due volte a settimana fino a quando le cellule sono confluenti (Figura 1).
2. congelamento glia
   1. Una volta che le colture sono confluenti, aspirare off medio e lavare il monostrato cellulare con 10 mL di CMF-HBSS.
   2. Aggiungere 10 ml di 0,25% tripsina / EDTA a ciascun pallone e incubare a 37 ° C per 3 min.
   3. Toccare fiaschi delicatamente per sloggiare le cellule. Aggiungere 1 ml BGS to ciascun pallone e trasferire le sospensioni cellulari in 15 provette ml.
   4. Centrifugare le provette a 130 xg per 6 min. Eliminare il surnatante risultante.
   5. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno gliale.
   6. Preparare il mezzo di congelamento gliale (1-parte dimetilsolfossido e 4-parti BGS). Aggiungere 0,5 ml di questa soluzione a ciascuno dei 4 fiale criogeniche per bombola.
   7. Trasferire 0,5 ml di sospensione cellulare per ogni fiala, e poi congelare le cellule lentamente ponendo i flaconi in un contenitore isolato in un congelatore C -80 ° durante la notte. Dopo un giorno, trasferire le fiale per un congelatore azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
3. Placcatura rivivere glia
   1. glia piastra 1-2 settimane prima del giorno cultura neurone.
   2. Preparare una provetta da 50 ml con 10 ml riscaldato medio gliale.
   3. Scongelare 1 fiala congelata di cellule gliali in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2-3 min.
   4. Trasferire il contenuto della fiala nella provetta da 50 ml contenente 10 ml di mezzo gliale.
   5. Centrifuge il tubo per 5 minuti a 130 xg ed aspirare il sopranatante.
   6. Risospendere il pellet in 20 mL di terreno gliale.
   7. Aggiungere 3 mL di terreno fresco gliali a ciascuna delle piastre di coltura (60 mm), e quindi trasferire 1 ml di sospensione cellulare per ogni piatto. Incubare le colture a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
   8. Nutrire le cellule due volte a settimana. Se la densità cellulare raggiunge% di confluenza 50 ben prima del giorno cultura neurone, passa a mezzo gliale contenente 5% BGS per rallentare il tasso di crescita gliale. La confluenza desiderato del monostrato gliali cultura neurone è del 50% - 70%.
   9. Sostituire il mezzo gliale con il mezzo NBG (6 mL / piatto) 1-2 giorni prima della cultura neurone.

