Microscopia elettronica a scansione (SEM) Protocolli per problematico Plant, oomicete, e campioni fungine

Summary

I problemi nell'elaborazione di campioni biologici per l'osservazione al microscopio elettronico a scansione includono il collasso cellulare, il trattamento di campioni provenienti da microambienti umidi e la distruzione cellulare. Qui vengono compilati e dettagliati protocolli a basso costo e relativamente rapidi, adatti alla preparazione di campioni impegnativi come meristemi floreali, cisti di oomiceti e funghi (Agaricales).

Abstract

I problemi più comuni nel trattamento dei campioni biologici per le osservazioni con il microscopio elettronico a scansione (SEM) includono il collasso delle cellule, il trattamento di campioni provenienti da microambienti umidi e la distruzione delle cellule. Utilizzando i giovani tessuti floreali, cisti oomiceti e spore di funghi (Agaricales) come esempi, i protocolli specifici per trattare i campioni delicati sono descritte qui che superano alcune delle principali sfide nel trattamento del campione per l'acquisizione di immagini sotto il SEM.

meristemi floreali fissate con FAA (formalina-acetico-alcol) ed elaborate con la Critical Point Dryer (CPD) non veniva visualizzato crollati pareti cellulari o organi distorti. Questi risultati sono cruciali per la ricostruzione dello sviluppo floreale. Un simile trattamento CPD-based dei campioni microambienti umidi, come le cisti oomiceti glutaraldeide fisso, è ottimale per testare la crescita differenziale di caratteristiche diagnostiche (ad esempio, le spine cisti) su diversi tipi di dobstrates. La distruzione delle cellule nutrici collegati a spore di funghi è stato evitato dopo la reidratazione, la disidratazione, e il trattamento CPD, un passo importante per ulteriori studi funzionali di queste cellule.

I protocolli descritti qui rappresentano a basso costo e le alternative rapide per l'acquisizione di immagini di buona qualità per ricostruire i processi di crescita e di studiare le caratteristiche diagnostiche.

Introduction

In biologia, l'uso di microscopia elettronica a scansione (SEM) è stato esteso a studi di evoluzione strutturale, morfologia comparativa sviluppo degli organi, e la caratterizzazione di popolazioni o specie ^1. Con la sua vista bidimensionale di strutture microscopiche, aree come micromorfologia e sistematica beneficiato dal SEM tecnica progressi a partire dalla seconda metà del 20 ^° secolo. Ad esempio, l'introduzione della metodologia di rivestimento sputtering nel 1970 resa possibile osservazioni di materiali delicati quali apici dei germogli e fiori migliorando l'imaging del tessuto non conduttivi ^2,

Protocol

NOTA: Questo protocollo comprende sei sezioni principali, tre dedicati ad organismi specifici (sezioni 1-3), e tre descrivono le procedure comuni a tutti (4-6). Asterischi (*) indicano passi modificati dagli sperimentatori.

1. Studi di sviluppo e di strutture vegetali completamente formati

1. Raccolta e la fissazione
   1. Se il materiale vegetale viene raccolto in un luogo senza accesso ad una cappa, introdurre e immergere il materiale in 70% di etanolo in provette da centrifuga. Idealmente, immergere il materiale dopo 48 ore in FAA (passi 1.1.1-1.1.3) per evitare la disidratazione eccessivo nel etanolo. Se un....

Results

Sviluppo floreale e la fissazione di sviluppo e strutture vegetali completamente formato

Utilizzando il protocollo FAA-CPD descritto qui, giovani e mature tessuti vegetali sono perfettamente fissati e disidratati per l'imaging SEM. Processi come lo sviluppo floreale possono essere ricostruiti, perché la topografia e la forma delle gemme non sia falsata da cellule restringimento (Figure 1b, 1d, 4a-f). Le struttur.......

Discussion

Per quanto riguarda i protocolli standard SEM, le procedure qui presentati sono relativamente rapido, facile da seguire, e le metodologie a basso costo. A seconda della quantità di campioni e sulla facilità di lavorazione, ci vogliono quattro o cinque giorni per acquisire immagini di buona qualità. Compreso adeguate misure di sicurezza per la CPD e il funzionamento SEM, le procedure sono facili da gestire. Particolare cautela deve essere assunto con formalina e la glutaraldeide (vedere i passaggi da 1.1.1 a 1.1.3 e 2.1........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acido acetico	Nessun fornitore		Irritazione della pelle, irritazione degli occhi
tronchetti di alluminio	Ted Pella, Inc.	16221	www.tedpella.com
Provette per centrifuga	Nessun fornitore
Essiccatore per punti critici	Polaron Quatum Technologies	CPD7501
D-(+)-Glucosio	Merck	1.083.421.000
Nastro biadesivo	Nessun fornitore
Etanolo assoluto	Nessun fornitore		specificoAgar
batteriologico europeo	Conda	1800.00	www.condalab.com
Carta da filtro	Nessun fornitore
Pinze	Nessun fornitore
Formalina 4%	Nessun fornitore		Nocivo, tossicità acuta, sensibilizzazione cutanea, cancerogenicità. Vetrini di copertura in vetro infiammabile
	Nessun fornitore
Contenitore ermetico in vetro	Nessun fornitore
Glutaraldeide 25% DC 253857.1611  (L)	Dismadel S.L.	3336	www.dismadel.com
Peptone micologico	Conda	1922.00	aghi www.condalab.com
	Nessun fornitore
Piastre di Petri	Nessun fornitore
Contenitori in plastica	Nessun fornitore
Porta campioni con coperchio  per l'essiccatore del punto critico	Ted Pella, Inc.	4591	bisturi www.tedpella.com
	Nessun fornitore
Microscopio elettronico a scansione	Hitachi	S3000N
Software per SEM
Soluzione A: NaH2PO4
Soluzione B: Na2HPO4
Portacampioni	Nessun fornitore
Verniciatore per polverizzazione catodica	Balzers	SCD 004
Stereomicroscopio	Nessun fornitore
Griglie per microscopio elettronico a trasmissione (TEM) Microscopia	elettronica Scienze	G200 (maglia quadrata)	www.emsdiassum.com
Pinzette	Nessun fornitore specifico