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Articolo metodologico

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in

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DOI:

10.3791/55024

⸱

17 marzo 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Zoology, Albertus-Magnus University of Cologne, 2Department of Veterinary Biomedical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

In questo articolo

Sommario

Il test CApillary FEeder (CAFE) è un metodo semplice, economico e altamente affidabile per studiare i meccanismi alla base dell'assunzione di cibo. Utilizzato con l'organismo modello genetico altamente versatile Drosophila melanogaster, fornisce un potente mezzo per acquisire nuove informazioni sui meccanismi di regolazione dell'assunzione di cibo.

Abstract

Per la maggior parte degli animali, l'alimentazione è un comportamento essenziale per garantire la sopravvivenza e influenza lo sviluppo, la locomozione, la salute e la riproduzione. L'ingestione del giusto tipo e quantità di cibo ha quindi una grande influenza sulla qualità della vita. La ricerca sul comportamento alimentare si concentra sui processi sottostanti che assicurano l'alimentazione effettiva e svela il ruolo dei fattori che regolano l'omeostasi energetica interna e le basi neuronali del processo decisionale. L'organismo modello Drosophila melanogaster, con la sua grande varietà di strumenti geneticamente tracciabili per l'etichettatura e la manipolazione di singoli neuroni, consente la mappatura delle reti neuronali e l'identificazione di cascate di segnalazione molecolare coinvolte nella regolazione dell'assunzione di cibo. Questo rapporto dimostra il test CApillary FEeder (CAFE) e mostra come misurare l'assunzione di cibo in un gruppo di mosche per intervalli di tempo che vanno da ore a giorni. Questo test di facile utilizzo è costituito da capillari di vetro riempiti con cibo liquido a cui le mosche possono accedere liberamente e di cui possono nutrirsi. Il consumo di cibo nel test viene determinato con precisione utilizzando semplici strumenti di misurazione. Qui descriviamo passo dopo passo il metodo dalla messa a punto alla corretta esecuzione del saggio CAFE e forniamo esempi pratici per analizzare l'assunzione di cibo di un gruppo di mosche in condizioni controllate. Il lettore viene guidato attraverso i possibili limiti del test e vengono valutati i vantaggi e gli svantaggi del metodo rispetto ad altri test di alimentazione in D. melanogaster.

Introduzione

Mangiare è essenziale; tuttavia, la deregolamentazione di assunzione di cibo con conseguente disturbi alimentari come la bulimia, l'anoressia o la tendenza generale a mangiare troppo impone costi sugli individui e sulla società 1, 2, 3. L'obiettivo della presente ricerca è quello di scoprire meccanismi di regolazione dell'assunzione di cibo e di fornire una strategia per eludere la formazione di disturbo. Numerosi studi che utilizzano organismi modello mammiferi hanno fornito nuove intuizioni del circuito e il ruolo dei sistemi di segnalamento in disturbi alimentari 4, 5, 6. Tuttavia, la nostra conoscenza delle basi neuronali e molecolari alla base di questi disturbi è lungi dall'essere completa. Negli ultimi anni, la mosca della frutta Drosophila melanogaster è diventato un sistema modello valido per svelare intuizioni meccanicistici di base nella regolamentazione dei metabolism 7, 8, 9. Il test capillari alimentatore (CAFE) per Drosophila melanogaster è stato istituito nel laboratorio di Seymour Benzer nel 2007 ispirato da un precedente lavoro di Dethier in blowfly 10, 11. Il saggio CAFE ha permesso di misurare direttamente l'assunzione di cibo in Drosophila melanogaster. In questo sistema di test comportamentali, le mosche si nutrono di alimenti liquidi forniti nei capillari di vetro graduati posti all'interno di un flaconcino. Il declino del menisco capillare indica la perdita della soluzione di alimentare attraverso l'evaporazione e il consumo di cibo. La determinazione del tasso di evaporazione da fiale senza linea consente la quantificazione accurata di assunzione di cibo.

