Articolo metodologico

Un metodo efficace per l'isolamento di RNA altamente purificato da semi per l'utilizzo in Quantitative Analysis trascrittoma

DOI:

10.3791/55008

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11 gennaio 2017

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1Laboratory of Biological Diversity, Department of Evolutionary Biology and Biodiversity, National Institute for Basic Biology, 2Department of Basic Biology, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies), 3Department of Cell Biology, National Institute for Basic Biology

In questo articolo

Sommario

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Siamo riusciti a stabilire un metodo per l'isolamento dell'RNA da semi di piante contenenti grandi quantità di oli, proteine e polifenoli, che hanno effetti inibitori sull'isolamento dell'RNA ad alta purezza. Il nostro metodo è adatto per monitorare l'espressione di geni con trascritti di basso livello nei semi.

Abstract

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I semi delle piante accumulano grandi quantità di riserve di stoccaggio che comprendono materia organica biodegradabile. Gli esseri umani fanno affidamento sulle riserve di stoccaggio delle sementi per il cibo e come materiali industriali. I profili di espressione genica sono strumenti potenti per studiare la regolazione metabolica nelle cellule vegetali. Pertanto, per la selezione delle colture sono necessari profili di espressione genica dettagliati e accurati durante lo sviluppo delle sementi. L'acquisizione di RNA altamente purificato è essenziale per la produzione di questi profili. Sono necessari metodi efficienti per isolare l'RNA altamente purificato dai semi. Qui, descriviamo un metodo per isolare l'RNA da semi contenenti grandi quantità di oli, proteine e polifenoli, che hanno effetti inibitori sull'isolamento dell'RNA ad alta purezza. Il nostro metodo consente di ottenere RNA altamente purificato dai semi senza l'uso di fenolo, cloroformio o processi aggiuntivi per la purificazione dell'RNA. Questo metodo è applicabile ai semi di Arabidopsis, colza e soia. Il nostro metodo sarà utile per monitorare i pattern di espressione di trascritti di basso livello in semi in via di sviluppo e maturi.

Introduzione

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Le piante producono semi, che danno origine alla generazione successiva. I semi accumulano grandi quantità di riserve di stoccaggio, come gli oli, carboidrati e proteine, per la crescita post-germinativo. Gli esseri umani utilizzano le riserve di stoccaggio di semi come fonti di alimenti e mangimi, e quindi semi di piante sono uno dei principali fornitori di materia organica commestibili in tutto il mondo. Aumentare le rese di semi è una sfida importante in scienza delle piante.

Poiché le riserve di riserva dei semi sono valore commerciale fonti di cibo e materiali industriali, i meccanismi molecolari alla base della regolazione del metabolismo di queste riserve sono stati ampiamente studiati 1-6. Ulteriori chiarire questi meccanismi sarà utile per aumentare le rese di semi di colture. I semi si sviluppano in ovaie di piante dopo la fecondazione, e maturano attraverso una serie di fasi di sviluppo 1,6,7. Inoltre la comprensione del meccanismo molecolare dello sviluppo del seme di base richiede dettagliata, Precisi profili di espressione genica di una serie di sviluppo semi da produrre. Tuttavia, elevate quantità di oli, proteine, carboidrati e polifenoli in semi di piante rendono difficile isolare RNA altamente purificato, che preclude precisa profili di espressione genica.

Qui, si introduce un metodo efficiente per l'isolamento di RNA da semi oleosi contenenti grandi quantità di oli, proteine ​​e polifenoli. Usando questo metodo, i ricercatori saranno in grado di preparare RNA altamente purificato. Tale RNA sarà utile per il monitoraggio dei cambiamenti trascrizionali di geni chiave che controllano la regolazione del metabolismo delle riserve di stoccaggio di semi in via di sviluppo e dei semi oleosi maturi.

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Protocollo

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1. Estrazione di RNA totale da Pianta semi

  1. Preparare i set di tampone, colonne di rotazione, 1,5 e 2,0 ml tubi di polipropilene, e tubi da 1,5 ml in polipropilene priva di nucleasi.
  2. Aggiungere 1% (w / v) di biologia molecolare grado polivinilpirrolidone (di seguito denominato PVP) per cella tampone di lisi per l'estrazione di RNA e vortice vigorosamente. Incubare per 20 minuti a 25 ° C per sciogliere completamente. Dopo 20 min di incubazione, miscelare il buffer delicatamente ruotando il tubo capovolto per evitare la formazione di bolle. Conservare a temperatura ambiente (15-25 ° C) prima dell'uso.
  3. Raccolta della frutta dalle piante di Arabidopsis thaliana e posto in provette da 1,5 ml in polipropilene su ghiaccio. Inserire frutta su lastre di alluminio conservati a 4 ° C ed isolano semi dai frutti sotto un microscopio stereo.
    1. Mettere i semi isolati (circa 200 semi) in provette da 1,5 ml in polipropilene che sono stati memorizzati in un rack di alluminio sul ghiaccio e collocare immediatamente i tubi in n liquidoitrogen.
  4. Rimuovere le provette e azoto liquido e restituirli al rack alluminio su ghiaccio. Aggiungere 100 microlitri di tampone contenente 1% PVP e centrifugare per 1 min a 1000 xga 4 ° C.
  5. Omogeneizzare il campione con un pestello in acciaio legato con un motore-smerigliatrice per 60 s, mantenendo il tubo nel rack alluminio su ghiaccio.
  6. Aggiungere 550 microlitri di tampone contenente 1% PVP, miscelare il buffer delicatamente ruotando il tubo capovolto, e incubare per 10 min a 25 ° C.
  7. Centrifugare per 5 min a 8000 xga 25 ° C ed il trasferimento 550 ml del surnatante in una nuova provetta 1,5 ml di polipropilene.
  8. Centrifugare per 5 min a 10.000 xga 25 ° C ed il trasferimento 450 ml del surnatante in una nuova provetta 1,5 ml di polipropilene.
  9. Utilizzare il surnatante come lisato cellulare per l'estrazione di RNA. D'ora in avanti, seguire la procedura descritta nelle istruzioni del produttore del kit disponibile in commercio.
  10. eluire ilRNA utilizzando un volume minimo di tampone di eluizione per garantire una sufficiente concentrazione di RNA per il monitoraggio dei pattern di espressione di trascritti di basso livello. Conservare il RNA in un congelatore fino all'uso.

