Levitazione magnetica Accoppiato con Imaging portatile e analisi per la malattia di diagnostica

Sommario

Presentiamo una tecnica di levitazione magnetica accoppiata con imaging e analisi automatizzate sia in un dispositivo compatibile con smartphone che in un dispositivo con imaging ed elaborazione incorporati. Questo viene applicato per misurare la distribuzione della densità delle cellule con due applicazioni biomediche dimostrate: la diagnosi dell'anemia falciforme e la separazione dei globuli bianchi e rossi.

Abstract

Attualmente, molte procedure diagnostiche cliniche sono complesse, costose, inefficienti e inaccessibili a una vasta popolazione nel mondo. I requisiti di attrezzature specializzate e personale addestrato richiedono che molti test diagnostici vengano eseguiti presso laboratori clinici remoti e centralizzati. La levitazione magnetica è una tecnica semplice ma potente e può essere applicata alle celle di levitazione, che sono sospese in una soluzione paramagnetica e poste in un campo magnetico, in una posizione determinata dall'equilibrio tra una forza magnetica e una forza di galleggiamento. Qui presentiamo una piattaforma versatile progettata per la diagnostica point-of-care che utilizza la levitazione magnetica accoppiata all'imaging microscopico e all'analisi automatizzata per determinare la distribuzione della densità delle cellule di un paziente come utile indicatore diagnostico. Presentiamo due piattaforme che operano secondo questo principio: (i) una versione compatibile con smartphone della tecnologia, in cui la fotocamera integrata dello smartphone viene utilizzata per visualizzare le celle nel campo magnetico e un'applicazione per smartphone elabora le immagini e per misurare la distribuzione della densità delle celle e (ii) una versione autonoma in cui una scheda della fotocamera viene utilizzata per acquisire le immagini e un'unità di elaborazione incorporata con schermo TFT (Thin-Film Transistor) collegato misura e visualizza i risultati. Le applicazioni dimostrate includono: (i) la misurazione della distribuzione alterata di una popolazione cellulare con un fenotipo di malattia rispetto a un fenotipo sano, che viene applicata alla diagnosi dell'anemia falciforme, e (ii) la separazione di diversi tipi di cellule in base alle loro densità caratteristiche, che viene applicata per separare i globuli bianchi dai globuli rossi per la citometria dei globuli bianchi. Queste applicazioni, così come le future estensioni delle misure essenziali basate sulla densità abilitate da questa tecnologia di piattaforma portatile e facile da usare, miglioreranno significativamente le capacità diagnostiche delle malattie presso il punto di cura.

Introduzione

Qui, presentiamo una piattaforma tecnologica e una tecnica che utilizza la levitazione magnetica accoppiata con imaging e analisi automatizzata per analizzare la distribuzione della densità delle cellule del paziente come indicatore per la malattia. Questo approccio versatile per l'analisi di citometria di densità basata in ultima analisi può essere applicata a una vasta gamma di diagnostica delle malattie. Tuttavia, al fine di essere compatibile con i test point-of-care e l'uso in paesi in via di sviluppo, la tecnica deve soddisfare le esigenze di basso costo, portabilità e usabilità. Il dispositivo e consumabili devono essere ottenuti facilmente a basso costo. La preparazione del campione deve essere semplice, analisi dovrebbe essere automatizzato con i requisiti minimi per l'input dell'utente o di interpretazione, ed i risultati devono essere restituiti rapidamente. Inoltre, il dispositivo deve essere compatto e portatile per essere utile in situazioni cliniche così come i paesi in via di sviluppo. Così, abbiamo sviluppato un dispositivo e il metodo da utilizzare levitazione magnetica in point-of-care-compatibile TECHNOLlogia per accoppiamento automatico imaging e immagine analisi per restituire risultati per quanto riguarda la distribuzione della densità di una popolazione di cellule del paziente.

Point-of-care tecnologie offrono una notevole vantaggio rispetto attuali procedure di test clinici di laboratorio. La tecnologia attualmente disponibile è troppo costosi per essere posseduta dal medico o troppo complesso per essere effettuata da personale medico. Molte di queste procedure richiedono protocolli alta intensità di lavoro, che devono essere effettuate da un tecnico qualificato. Per queste ragioni, i campioni dei pazienti come il sangue o nelle urine sono generalmente raccolti in ufficio del medico poi trasferito in un laboratorio di analisi centralizzata a distanza per la sperimentazione clinica, che può richiedere diversi giorni per il medico per ricevere i risultati del test. Ciò può causare ritardi o complicazioni nel corso del trattamento, in alcuni casi, rende questo test molto costoso e inefficiente (causando un onere finanziario contribuenti assicurazione), e rende ulteriormente moltidiagnostica inaccessibili in ambienti con scarsa risorsa e nei paesi in via di sviluppo.

