Un metodo per misurare il metabolismo in Ordinati sottopopolazioni di cellule Comunità complessi utilizzando Stable Isotope Tracing

Irena Roci; Hector Gallart-Ayala; Jeramie Watrous; Mohit Jain; Craig E. Wheelock; Roland Nilsson

doi:10.3791/55011

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Articolo metodologico

Un metodo per misurare il metabolismo in Ordinati sottopopolazioni di cellule Comunità complessi utilizzando Stable Isotope Tracing

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DOI:

10.3791/55011

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4 febbraio 2017

Irena Roci¹^,² , Hector Gallart-Ayala³ , Jeramie Watrous⁴ , Mohit Jain⁴ , Craig E. Wheelock³ , Roland Nilsson¹^,²

¹Department of Medicine, Unit of Computational Medicine, Karolinska Institutet, ²Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, ³Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Division of Physiological Chemistry 2, Karolinska Institutet, ⁴Department of Medicine, University of California San Diego

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive un metodo per studiare il metabolismo cellulare in comunità complesse di più tipi di cellule, utilizzando una combinazione di tracciamento di isotopi stabili, smistamento cellulare per isolare specifici tipi di cellule e spettrometria di massa.

Abstract

I tipi di cellule dei mammiferi mostrano un metabolismo specializzato, e ci sono ampie prove che vari tipi di cellule coesistenti si impegnano nella cooperazione metabolica. Inoltre, anche le colture di un singolo tipo di cellula possono contenere cellule in stati metabolici distinti, come le cellule a riposo o in ciclo. I metodi per misurare le attività metaboliche di tali sottopopolazioni sono strumenti preziosi per comprendere il metabolismo cellulare. Le popolazioni cellulari complesse sono più comunemente separate utilizzando un selezionatore cellulare e le sottopopolazioni isolate con questo metodo possono essere analizzate con metodi metabolomici. Tuttavia, un problema con questo approccio è che la procedura di smistamento cellulare sottopone le cellule a stress che possono distorcere il loro metabolismo.

Per superare questi problemi, abbiamo ragionato che le distribuzioni di massa degli isotopomeri (MID) dei metaboliti provenienti da cellule coltivate con nutrienti marcati con isotopi stabili sono probabilmente più stabili delle concentrazioni assolute dei metaboliti, perché i MID si formano su scale temporali più lunghe e dovrebbero essere meno influenzati dall'esposizione a breve termine a condizioni di smistamento cellulare. Qui, descriviamo un metodo basato su questo principio, che combina la selezione cellulare con la cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS). La procedura prevede l'analisi di tre tipi di campioni: (1) estratti di metaboliti ottenuti direttamente dalla popolazione complessa; (2) estratti di cellule "finte selezionate" passate attraverso lo strumento di selezione cellulare senza gating di alcuna popolazione specifica; e (3) estratti delle popolazioni effettivamente selezionate. Le celle simulate selezionate vengono confrontate con l'estrazione diretta per verificare che i MID non vengano effettivamente alterati dalla procedura di smistamento delle cellule stessa, prima di analizzare le popolazioni effettivamente selezionate. Mostriamo esempi di risultati da cellule HeLa ordinate in base alla fase del ciclo cellulare, rivelando cambiamenti nel metabolismo dei nucleotidi.

Introduzione

organismi superiori contengono comunità complesse di tipi cellulari diversi che collaborano per realizzare le funzioni più complesse. Ad esempio, i tumori contengono non solo le cellule cancerose, ma anche fibroblasti, cellule che costituiscono i vasi sanguigni e cellule immunitarie spesso infiltrati ^1; sangue contiene una miscela complessa di decine di sottotipi di cellule immunitarie ^2; e anche le linee cellulari in coltura possono consistere di più sottopopolazioni, come il lume e sottotipi basali delle cellule di carcinoma mammario ^3. Inoltre, tipi di cellule distinte che coesistono può esibi....