Un metodo per misurare il metabolismo in Ordinati sottopopolazioni di cellule Comunità complessi utilizzando Stable Isotope Tracing

Summary

Questo articolo descrive un metodo per studiare il metabolismo cellulare in comunità complesse di più tipi di cellule, utilizzando una combinazione di tracciamento di isotopi stabili, smistamento cellulare per isolare specifici tipi di cellule e spettrometria di massa.

Abstract

I tipi di cellule dei mammiferi mostrano un metabolismo specializzato, e ci sono ampie prove che vari tipi di cellule coesistenti si impegnano nella cooperazione metabolica. Inoltre, anche le colture di un singolo tipo di cellula possono contenere cellule in stati metabolici distinti, come le cellule a riposo o in ciclo. I metodi per misurare le attività metaboliche di tali sottopopolazioni sono strumenti preziosi per comprendere il metabolismo cellulare. Le popolazioni cellulari complesse sono più comunemente separate utilizzando un selezionatore cellulare e le sottopopolazioni isolate con questo metodo possono essere analizzate con metodi metabolomici. Tuttavia, un problema con questo approccio è che la procedura di smistamento cellulare sottopone le cellule a stress che possono distorcere il loro metabolismo.

Per superare questi problemi, abbiamo ragionato che le distribuzioni di massa degli isotopomeri (MID) dei metaboliti provenienti da cellule coltivate con nutrienti marcati con isotopi stabili sono probabilmente più stabili delle concentrazioni assolute dei metaboliti, perché i MID si formano su scale temporali più lunghe e dovrebbero essere meno influenzati dall'esposizione a breve termine a condizioni di smistamento cellulare. Qui, descriviamo un metodo basato su questo principio, che combina la selezione cellulare con la cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS). La procedura prevede l'analisi di tre tipi di campioni: (1) estratti di metaboliti ottenuti direttamente dalla popolazione complessa; (2) estratti di cellule "finte selezionate" passate attraverso lo strumento di selezione cellulare senza gating di alcuna popolazione specifica; e (3) estratti delle popolazioni effettivamente selezionate. Le celle simulate selezionate vengono confrontate con l'estrazione diretta per verificare che i MID non vengano effettivamente alterati dalla procedura di smistamento delle cellule stessa, prima di analizzare le popolazioni effettivamente selezionate. Mostriamo esempi di risultati da cellule HeLa ordinate in base alla fase del ciclo cellulare, rivelando cambiamenti nel metabolismo dei nucleotidi.

Introduction

organismi superiori contengono comunità complesse di tipi cellulari diversi che collaborano per realizzare le funzioni più complesse. Ad esempio, i tumori contengono non solo le cellule cancerose, ma anche fibroblasti, cellule che costituiscono i vasi sanguigni e cellule immunitarie spesso infiltrati ^1; sangue contiene una miscela complessa di decine di sottotipi di cellule immunitarie ^2; e anche le linee cellulari in coltura possono consistere di più sottopopolazioni, come il lume e sottotipi basali delle cellule di carcinoma mammario ^3. Inoltre, tipi di cellule distinte che coesistono può esibi....

Protocol

1. Estrazione Metabolite

1. Estrazione da piatto
   1. cellule di coltura in una piastra da 6 pozzetti in triplicato in isotopi etichettato terreni di coltura stabile + supplementi dializzati (siero o altri integratori di crescita) fino a quando le cellule diventano il 75% confluenti.
      NOTA: Qui coltura cellule HeLa per 48 ore in RPMI contenente 40% di U- ¹³ C-glucosio e il 70% U ¹³ C, ¹⁵ N2-glutammina e 5% dializzato FBS (siero fetale bovino). Dializzato FBS viene usato per liberarsi dei piccoli metaboliti peso molecolare che possano contaminare i media etichettati. Si raccomanda coltura di cellule in ....

Results

Come esempio, qui si descrive un esperimento indagare il metabolismo delle cellule HeLa selezionati secondo fase del ciclo cellulare. Per etichettare una vasta gamma di metaboliti centrali su entrambi i carboni e atomi di azoto, abbiamo coltivato le cellule per 48 h utilizzando U- ¹³ C-glucosio e U- ¹³ C, ¹⁵ N-glutammina come traccianti. Per ottenere MID ricche per l'esperimento di validazione, abbiamo scelto qui una miscela di 40% U- ¹³ C-gluc.......

Discussion

Il nostro metodo si basa sul principio che MIDs in metaboliti cellulari riflettono la "storia" delle attività metaboliche di una cella. Questo rende possibile indagare attività metaboliche in sottopopolazione di cellule, come si è verificato nel complesso comunità di cellule, prima della procedura di cell sorting. Al contrario, le aree di picco di metaboliti differiscono notevolmente tra estratti di cellule ordinati e estrazione diretta dal piatto della cultura ^11. In parte ciò è dovuto.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H6648
INFLUX (inFlux v7 Sorter)	BD Biosciences
U-13C-Glucosio	Isotopi Cambridge	40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-Glutammina	Isotopi Cambridge	CNLM-1275-H-0.1
Metanolo (JT Baker), grado HPLC	VWR	BAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV. Durapore PVDF 0,1 µ m	Millipore	UFC30VV00
Ultimate 3.000 UHPLC	Thermo Fisher Spettrometro di
	Thermo Fisher scientific
Merk-Sequant ZIC HILIC (150 mm x 4,6  mm, 5 µ m)	Merck KGaA	1.50444.0001
Merk-Sequant ZIC HILIC colonna di protezione (20 mm x 2,1 mm)	Merck KGaA
Acetonitrile Optima LC-MS, vetro ambrato	Fisher Scientific	A955-212
Milli-Q acqua	Millipore		Prodotto con un sistema a gradiente Milli-Q
Myrsyra 99,5% Optima (acido formico)	Fisher Scientific	11423423
X100 Fiala a vite 1,5 ml, 8-425 32x11,6 mm, ambra, 100 unità	Thermo Fisher scientific	10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Imballaggio 8-425 (tappi a vite)	Thermo Fisher scientific	12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix	Sigma-Aldrich	MSCAL5	Kit di calibrazione
SNAKESKIN 10K MWCO	Thermo Fisher scientific	88245
Mathematica v.10			Wolfram