Qui, presentiamo una tecnica levitazione magnetica accoppiata con l'imaging automatizzato e analisi sia un dispositivo con immagini embedded e trasformazione (figura 1) ed un dispositivo smartphone compatibile (Figura 2). Questi dispositivi levitazione basati magnetici rappresentano una piattaforma tecnologica ampiamente applicabile, che ha il potenziale di essere applicata ad una gamma di diverse applicazioni diagnostiche mediche. Le funzioni magnetici approccio levitazione basati su un equilibrio tra due forze: una forza magnetica e una forza di galleggiamento ^{1, 2, 3.} Quando una particella viene sospesa in un mezzo paramagnetico e inserito in un campo magnetico generato da due magneti con poli come fronte all'altro, una forza agisce magnetica sulla particella nella direzione verso la linea centrale tra i due magn ETS. La forza di galleggiamento è causato dalla densità relativa della particella rispetto al mezzo di sospensione ed è alto nel caso di particelle meno dense rispetto alla media e verso il basso nel caso di particelle più dense del mezzo circostante. Sulla base di queste due forze, particelle raggiungono una posizione di equilibrio levitazione nel campo che equilibra queste due forze; questa posizione è direttamente correlata alla densità della particella, con particelle più dense levitare inferiore nel campo di particelle meno dense. Un modulo di imaging, sia incorporato smartphone telecamera ^{4, 5, 6} o componenti ottici indipendenti dotati di una lente di ingrandimento ^{7, 8,} vengono utilizzati per visualizzare le posizioni delle particelle. L'elaborazione delle immagini, sia attraverso una applicazione per smartphone ^{4, 5,}= "xref"> 6 o un'unità di elaborazione incorporato ^{7, 8,} quindi elabora le immagini catturate per quantificare la distribuzione spaziale e, di conseguenza, la distribuzione della densità della popolazione. Per analizzare campioni più grandi (come quelli con solo poche particelle di interesse per millilitro, il flusso può essere integrato direttamente nel dispositivo di tali particelle rimangono sospesi ed analizzato che passano attraverso la regione di imaging (Figura 2).

Figura 1: Self-contained piattaforma levitazione magnetica. (A) un dispositivo di levitazione magnetica compatto con un modulo magnetico focalizzazione, componenti di imaging (un diodo (LED emettitori di luce), una lente ottica, e un rivelatore fotocamera), ed un'unità di elaborazione con uno schermo di visualizzazione. (B) l'intensità del campo magnetico nella cross-sezione dell'area tra i magneti in cui viene inserito il campione. L'intensità del campo è massima in corrispondenza della superficie dei magneti e si avvicina a zero in corrispondenza della mezzeria tra loro. (C) Particelle, come le cellule, nei magnetico esperienza campo diverse forze: una forza magnetica (F _m) verso l'asse tra magnetismo, con ampiezza variabile in base alla posizione della particella; una forza gravitazionale (F _g '), che dipende dalla densità delle particelle rispetto a quella del mezzo di sospensione, e una forza di trascinamento (F _d) resistendo moto delle particelle. Riprodotto, con il permesso, da Yenilmez, et al. ⁸ Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figuraure 2: compatibile con Smartphone Flow-assistita piattaforma levitazione magnetica. (A - c) anteriore (a), laterale (b), e viceversa (c) vista dispositivo magnetico di levitazione (d) I componenti del dispositivo includono: 1) Modulo di levitazione magnetica, compresi magneti permanenti, una lente di ingrandimento, e un diffusore a LED e luce, 2) caso smartphone, 3) l'elettronica, tra cui un microcontrollore, autista pompa, e il ricevitore Bluetooth, 4) porta micro-pompa, 5) orifizio regolabile, 6) supporto tubo di scarico, 7) porta-batteria, 8 ) supporto del campione, 9) supporto dual-purpose e la copertura. (E) di flusso schematico che mostra pompaggio del campione attraverso il campo magnetico. (F) Sezione del modulo levitazione magnetica, che mostra come le particelle di densità diverse saranno allineati come sono pompati attraverso il campo; meno dense di particelle, come ad esempio particelle 1, sarà equilibrare a una maggiore altezza di levitazione than particelle più dense, come particelle 2. riprodotto, con il permesso, da Amin, et al. ¹ Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

