Descriviamo qui un metodo per regolare il tropismo del picornavirus incorporando sequenze complementari a specifici microRNA nel genoma virale. Questo protocollo può essere adattato a tutte le diverse classi di virus con modifiche in base alla lunghezza e alla natura del loro ciclo di vita.
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Articolo metodologico
Regolamento MicroRNA basata su Picornavirus Tropismo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La restrizione cellulo-specifica della replicazione virale senza attenuazione concomitante può giovare allo sviluppo di vaccini, alla terapia genica, alla viroterapia oncolitica e alla comprensione delle proprietà biologiche dei virus. Esistono diversi meccanismi per regolare il tropismo virale, tuttavia tendono ad essere specifici della classe virale e molti provocano l'attenuazione del virus. Inoltre, molti virus, inclusi i picornavirus, mostrano vincoli di dimensioni che non consentono l'incorporazione di grandi quantità di materiale genetico estraneo necessario per alcuni metodi di targeting. I microRNA sono RNA corti e non codificanti che regolano l'espressione genica nelle cellule eucariotiche legando sequenze bersaglio complementari negli RNA messaggeri, impedendone la traduzione o accelerandone la degradazione. Cellule diverse mostrano firme distinte di microRNA e molti microRNA fungono da biomarcatori. Questi modelli di espressione differenziale possono essere sfruttati per limitare l'espressione genica nelle cellule che esprimono specifici microRNA, mantenendo l'espressione nelle cellule che non lo fanno. Per quanto riguarda la regolazione del tropismo virale, sequenze complementari a specifici microRNA sono incorporate nel genoma virale, generalmente nelle regioni 3' non codificanti, mirando alla loro distruzione in presenza dei microRNA affini, impedendo così l'espressione e/o la replicazione genica virale. Il targeting dei microRNA è una tecnica che teoricamente può essere applicata a tutti i vettori virali senza alterare la potenza del virus in assenza dei corrispondenti microRNA. Qui descriviamo i metodi sperimentali associati alla generazione di un picornavirus mirato al microRNA e valutiamo l'efficacia e la specificità di tale targeting in vitro. Questo protocollo è progettato per un virus a replicazione rapida con un ciclo di replicazione litica, tuttavia, la modifica dei punti temporali analizzati e le letture specifiche della titolazione del virus utilizzate aiuteranno nell'adattamento di questo protocollo a molti virus diversi.
Introduzione
Lo sviluppo di un metodo ampiamente applicabile, facile ed efficace per ingegneria un vettore con tropismo limitata offre una grande opportunità per migliorare la sicurezza, la comprensione biologica e l'utilità terapeutica del virus. Diversi meccanismi esistono per indirizzare tropismo virale tra cui trasduzionali, trascrizione, e le tecniche di traslazionali-based. Tuttavia, questi metodi non sono generalmente applicabili a tutti i sistemi vettoriali, può richiedere vie di segnalazione difettosi in cellule bersaglio o richiedere l'inserimento di grandi sequenze codificanti nel genoma virale. Inoltre, questi metodi possono provocare un'attenuazione del v....
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Protocollo
1. La clonazione microRNA Risposta elementi nel genoma virale
- Progettazione microRNA elemento di risposta inserti.
- Identificare il microRNA desiderata e la corrispondente sequenza bersaglio. Diverse banche dati sono disponibili con sequenze microRNA maturi. Consigliato: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
- Clonare l'elemento di risposta in plasmide DNA che codifica del genoma vettore o di trascrizione.
NOTA: per due ....
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Risultati
La tabella 1 rappresenta i risultati tipici di un test di titolazione per Picornavirus e descrive come calcolare la dose infettante coltura tissutale del 50%. Una rappresentazione schematica del concetto generale di regolazione microRNA a base di tropismo virale descritto in questo manoscritto è mostrato in Figura 1. L'orientamento di microRNA all'elemento di risposta durante le interazioni intracellulari, corretta progettazione di oligonucleotid.......
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Discussione
Il design, la composizione e la localizzazione degli elementi di risposta microRNA all'interno del genoma virale detterà mira efficacia e specificità. Ottimizzazione questi richiederà tentativi ed errori. Tuttavia, progettazione razionale sulla base di RNA analisi strutturale e studi precedenti di replicazione virale e microRNA firme aiuti per l'attuazione di questa tecnica con l'ottimizzazione minimo 10, 11, 12,
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Al e Mary Agnes McQuinn, la Richard M. Schulze Foundation, e un NIH Relief Grant dalla Mayo Clinic hanno finanziato il lavoro rappresentativo descritto qui.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Oligonucleotidi codificanti per RE Sequenza | ultramerica purificata | IDT | progettata dallo sperimentatore |
| Oligonucleotidi che codificano un sito di restrizione unico | IDT | 25nM | progettata dallo sperimentatore |
| Espandi il kit PCR ad alta fedeltà | Sigma Aldrich | 11732641001 | Molti altri kit PCR per polimerasi ad alta fedeltà disponibili |
| Sistema T4 DNA Ligasi | NEB | M0202S | |
| Kit MEGAscript | ThermoFisher Scientific | AM1333 | |
| Kit MEGAclear | ThermoFisher Scientific | AM1908 | |
| 0,5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | AM9260G | Senza RNasi |
| 5 M NH4 Acetato | ThermoFisher Scientific | N/A | viene fornito in kit MEGAclear |
| Etanolo | ThermoFisher Scientific BP2818100 | ||
| Acqua priva di nucleasi | Fisher Scientific | AM9938 | |
| TransIT-2020 Reagente di trasfezione | Mirus | MIR 5404 | |
| TransIT-mRNA Reagente di trasfezione | Mirus | MIR 2225 | |
| 0.2 μ m filtro per siringa | Millipore | SLGP033RS | |
| 2 ml Provette con tappo a vite | Sarstedt | 72.694.005 | |
| Raschietti cellulari | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| MicroRNA imita | Dharmacon | Variazione | |
| MTT Saggio di proliferazione cellulare | ATCC | 30-1010K | |
| Efficienza di subclonaggio DH5&alfa; Cellule competenti | ThermoFisher Scientific | 18265017 | |
| pBlueScript II Vettori | Tecnologie Agilent Variabile | (ad es. 212205) | Esistono diversi plasmidi con promotori T7 o T3 e siti di clonazione variabili per consentire il clonaggio e la trascrizione dell'RNA. |
Riferimenti
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V.
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Ristampe e permessi