3. Preparazione Coverslip

1. Pulizia e la preparazione di perline di paraffina
   1. Immergere coprioggetto in acido nitrico concentrato (70% p / p; ATTENZIONE: altamente corrosivo) e sonicare per 30 minuti a temperatura ambiente. Altri laboratori hanno found vantaggioso incubare i vetrini in acido nitrico 70% in scaffali ceramica 12-24 ore a temperatura ambiente invece.
   2. Eliminare attentamente l'acido nitrico in una cappa designata secondo le linee guida istituzionali. Lavare i coprioggetti 3-5 volte con acqua deionizzata.
   3. Immergere i coprioggetti in acqua deionizzata e sonicare nuovamente per 30 min (saltare se seguendo il metodo alternativo).
   4. Rimuovere l'acqua deionizzata e lavare i coprioggetti altre tre volte.
   5. Immergere i coprioggetti in 50 mL di acqua deionizzata e sterilizzare in autoclave. In alternativa, sterilizzare i coprioggetti a 225 ° C in un forno per 6 h. Se si utilizza questo approccio alternativo, passare al punto 3.1.9.
   6. Una volta autoclavato, trasferire i coprioggetti ad una cappa a flusso laminare sterile per le fasi successive.
   7. Rimuovere l'acqua deionizzata e risciacquare con 20-30 ml di etanolo al 100%.
   8. Aggiungere 20-30 ml di etanolo al 100% e trasferire i coprioggetti eetanolo da 100 mm piastra di Petri.
   9. Utilizzare pinzetta smussata per trasferire coprioggetti a 60 mm di Petri, 4-5 coprioggetto per piatto, e poi lasciare asciugare appoggiando i coprioggetti contro il bordo del piatto. Una volta che l'etanolo evaporato, porre i coprioggetti piano sulla superficie.
   10. Trasferire 10 g di paraffina ad un idoneo bottiglia di vetro termoresistente. Sciogliere la paraffina e mantenerla a circa 150-200 ° C su una piastra calda per almeno 1 ora. La temperatura ideale a cui deve essere riscaldata la paraffina può richiedere qualche ritocco. Le temperature non ideali possono portare a difficoltà a produrre la dimensione corretta delle perline di paraffina. Il periodo di attesa dopo la fusione aiuta a garantire la temperatura costante per tutto il liquido.
   11. Immergere una pipetta Pasteur in paraffina, e poi rapidamente toccarla a tre punti vicino al bordo di ogni vetrino (ogni punto essendo di circa 120 °). Le gocce si solidificano in perline alti di circa 0,3-0,5 mm e 1,0-2,0 mm di diametroeter e funziona per fornire uno spazio tra i neuroni sul vetrino e il monostrato gliali sotto (Figura 2).
   12. Sterilizzare i piatti sotto luce UV per 30 minuti, e poi coprire con un foglio di alluminio e conservare a temperatura ambiente. coprioggetto preparati possono essere memorizzati e utilizzati per un massimo di un mese. perle di paraffina dovrebbe essere consentito di rispettare i coprioggetti per almeno una settimana prima dell'uso. Questo consentirà di evitare la paraffina si stacchi durante i passaggi rimanenti del protocollo.
2. Coprioggetto rivestimento con Poli-L-lisina
   1. Ottenere piastre Petri contenenti coprioggetto precedentemente preparate con le perline di paraffina.
   2. Aggiungere 200 ml di poli-L-lisina in tampone borato alla superficie di ciascun coprioggetto e lasciare che la soluzione sedersi sul coprioggetto durante la notte, coperto, a temperatura ambiente. Rivestire la stessa superficie come quella su cui si trovano le perle di paraffina. Si noti che, se adeguatamente puliti, il poli-L-lisina dovrebbe diffondersi facilmenteper coprire la superficie del vetrino.
   3. Dopo un giorno, lavare i coprioggetti due volte immergendoli in acqua deionizzata sterile per 2 ore ogni volta. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire l'acqua con 4 ml di terreno di placcatura neuronale a piatto. Si noti che è importante che la superficie non coprioggetto lasciare asciugare dopo essere stato rivestito con poli-L-lisina.
   4. Porre le capsule contenenti coprioggetto a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore. Il coprioggetto rivestiti devono essere incubate per almeno 24 ore prima della coltura neurone. Questo viene fatto per innescare il mezzo per la cultura neurone.