2. Verifica di RNA Qualità

  1. Scongelare l'RNA totale, mescolare delicatamente intercettazioni, e porre il tubo in un rack di alluminio sul ghiaccio.
  2. Misurare la concentrazione di RNA, il rapporto A260 / A280, e il rapporto A260 / A230 utilizzando uno spettrofotometro microvolumi.
  3. Diluire il RNA totale in acqua priva di RNasi ad una concentrazione finale di 70 ng / mL.

3. trascrizione inversa di RNA totale da Seeds

  1. Scongelare gli RNA e tampone set totali dal kit commerciale. Mantenere gli enzimi del kit sul ghiaccio dopo lieve intercettazioni. Preparare le provette 0,2 ml in polipropilene priva di nucleasi.
  2. Aggiungere 5 ml di RNA totale, 1 ml di Oligo dT Primer (50 micron), e 1 micron di Random 6-mer (50 micron) al 0,2 ml polipropiTubo lene sul ghiaccio.
  3. Incubare per 15 minuti a 37 ° C e disporli sul ghiaccio.
  4. D'ora in avanti, seguire la procedura descritta nelle istruzioni del produttore nel kit di trascrizione inversa-PCR.
  5. Posizionare i prodotti di trascrizione inversa sul ghiaccio prima dell'uso.

4. Analisi quantitativa Real-time PCR

  1. Costruire plasmidi che ospitano le sequenze di geni bersaglio utilizzando il protocollo del produttore.
  2. Regolare le concentrazioni di 100-500,000 copie / ml per i modelli di DNA per le curve standard.
  3. Diluire le soluzioni cDNA (1: 100) con acqua distillata.
  4. Aggiungere 2 ml di soluzioni cDNA diluiti e plasmidi per le curve standard al master mix dal real-time PCR quantitativa kit.
  5. Impostare PCR in tempo reale utilizzando le seguenti condizioni di ciclismo: 95 ° C per 30 s e poi 40 cicli a 95 ° C per 5 s e 60 ° C per 35 s.
  6. Analizzare i numero di copie secondo l'uomoistruzioni di produttori di realizza- re per il sistema PCR in tempo reale.

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Risultati

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In primo luogo abbiamo studiato la concentrazione ottimale di PVP utilizzando Arabidopsis semi maturi. L'RNA totale è stato isolato da circa 1.000 semi secondo il protocollo descritto sopra utilizzando tampone di lisi cellulare contenente 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% o 2,0% PVP. Dopo omogeneizzazione e centrifugazione, il surnatante è stato raccolto evitando lo strato di olio di semi e detriti (Figura 1A).

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Discussione

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profili di espressione genica contribuiscono alla nostra comprensione della fisiologia vegetale; Pertanto, metodi di isolamento specifica di RNA sono stati sviluppati per ogni condizione di esempio 9-12. Abbiamo studiato i processi che sono stati inibiti durante l'isolamento di RNA dai semi e ha scoperto che l'RNA di legame alle membrane di silice è stato gravemente inibito. Grandi quantità di olio, proteine ​​e polifenoli inibiscono l'isolamento di RNA. Abbiamo modificato il processo di estrazion...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo lo staff di Genomica Funzionale Struttura e Spettrografia e Bioimmagini strumento, nibb fondamentali strutture di ricerca, e modello di ricerca delle piante Fondo, nibb Bioresource Center.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RNeasy Plant Mini KitQIAGEN74904
polivinilpirrolidoneSigma-AldrichP5288-100G
OMOGENEIZZATORE S-303AS ONE1-1133-02
NanoDrop LiteThermo ScientificND-NDL-US-CAN
Kit di reagenti PrimeScript RT (perfetto in tempo reale)TAKARARR037A
KAPA SYBR Kit qPCR veloceKapa biosystemsKK4601

Riferimenti

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  1. Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
  2. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
  3. Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
  4. Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
  5. Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
  6. Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
  7. Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
  8. Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
  9. Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
  10. Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
  11. Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
  12. Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).

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Isolamento dell RNAEstrazione di RNA da semiMetodo con tampone PVPRNA ad alta purezzaMetodo a colonna di centrifugazionePCR in tempo realeAnalisi spettrofotometricaSemi di piante oleaginoseSemi di Arabidopsis

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