Il saggio Café è uno dei diversi paradigmi comportamentali utilizzati per misurare l'alimentazione in Drosophila melanogaster e ricercatori devono scegliere quello più appropriato per la loro specificadomanda. La decisione di utilizzare un certo dosaggio devono considerare i seguenti punti: la natura del cibo fornito; la condizione di alimentazione; la misura di assunzione o l'assorbimento delle sostanze nutritive e consumo di cibo indagini o risposta al cibo.

Il saggio CAFE, come descritto in questo rapporto è ideale per seguire l'assunzione di cibo di una fonte di cibo liquido sotto una condizione di alimentazione in posizione verticale. Alternativamente l'assunzione di cibo può essere misurata per un gruppo mosca su una fonte di cibo colorato in una fiala o su una placca. Le mosche sono normalmente uccisi o anestetizzati dopo l'alimentazione e la quantità di colorante ingerita è determinato per spettrofotometria o ispezione visiva dell'addome macchiato. Mosche iniziano a espellere cibo ingerito solo 30 minuti dopo l'assunzione, quindi questo approccio è difficile da usare per l'analisi di alimentazione più continuo comportamenti 12, 13.

In contrasto con le mosche sono mantenuti intatti quando colorante assorbibiles con traccianti radioattivi vengono utilizzati e il loro consumo di radioisotopi è segnato in un contatore a scintillazione 14, 15. L'assorbimento di radiomarcato da parte del sistema digestivo fly rende possibile la misurazione alimentare l'assorbimento a lungo termine, ma potrebbe portare a sottovalutare il consumo a causa di molecole non assorbita ed escreta tracciante. Un altro approccio per misurare la risposta al cibo in Drosophila melanogaster è la risposta proboscide estensione (PER), che normalmente si verifica per l'assunzione di cibo 16. Questo metodo elegante misura la prima risposta a uno stimolo cibo, ma non registra la quantità di assunzione. L'assunzione di cibo viene regolato in modo dinamico durante l'alimentazione utilizzando diversi segnali di feedback post-digestive che sono fondamentali per la regolazione di alimentazione 17, 18. Diversi tentativi sono stati fatti negli ultimi anni per la raccolta di dati semi-automatizzare nel saggio PER 19, 20. Il PER viene rilevata da un pad elettrico o una combinazione di elettrodi e contato tramite computer. Combinando il saggio PER con radioisotopi assorbimento ha rivelato che questo test è limitata dalla bassa sensibilità per rilevare le differenze di alimentazione quantità 18. Il saggio alimentazione manuale (MAF) 21, in cui una mosca viene alimentato manualmente con un capillare di vetro, è stato recentemente sviluppato per misurare l'assorbimento alimentare in una singola mosca immobilizzato. Il saggio MAFE elimina le interferenze di foraggiamento e l'alimentazione iniziazione e ha una risoluzione temporale di secondi, e l'avvio di PER e il consumo di cibo può essere monitorata in modo indipendente nel saggio. Tuttavia, il modo in cui l'immobilizzazione della mosca colpisce alcuni aspetti del comportamento alimentare (ad es locomozione, la motivazione) deve ancora essere indagato. Per ottime recensioni comparative di diversi test per misurare il consumo di cibo in Drosophila melanogaster e per aiutare i ricercatori trovare quello più adatto, vedi relazioni Deshpande e Marx 13, 22.

Il saggio CAFE evita alcuni degli svantaggi di altri saggi descritti sopra e combina semplicità d'uso con misurazione affidabile di assunzione di cibo. Qui, una descrizione dettagliata del saggio CAFE è fornito e mostriamo una semplice modifica di configurazione per ridurre l'evaporazione. I risultati rappresentativi, tra cui un test di due alimenti scelta (a breve e lungo termine) e l'assorbimento di saccarosio di mosche è dimostrata. Nella discussione si confronta il nostro metodo descritto con modi alternativi per eseguire il test CAFE, ed evidenziare potenziali limitazioni.

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Protocollo

1. Il test CAFE

NOTA: Il saggio è costituito da tre componenti: un flaconcino sperimentale, un coperchio specifico e capillari micro. Una scatola di plastica con coperchio viene utilizzato per trasportare i flaconi preparati e per controllare l'umidità in modo più efficiente.