4. dissezione di ippocampo e placcatura neuroni

1. Ottenere un ratto incinta (embrionale giorno 18-19, misurata dal giorno della scoperta spina vaginale) e eutanasia per decapitazione isoflurano anestetizzati o altro metodo approvato.
2. Spruzzare la parte inferiore del ratto con 70% di etanolo, e poi fare un'incisione della regione pubico through alla estremità della cavità addominale. Per evitare la contaminazione, fare attenzione a tagliare solo attraverso la pelle in questa fase.
3. Risciacquare gli strumenti di dissezione nuovo con etanolo al 70%, e poi tagliare attraverso la parete addominale per esporre l'utero. Rimuovere le due corna uterine e metterli in una sterile 100 millimetri Petri.
4. Eseguire i passaggi rimanenti in una cappa a flusso laminare. Rimuovere la membrana uterina circonda feti. li decapitate e posizionare le teste da 100 mm piastra di Petri contenente 20 mL CMF-HBSS.
5. Sezionare il cervello e immediatamente metterli in una capsula di Petri 60 millimetri contenente 2 mL CMF-HBSS su ghiaccio. Raccogliere solo 2-3 cervello per piatto per lasciare spazio sufficiente per il passaggio successivo.
6. Sotto un microscopio da dissezione spogliare meningi dalla linea mediana degli emisferi cerebrali, e poi sezionare le dell'ippocampo e metterli in una capsula di Petri 60 millimetri contenente 4,5 mL CMF-HBSS. Si noti che l'ippocampo può essere distinto come strut a forma di mezzalunature nella superficie mediale dell'emisfero corticale, ed è facile da rimuovere in quanto è delimitato lateralmente da un ventricolo.
7. Trasferire il tessuto dell'ippocampo raccolto e CMF-HBSS ad una provetta da 15 ml. Aggiungere 0,5 ml di 2,5% tripsina, e incubare a 37 ° C per 10 min. Papaina può essere usato al posto di tripsina perché è più delicato e può aumentare la resa.
8. rimuovere delicatamente la soluzione di tripsina da pipetta Pasteur, lasciando il tessuto dell'ippocampo indisturbati sul fondo della provetta.
9. lavare delicatamente il tessuto due volte con 5 mL di CMF-HBSS mentre incubazione è a 37 ° C per 5 min. Dopo il secondo lavaggio, portare il volume totale ad almeno 5 ml aggiungendo un volume sufficiente di CMF-HBSS al tessuto. Se ci sono ippocampi provenienti da più di 10 cuccioli, fino a 8 mL CMF-HBSS può essere aggiunto.
10. Preparare due varianti di pipette fuoco lucido per la dissociazione dei tessuti. La punta di una variante è del normale diametro della pipetta ma con i bordi levigati incendio lucidato. L'altra Variformica è uno con la punta di diametro ridotto della metà. esporre brevemente la punta di una pipetta Pasteur di vetro diagonalmente ad una sorgente di fiamma, e quindi esaminare le punte delle pipette.
    1. Ripetere questo passaggio finché il bordo punta era stato lisciato o il diametro è stato ridotto. È importante praticare per trovare il diametro ideale per garantire che il tessuto si dissocia per produrre cellule singole senza danneggiare queste cellule.
11. Triturare il tessuto ippocampali primo di circa 10 passa attraverso un normale vetro pipetta Pasteur buon taglio, e quindi un ulteriore 5 a 10 passa attraverso la pipetta con il diametro ridotto. L'obiettivo è quello di ottenere una soluzione omogenea di cellule senza o con qualche ciuffo di tessuto.
12. Determinare la densità delle cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Tipicamente, 0,8 e 1,0 milioni di cellule per cuccioli vengono ottenuti quando ippocampi dei due emisferi sono combinati.
13. Trasferire un volume sufficiente di sospensione cellulare per piatticontenenti coprioggetto poli-L-lisina rivestite in 4 mL placcatura mezzo per ottenere una densità di placcatura di 300.000 cellule per piastre da 60 mm. La densità delle celle può variare da 100.000 a 500.000, a seconda l'esperimento previsto.
14. Dopo 3-4 ore, trasferire i coprioggetti con neuroni attaccati ai piatti contenenti cellule gliali in terreno NBG. Questo dovrebbe essere fatto in modo tale che il lato in cui sono state piastrate i neuroni sia rivolta verso lo strato di cellule gliali. Aggiungere un totale di 4-5 vetrini per piastra glia.
15. Due o tre giorni dopo la placcatura, aggiungere la soluzione di Ara-C ad una concentrazione finale di 5 mM per ogni piatto di arrestare la crescita gliale.
16. Alimentare le cellule una volta alla settimana, sostituendo 2 mL del vecchio mezzo con 2,5 ml di mezzo fresco ad ogni pasto. Il mezzo supplementare aggiunto è per compensare l'evaporazione nel tempo, e solo una porzione del mezzo viene cambiato di assicurare la coerenza di condizionamento del fluido dalle cellule gliali. Queste culture sono in genere sani per almeno un mese (Figura 3). Neurone sopravvivenza può essere migliorata aggiungendo APV al mezzo di coltura ad una concentrazione finale di 100 pM. APV è un antagonista del recettore NMDA e promuove la sopravvivenza riducendo glutammato eccitotossicità.

Risultati

In questo metodo "sandwich" della coltura primaria di cellule nervose, neuroni dell'ippocampo (Figura 3) crescono su un letto di cellule gliali (Figura 1) separati da perline di paraffina (Figura 2). Questo assicura che i neuroni crescono selettivamente su vetrini con minima contaminazione delle cellule gliali ma ricevano un adeguato supporto trofico da glia crescente sul piatto di coltura tissutale. Tipicamente, i neuroni ...

Discussione

Mentre il metodo "sandwich" di neuroni in coltura è stata ben descritta-altrove ^{2, 11,} ci sono diversi passaggi in tutto il protocollo che sono molto difficili da descrivere in solo testo, che può portare alla frustrazione per gli investigatori che vogliono adottarlo.