I requisiti minimi relativi all'uso di qualsiasi campione per analisi distribuzione di densità di questo sistema includono la capacità di ottenere una sospensione di cellule o particelle maggiori di circa 5 micron e meno di circa 250 micron di dimensione (per l'imaging e di elaborazione delle immagini) e la sua compatibilità con miscelazione in soluzione di una soluzione paramagnetico come il gadobutrolo usato qui. Per la diagnosi di malattie, applicazioni compatibili includono quelli in cui (i) cellule di interesse ha intrinsecamente una densità alterata quando realizzano una malattia rispetto ai controlli sani, (ii) un cambiamento di densità può essere indotta nella cella mediante aggiunta di un reagente o qualche trattamento alternativo per un brevetempo cubation, o (iii) diversi tipi cellulari sono stati identificati in un singolo campione e intrinsecamente (o attraverso trattamento) hanno densità caratteristiche uniche.

L'anemia falciforme è una malattia genetica che causa una forma mutata di emoglobina, HbS, ad essere prodotto nei globuli rossi di una persona (RBC), che può causare intermittenti eventi vaso-occlusivi e anemia emolitica cronica ^9. Esso viene diagnosticata utilizzando emoglobina isoelettrofocalizzazione, cromatografia liquida ad alta prestazione elettroforesi (HPLC) di frazionamento o di emoglobina che sono estremamente preciso, ma deve essere eseguita in un laboratorio di analisi cliniche, perché sono incompatibili con le impostazioni point-of-care. Solubilità e test a base di carta per anemia falciforme sono stati proposti, ma in genere richiedono interpretazione utente soggettiva e test di conferma. Qui, usiamo un approccio di densità a base di identificare i globuli rossi falciformi, che raggiungere una densità maggiore di RBCs da persone senza anemia falciforme. Il meccanismo prevede polimerizzazione della forma mutata di emoglobina, HbS, che provoca RBC disidratazione falce globuli rossi malattie cellula in condizioni deossigenate ^{10, 11, 12, 13.}

Questo approccio densità basato può essere applicato anche per separare le cellule di tipo diverso sulla base della densità: globuli bianchi (WBC) e RBC ^7. Leucociti sono generalmente responsabile per combattere le infezioni nel corpo. WBC citometria può essere usata per quantificare il numero di queste cellule nel sangue e serve come un utile strumento diagnostico. WBC conta più alto del normale (generalmente considerata superiore a 11.000 cellule per mL) possono indicare infezioni, disturbi del sistema immunitario, o leucemia. WBC conta al di sotto del range di normalità (circa 3.500 cellule per mL) possono essere causati da malattie autoimmuni o Conditioni che danni del midollo osseo. A differenza delle tecnologie alternative, il processo qui presentato non si basa su lisi dei globuli rossi o macchie per identificare globuli bianchi. Questo test cell-based sfrutta le densità intrinseche uniche dei due tipi di cellule di eseguire la separazione, come la densità di popolazione WBC è stato segnalato per essere inferiore a quello della popolazione RBC calcolato precedentemente con gradiente di densità centrifugazione ^{2, 3.}

Rispetto ai test alterative in posizioni remote, questo test è rapido, con semplice preparazione del campione (figura 3), la separazione delle cellule nel dispositivo in 10 - 15 min, imaging e analisi automatizzata che richiede meno di 1 min. In questo modo, il dispositivo può restituire risultati rapidamente per informare meglio le decisioni mediche, permettere un trattamento da somministrare immediatamente per alleviare il dolore fisico e psicologico, e ridurre il rischio di complicanze Associated con un ritardo nelle cure mediche. Questa tecnica può essere eseguita sul posto sia in ambito clinico causa di semplice preparazione del campione e di imaging automatizzati e analisi che restituisce un risultato con il minimo input dell'utente o interpretazione. A causa dell'uso di un approccio semplice mediante magneti permanenti per l'analisi del campione e l'utilizzo della propria smartphone o componenti elettrici semplici per l'imaging e di elaborazione delle immagini, il dispositivo così come i costi per test sono minime rispetto ad alcune procedure di test sofisticati.

Protocollo

Dichiarazione etica: Tutte le procedure che coinvolgono campioni di sangue umano sono state effettuate secondo le norme istituzionali. Tutti i protocolli sono stati esaminati e approvati dal Institutional Review Board. Un consenso informato è stato dato da tutti i partecipanti.