  1. Utilizzare un Drosophila melanogaster fiala di cultura plastica (opzionale altezza 8 cm, 3,3 centimetri di diametro) come un tubo per il saggio.
  2. Sigillare la fiala con un coperchio in plexiglas prodotto contenente un O-ring (figure 1A, 1B). Carico vola toccando o con un cannello attraverso l'apertura del coperchio centrale (0,9 cm di diametro), che consente anche di circolazione di aria e acqua, e chiudere il foro con un tappo spugna. Sei aperture coniche più piccoli (0,4 cm di diametro superiore, diametro interno 0,3 cm) circondano il foro centrale e si inseriscono le punte delle pipette di 2 - 20 volumi microlitri per tenere i capillari a posto. (Vedi figure supplementari per i dettagli tecnici del coperchio.)
    NOTA: l'usodi un tappo di spugna con aperture per i capillari invece del coperchio misura utilizzata nel nostro manoscritto è possibile. Il nostro coperchio personalizzata permette una manipolazione sicura delle fiale preparati minimizzando il rischio di capillari cadere.
  3. Per presentare il cibo liquido, usare 5 microcapillari microlitri con 1 marchi microlitri. Posizionare i capillari nelle aperture coniche nel coperchio tagliando la parte superiore di un 2 - 20 microlitri punta della pipetta e inserendo la punta nel foro (Figura 1B, contrassegnato con bordo rosso). Per evitare che le mosche di fuggire, inserire un uncut 2 - 20 microlitri punta della pipetta nella stessa apertura.
  4. Per gestire in modo sicuro più flaconi preparati, metterli in una scatola di plastica con un intarsio a griglia (Figura 2A).

2. Preparazione di mosche

  1. Mantenere mosche sul cibo standard a 25 ° C, 60% umidità relativa e un ciclo luce-buio / 12 h 12 h.
  2. Per controllare le condizioni di allevamento, introdurre 35 femmine vergini unD 15 maschi per ogni gruppo sperimentale in un flacone di plastica cultura (altezza 9,8 centimetri, 4,8 centimetri di diametro) contenente 50 ml volare cibo. Consentire mosche per deporre le uova per i primi 3 giorni, poi il trasferimento adulto vola a fiale cibo fresco e far loro deporre le uova per altri due giorni. Dopo questa ripetere il trasferimento. adulto Eliminare vola dopo altri 2 giorni.
  3. Poiché l'assunzione di cibo dipendono dalle dimensioni fly, determinare il peso di un gruppo di 100 mosche dal anestetizzante 2 a 3 giorni di età adulta mosche con un tampone fly CO 2 e raccoglierli in un tubo di plastica da 1,5 ml e misurazione con uno standard scala di laboratorio. Determinare il peso umido di almeno quattro gruppi fly indipendenti filtrate per sesso (Tabella 1); utilizzare il peso per calcolare il consumo di cibo microlitri per volare mg. Utilizzare il valore per determinare la quantità di cibo che una mosca alimenta per esperimento e regolare il numero di capillari alimentare riempito conseguenza per evitare lo svuotamento dei capillari alimentando.
    1. Per un 3 ore di analisi, l'uso20 mosche e due capillari riempiti. Per un esperimento a lungo termine (> 3 ore e fino a 9 giorni), utilizzare un gruppo di otto mosche con una fornitura di quattro capillari riempiti (risultati attendibili non possono essere ottenuti con meno di otto linea nelle condizioni descritte).
  4. Mosche separare in gruppi (8 o 20 mosche) dopo la misurazione di peso sotto l'esposizione di CO 2. Trasferire il gruppo in un flaconcino alimentare (contenente 15 mL cibo standard) per consentire il recupero di CO 2 sedazione per 48 ore prima dell'esperimento. Utilizzare da 4 a 6 giorni di età mosche per il saggio CAFE.
  5. In linea non-fame wild-type si nutrono solo marginalmente 19, 21, pre-morire di fame vola per esperimenti di alimentazione 3 h. Nessun digiuno è richiesto quando il consumo di cibo è monitorato per diversi giorni. Per il digiuno, il trasferimento vola da 16 a 20 ore prima del test da loro toccando dolcemente in una fiala che contiene solo un diametro piegato carta da filtro da 45 mm inumidito con ~ 0,5 mL DDH2 O (doppio acqua distillata), e chiudere con un coperchio test CAFE collegato.