Il metodo può essere suddiviso in tre grandi flussi di lavoro: cultura gliali, preparazione coprioggetto e cultura neurone e manutenzione. Ognuno dei tre prep...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumenti Dissection
Forbici per microdissezione	Roboz	RS-5910
Forbici a molla per micro dissezione	Roboz	RS-5650
Forbici a molla per microdissezione	Roboz	RS-5605
Dumont Pinze	Roboz	RS-5045
Dumont Pinze (#PP)	Roboz	RS-4950
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Preparazione dei tessuti
Tripsina (2,5%)	Gibco	15-090-046
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25-200-072
Portafiltro Swinnex, 25  mm	EMD Millipore	SX0002500	Utilizzato come filtro cellulare. Assemblare prima con filtro e autoclave
Isoflorane	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.
Emocitometro	Hausser Scientific	1492
Grado 105 Panno per la pulizia delle lenti	GE Healthcare	2105-841	Utilizzato come filtro cellulare. Assemblare prima nel portafiltro e nell'autoclave
Pipette in vetro Pasteur con filtro in cotone	VWR	14672-412
HEPES (1 M)	Gibco	15-630-080
Soluzione salina bilanciata di Hank senza calcio, magnesio, fenolo rosso (HBSS, 10x)	Gibco	14-185-052
Pipette in vetro	Pasteur VWR	14672-380
Desossiribonucleasi I da pancreas bovino (Dnase)	Sigma-Aldrich	DN25-100mg
Bruciatore di bunsen butano	Wall-Lenk Mfg. Co.	Centrifuga modello 65
	Eppendorf	5810R
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
>Coltura tissutale
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15-140-122
Piastra di Petri (100 mm)	Fisher	FB0875712
Piastra di Petri (60 mm)	Fisher	FB0875713A
Siero di cavallo	Gibco	16050-122	Può essere utilizzato al posto del BGS, ma ogni lotto deve essere testato a causa della variazione tra i lotti. Si raccomanda l'inattivazione termica del siero.
Idrossido di sodio	Fisher Scientific	S318-1
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	P2256
Terreno essenziale minimo (MEM)	Gibco	11-095-080
Terreno neurobasale	Gibco	21-103-049
L-Glutammina (200 mM)	Gibco	25-030-081
GlutaMAX Integratore	Gibco	35050061	Può essere utilizzato al posto della L-glutammina nel piatto di coltura del terreno NBG
(60 mm)	Corning, Inc	353002
Fiasche di coltura (75 cm^2)	Greiner Bio-One	658170
Cytarabine (Ara-C)	Sigma-Aldrich	C3350000
D-(+)-Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270
Siero per la crescita bovina (BGS)	HyClone	SH3054103	Si consiglia l'inattivazione del calore prima dell'uso.
Integratore di B27 (50x)	Gibco	17-504-044
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ml
Fiale criogeniche	VWR	89094-806
DL-2-Amino-5-acido fosfonipentanoico (APV)	Sigma-Aldrich	A5282
Nome	Azienda	Numero catalogo	Comments
Preparazione del vetrino coprioggetti
Tetraborato di sodio decaidrato (borace)	Sigma-Aldrich	B9876-1KG
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636
Histoplast Paraffin Wax Fisher		22-900-700
Forno a convezione a gravità	VWR	89511-404	Utilizzato per il metodo alternativo di pulizia del vetrino coprioggetto discusso nel protocollo
Bagno ad ultrasuoni (sonicatore)	Fisher Scientific	15337400
Anachemia	dell'acido nitrico	62786-460
Rack di colorazione in ceramica	Thomas Scientific	8542E40	Utilizzato per il metodo alternativo di pulizia del vetrino coprioggetto discusso nel protocollo
Vetrini coprioggetti	Glaswarenfabrik Karl Hecht  GmbH	1001/18	Il produttore è molto importante, poiché i neuroni non aderiscono bene al vetro di qualità inferiore
Acido borico	Sigma-Aldrich	B0252
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Varie
Filtri per siringhe sterili	VWR	28145-477	Utilizzato con siringa BD per siringa di sterilizzazione con filtro
	BD	302832	Utilizzato con i filtri per siringhe sterili VWR per la sterilizzazione a
bagno d'acqua	Fisher Scientific	15-460-16Q
Microscopio invertito	Olympus	CKX41
15 mL Provette da centrifuga sterili coniche	ThermoScientific	339650
Provette da centrifuga sterili coniche da 50 mL	ThermoScientific	339652