Preparazione 1. Esempio per anemia falciforme Diagnosi ^{5, 8}

1. Preparare una soluzione 50 mm di gadobutrolo in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS).
2. Sciogliere 10 mM sodio metabisolfito nella soluzione gadolinio.
   NOTA: metabisolfito di sodio è tossico per inalazione e fortemente irritante per la pelle e dei tessuti. È un acido corrosivo in miscela con acqua. Si può decomporsi emettere fumi tossici di ossidi di zolfo e sodio quando riscaldato ad alta temperatura.
3. Ottenere campione di sangue sia tramite polpastrello o prelievo venoso.
   1. Prelevare il sangue con un pungidito con un panno pulito Lancet, usa e getta. Appressione ply nei pressi del sito trafitto e pulire la goccia di sangue formata da tre a quattro volte prima di raccogliere il sangue con una pipetta; fare attenzione a non "latte" il dito comprimendo il tessuto, in modo da provocare la contaminazione del campione con tessuto fluido.
   2. In alternativa, prelevare il sangue con procedure di venipuntura standard di ^14.
      NOTA: Se i campioni saranno conservati per più di un paio d'ore, raccogliere il sangue in un Vacutainer con un anticoagulante, come EDTA.
4. Aggiungere meno di 1 ml di sangue per 100 ml di soluzione di metabisolfito di sodio gadolinio.

2. Preparazione del campione per la WBC citometria a ⁷

1. Ottenere campione di sangue sia tramite dito o prelievo venoso, come nella sezione 1.
2. Optional: Lyse globuli rossi con un tampone di lisi RBC. Pipettare 5 ml di sangue in 500 ml di tampone di lisi RBC e incubare a temperatura ambiente per 3-5 min.
   NOTA:ciò può essere fatto per confermare la gamma levitazione di una popolazione isolata di globuli bianchi. Tuttavia, non è necessario eseguire questo passaggio, i risultati qui presentati dimostrano che globuli rossi levitare in una posizione nettamente inferiore leucociti.
3. Diluire sangue intero 1: 1.000 in 25 mM Gd in HBSS
   NOTA: se è stata eseguita la lisi cellulare, diluire il campione lisato 9: 1 campione lisato: 250 mM Gd di ottenere un campione contenente 25 mM Gd.

3. Analisi di campioni che utilizzano la piattaforma di levitazione magnetica ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Avviare il dispositivo di levitazione magnetica:
   1. Per il dispositivo self-contained, collegare il dispositivo, permettono di accendere, e posto su una superficie piana.
   2. Per la versione smartphone compatibile, avviare l'applicazione per smartphone e scorrere a sinistra per entrare immaginemodalità di cattura, e posto su una superficie piana.
2. Per levitazione magnetica statica:
   1. Caricare il campione preparato in un microcapillare vetro quadrato immergendo l'estremità nella soluzione e consentendo il campione per riempire il capillare tramite azione capillare.
   2. Sigillare l'estremità con un sigillante tubo spingendo lentamente una estremità del capillare nel materiale.
   3. Inserire il capillare tra i magneti del dispositivo di levitazione magnetica in modo che solo 1 cm del tubo rimane visibile (si veda la Figura 3 per un'illustrazione la preparazione del campione).
      NOTA: Questo passaggio rimane la stessa sia per il dispositivo compatibile con lo smartphone e autosufficiente.
   4. Attendere 10 min senza disturbare il dispositivo o il capillare.
3. Per levitazione magnetica flow-assistita:
   1. Caricare il campione nella provetta.
   2. Collegare il tubo di ingresso tra il contenitore del campione e microcapillary e collegare il tubo di uscita tra il microcapillare e contenitore di rifiuti.
   3. Impostare i parametri di intensità e portata a LED.
4. Assicurarsi che le cellule sono visibili nel campo visivo, premere il pulsante di acquisizione per acquisire un'immagine (pulsante 3 sul dispositivo autonomo e il pulsante della fotocamera sulla parte inferiore della schermata nell'applicazione smartphone).
   NOTA: Se si utilizza una porta USB per archiviare le immagini, creare una cartella chiamata "immagini" e inserire il cavo USB prima di accendere il dispositivo. Se nessuna unità è presente, il dispositivo memorizza le immagini nella sua memoria interna e trasferito in seguito.
   NOTA: Diverse immagini possono essere catturate e analizzati per ridurre il rischio di anomalie spostando il capillare dentro o fuori circa ½ cm tra cattura delle immagini.
   NOTA: Se il numero di cellule all'interno del campo visivo è troppo alta o troppo bassa (come rilevato e segnalato sull'interfaccia utente), spostare il capillare in o fuori del dispositivo o preparare un altro sample.
5. Rimuovere il campione e scartare il campione secondo le norme istituzionali o locali. Capillari devono essere smaltiti come un forte.