3. Preparazione del liquid food

  1. Preparare una 3 M (10%, w / v) stock soluzione di saccarosio compilando 102,6 g di saccarosio (C 12 H 22 O 11) a 100 mL DDH 2 O. Dispensare 3 ml, 33 ml, 333 ml, 3,3 ml e 6,6 ml della soluzione in un tubo di plastica da 15 ml; aggiungere 2 ml di colorante alimentare (per il rosso: cocciniglia [E124]; per il blu: Indaco carminio [E132]) e riempire a 10 ml con DDH 2 O. Le concentrazioni risultanti sono 0.001, 0.01, 0.1, 1, 2 e M di saccarosio .
    NOTA: Il colorante alimentare permette di visualizzare il menisco più facilmente. Tuttavia il colorante può avere un impatto sulla assunzione di cibo. Per evitare una distorsione dovuta al colorante erogare il colorante alimentare o randomizzata l'utilizzo di coloranti ai campioni alimentari durante l'esperimento e gruppi.
  2. Per eseguire il test per l'alcol preferenza pipetta 333 ml di 3 M di saccarosio soluzione di riserva in un tubo di plastica da 15 ml.Aggiungere 1,5 mL (2,3 mL) di 100% EtOH (etanolo) e aggiungere DDH 2 O fino a 10 mL di provocare 15% (0,25 mM) e 23% (0.39 mM) soluzioni di lavoro.
  3. Mantenere soluzioni stock a -20 ° C e soluzioni di lavoro a 4 ° C; utilizzare entro 1 settimana.
  4. Riempire fino a 10 capillari allo stesso tempo con una soluzione alimentare colorata, con la forza capillare. Inserire le estremità dei capillari nella soluzione di saccarosio (tiene i capillari ad un angolo di 45 ° rispetto alla soluzione). Stop se il liquido raggiunge la parte superiore (5 ml) marchio del capillare, e rimuovere la soluzione in eccesso all'esterno e all'interno con carta velina.

4. Montaggio e l'esecuzione del saggio capillare alimentatore

  1. Se non è necessario il digiuno, trasferire le mosche sperimentali per l'analisi toccando o blow-pipe. Assicurati di includere tre fiale di controllo senza mosche per quantificare l'evaporazione.
  2. Rimuovere con attenzione un puntale (2 - 20 volumi mL) che si sta chiudendo una delle openin esternogs, e inserire un capillare di vetro, bottom-end pieno di prima. Fissare il capillare posizionando la punta della pipetta di nuovo accanto alla capillare. Se diverse soluzioni alimentari sono in fase di test, ripetere la procedura di conseguenza.
  3. Posizionare l'estremità del capillare all'interno di tutte le fiale allo stesso livello per evitare distorsioni che potrebbero verificarsi se le fonti di cibo erano situati a diverse altezze (3 - 4 cm dal coperchio); mantenere la distanza per la carta da filtro per impedire il capillare fuoriuscita dal accidentalmente toccando la carta filtro o diverse viscosità di fonti alimentari.
  4. Etichettare l'estremità superiore del liquido colorato con un pennarello (segno di inizio). Per garantire le diverse capillari possono essere identificati, etichettare singolarmente utilizzando un codice colore o striscia.
  5. Inserire più saggi di Caffè preparati all'interno di una scatola di plastica con inserto a griglia e trasferire la scatola (Figura 2A) per una posizione sicura in condizioni di laboratorio o in un a temperatura, clim luce e umidità controllatamangiato da camera (parametri: 25 ° C, 60% di umidità relativa, 12 h / 12 h ciclo luce-buio) per il periodo sperimentale (ad esempio, 3 ore o giorni).
  6. Come carta da filtro di fondo si asciuga se il test viene fatto per diversi giorni, applicare acqua fresca ogni 24 ore tramite il tappo spugna (100 ml) per mantenere costante l'umidità all'interno del test. Utilizzare quattro flaconcini separati (8 cm Altezza, 3,3 centimetri di diametro) riempito con 30 ml di DDH 2 O come dispositivi di umidità e metterli accanto ai saggi CAFE nella scatola di plastica. Utilizzare un coperchio per la scatola di plastica per creare un ambiente ad umidità controllata durante l'esperimento (Figura 2A).
    NOTA: la variabilità più ampia si verifica in condizioni di laboratorio; tuttavia, è fattibile per eseguire il test CAFE a temperatura ambiente (ad es., in una classe). L'uso di un dispositivo di umidificazione (carta da filtro, con o senza un tappo spugna bagnata, riempiti flaconi acqua e coperchio della scatola di plastica) è fortemente incoraggiato a diminuire l'evaporazione ( Figura 2B).
  7. Sostituire i capillari con quelli appena riempiti per esperimenti a lungo termine ogni 24 h. Prendere nota di mosche morte prima di ogni intervallo h 24 e utilizzare il numero di mosche in tempo reale per calcolare il consumo di Per Fly per il periodo successivo. Eliminare i vecchi capillari dopo aver misurato il declino del menisco (vedi 5.1).
    NOTA: durante un esperimento di 3 ore abbiamo quasi visto alcun mosche morte. Durante uno studio di 4 giorni di solito troviamo 1 - 3 mosche morte.
  8. Al termine del dosaggio o prima di sostituire il capillare, contrassegnare il menisco inferiore del capillare (fine mark) con un pennarello mentre il saggio CAFE è ancora in posizione verticale. Eliminare i dati se fine marchio non è sotto il segno iniziale (mark inizio). Non rimuovere il coperchio, poiché questo potrebbe cambiare il menisco.
  9. Rimuovere con attenzione i capillari dal saggio e conservarli per la raccolta dei dati. Controllare il liquido all'interno del capillare raggiunto l'estremità inferiore se non Discard i dati, come il cibo non era accessibile alle mosche. Raccogliere tutti i capillari per flaconcino come gruppo. Inserire i puntali delle pipette non tagliati in tutte le aperture per evitare che le mosche di fuggire. Smontare la messa a punto e lavare le fiale, coperchi e tappi di spugna in un bagno di sapone e asciugare per una notte a temperatura ambiente per un ulteriore uso.
    NOTA: Le mosche possono essere ulteriormente analizzati dopo il test. Confermare l'assorbimento di cibo ad occhio nudo o al microscopio dissezione.
  10. Ripetere gli esperimenti con gli stessi genotipi su almeno tre giorni diversi.

5. Raccolta dati e analisi

  1. Misurare la distanza tra l'inizio e la fine marchio segno sulla capillare utilizzando una pinza o di un righello. Per trasferire i dati direttamente in un foglio di calcolo, usare un USB (Universal Serial Bus) collegato calibro digitale (Figura 1E). Eliminare i capillari dopo la misurazione.
  2. Conto per dimensioni capillare per calcolare l'assorbimento di cibo o evaporazione. Ad esempio, si consideri un tappoIllary che è di 73 mm e contiene 5 ml di soluzione di cibo. Una diminuzione 14,6 mm di menisco riflette l'assorbimento di 1 ml soluzione. Calcolare uptake cibo utilizzando la seguente formula:
    l'assorbimento alimentare (ml) = distanza misurata (mm) / 14.6 mm
  3. Per escludere l'effetto dell'evaporazione sulla assunzione di cibo, calcolare significare l'evaporazione nelle fiale di controllo a tre (come minimo) senza mosche. Sottrarre questo valore medio dal valore ottenuto per il consumo di cibo dalle mosche.
  4. Utilizzare la seguente formula per determinare il consumo totale per volare:
    Consumi alimentari (ml) = (Food assorbimento [ml] - perdite per evaporazione [ml]) / numero totale di mosche nel flacone. Per lungo termine esperimenti usa il numero di mosche vivi prima dell'inizio dell'intervallo 24 h.
  5. Per tenere conto delle differenze in termini di dimensioni del corpo, come ad esempio tra le mosche maschio e femmina, normalizzare il consumo di cibo al peso corporeo (microlitri cibo / fly mg).
  6. Utilizzare il software statistico per l'analisi dei dati. per normadati alleato distribuiti, -test T uso degli studenti per determinare le differenze tra due gruppi di volo, e utilizzano ANOVA (analisi della varianza), con i test post hoc Tukey Cramer per più di due gruppi. In una situazione di scelta, analizzare le differenze di scelta casuale usando un test non parametrico segno di un campione.