Figura 3: Preparazione del campione e interfaccia utente. (A) La procedura di preparazione del campione comporta pungidito dito del soggetto, formando una gocciolina di sangue, trasferendo la goccia di sangue per la soluzione di test del campione, agitando il campione e il caricamento in un tubo capillare tramite azione capillare, e inserendo il campione nella levitazione magnetica dispositivo. (B) Queste fasi di preparazione del campione vengono visualizzati anche sullo schermo del dispositivo per guidare la preparazione del campione. (C) Il dispositivo include quattro pulsanti: un pulsante per lo zoom nell'immagine di esempio, al fine di regolare correttamente la messa a fuoco utilizzando la manopola di regolazione; un pulsante per ottenere un singolo measurement (a 5 s ritardo viene implementata per consentire il tempo per l'utente di inserire il campione); una misura di time-lapse (6 immagini sono prese a intervalli di 5 s); e un pulsante per spegnere il dispositivo dopo l'uso. Riprodotto, con il permesso, da Yenilmez, et al. ⁸ Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

4. Image Analysis ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Eseguire il software di analisi di immagine incluso nel dispositivo per il campione appropriato (distribuzione cellulare o tipo cellulare di separazione).
   NOTA: Per il dispositivo autonomo, l'analisi viene eseguita automaticamente e visualizzato sull'interfaccia utente grafica. Per il dispositivo smartphone compatibile, per eseguire l'analisi, andare alla galleria di unND selezionare il file video desiderato da analizzare.
2. Osservare e registrare l'uscita dell'analisi visualizzata sullo schermo.
   NOTA: Per l'analisi della distribuzione delle cellule (ad esempio falce diagnosi malattia a cellule), l'uscita sarà la larghezza del confinamento della popolazione cellulare.
   NOTA: Per il tipo di cellule di separazione (quali l'identificazione WBC), l'uscita sarà un'immagine con la popolazione WBC identificato. Per calcolare il numero di cellule per microlitro, moltiplicare il numero medio di leucociti per immagine di un fattore 2.000. Ad esempio, se sono stati osservati 5 leucociti, questo indicherebbe 10.000 leucociti / ml. Il range di normalità è generalmente considerato come 3.500 - 11.000 leucociti / ml.
3. Ripetere l'analisi spostando il tubo campione dentro o fuori del dispositivo di circa ½ cm e catturare un'altra immagine da analizzare come descritto sopra.
   NOTA: Si consiglia di ripetere l'analisi 5 - 6 volte per campione per evitare errori.

Risultati

Per l'analisi della distribuzione della densità delle cellule, che è la tecnica usata per la diagnosi della malattia falce cella, lo scopo è di individuare la larghezza della distribuzione della popolazione cellulare. Cellule del sangue da pazienti senza anemia falciforme saranno confinati all'interno di una larghezza prevedibile. Le cellule da pazienti con anemia falciforme saranno distribuiti in tutta una regione più ampia, con una inclinazione verso il basso nella distribuzione delle ...

Discussione

I passaggi critici all'interno del protocollo
Fattori critici in questo processo includono il corretto allineamento dei magneti. Se i magneti diventano sloggiato o separati più del normale all'interno del dispositivo, questo può influenzare i risultati. Per controllare questo guasto o altri nel processo, una particella di densità controllata, ad esempio microsfere di polistirene, può essere utilizzato periodicamente per controllare le variazioni nel tempo. Inoltre, il tempo di levitazione è importante per...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contiene 1M gadobutrol, un chelato di gadolinio. Abbiamo acquistato fiale da 2 ml con 15/ca.
Tubi microcapillari quadrati in vetro	Vitrocom	8270	50 mm di lunghezza è sufficiente
Metabisolfito di sodio	Sigma-Aldrich	S9000	Formula chimica: Na2S2O5
Leica Microsystems Sigillante per tubi Critoseal	Fisher Scientific	02-676-20
Soluzione salina	bilanciata di HankSigma-Aldrich	H9269  SIGMA
Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	O altro reagente come raccomandato per il tipo di cellula utilizzata
Dispositivo pungidito regolabile MICROLET 2	Walgreens	246567	Qualsiasi pungidito è accettabile se utilizzato secondo i protocolli di biosicurezza
Microlet Lancets	Walgreens 667474		Deve essere smaltibile e non riutilizzato
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	O qualsiasi metodo preferito per il conteggio cellulare
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201