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Risultati

Le mosche del w 1118 genotipi sono utilizzati per dimostrare come viene eseguito il test. I w 1118 mutanti sono comunemente usati per generare le linee transgeniche e di controllare il background genetico di transgeni contrassegnato con il gene bianco. Normalmente, per esperimenti comportamentali, tutte le linee transgeniche sono reincrociata per cinque generazioni alla stessa w 1118 magazzino, che viene utilizzato come...

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Discussione

La relazione descrive il saggio CAFE in modo passo-passo, concentrandosi sulla configurazione tecnica e le sue prestazioni di successo in laboratorio. Grazie alla sua semplicità, questo dosaggio potrebbe anche essere usato come educativo esperimento scuola. Gli esempi mostrano che il saggio permette di indagine di cibo rilevamento, privilegiate e di consumo in Drosophila melanogaster per periodi di tempo brevi e più lunghi (ore o giorni). Il saggio CAFE è stato utilizzato ampiamente nel campo di indagare temi, ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri passati e presenti del laboratorio Scholz per la discussione e Helga Döring per l'eccellente supporto tecnico. Ringraziamo in particolare i membri del laboratorio Biocenter dell'Università di Colonia per il loro sostegno e la loro creatività. Il lavoro è supportato da SFB 1340, SysMedAlc e DAAD-Siemens.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fiale (allevamento)Fiale Greiner Bio-One960177www.greinerbioone.com
(saggio CAFE)Greiner Bio-One217101www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assayWorkshop––
Scatola di plastica, parete bassaPlastime353www.plastime.it
Coperchio per la scatola di plasticaOfficina––
CapillariBLAUBRAND REF 7087 07www.brand.de
Puntali per pipetteGreiner Bio-One771290www.greinerbioone.com
Cerchi di carta da filtroWhatman10 311 804www.sigmaaldrich.com
D(+)-SaccarosioAppliChem57-50-1www.applichem.com
Etanolo assolutoVWR Chemicals20.821.330www.vwr.com
Colorante alimentare (rosso, E124)Backfun10027www.backfun.de
Colorante alimentare (blu, E133)Backfun10030www.backfun.de
Soluzione di sapone (CVK 8)CVH103220www.cvh.de
Calibro digitaleGARANT412.616www.hoffmann-group.com
Fiale (allevamento)Altezza 9,8 cm, diametro 4,8 cm 
Fiale (test CAFE)Altezza 8 cm, diametro 3,3 cm
Coperchio-testProdotto in officina universitaria, disegno tecnico fornito
Clicca qui per scaricare questo file.
Scatola di plastica, pareteUn inserto a griglia in plastica è stato realizzato su misura per 8 x 10 posizioni di fiale 
Coperchio per la scatolaDimensioni (37 x 29 x 18 cm)
CapillariDIN ISO 7550,  Direttiva IVD 98/79 EG, estremità lucidate
PuntaliLe pipette per il cerchio esterno vengono tagliate in base al coperchio Cerchi di
carta da filtro Diametrodi 45 mm funziona bene se piegato per le fiale utilizzate
D(+)-SaccarosioNon dannoso
Etanolo assolutoLiquido e vapore altamente infiammabili
Colorante alimentare (rosso, E124)Non dichiarato
Colorante alimentare (blu, E133)Non dichiarato
Soluzione di sapone (CVK 8)Sapone inodore neutro
Calibro
Cibo(per 20 L)
Agar160 g
Lievito299,33 g
Farina1.200 g
Melassa1,6 L
Acido57,3 mL
Nipagin 30%160 mL
CAFE bassa di plastica per pipette digitale per mosche standard di birra di mais propionico

Riferimenti

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