Articolo metodologico

La coltivazione di Caenorhabditis elegans In tre dimensioni in laboratorio

DOI:

10.3791/55048

⸱

12 dicembre 2016

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

In questo articolo

Sommario

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Vi presentiamo un metodo semplice per la costruzione di sistemi di coltivazione nematode 3D chiamati NGT-3D e NGB-3D. Questi possono essere utilizzati per studiare nematode fitness e comportamenti in habitat che sono più simili a naturali Caenorhabditis elegans habitat rispetto alle laboratorio C. elegans piastre di coltura 2D standard.

Abstract

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L'uso di organismi modello genetici come Caenorhabditis elegans ha portato a scoperte fondamentali in biologia negli ultimi cinque decenni. La maggior parte di ciò che sappiamo su C. elegans è limitato alla coltivazione in laboratorio dei nematodi che potrebbero non riflettere necessariamente gli ambienti che normalmente abitano in natura. La coltivazione di C. elegans in un habitat 3D più simile alla matrice 3D che i vermi incontrano nei frutti marci e nel compost vegetativo in natura potrebbe rivelare nuovi fenotipi e comportamenti non osservati in 2D. Inoltre, gli esperimenti in 3D possono affrontare il modo in cui i fenotipi che osserviamo in 2D sono rilevanti per il verme in natura. Qui viene presentato un nuovo metodo in cui C. elegans cresce e si riproduce normalmente in tre dimensioni. La coltivazione di C. elegans nel Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) può permetterci di misurare l'idoneità riproduttiva di ceppi di C. elegans o diverse condizioni in un ambiente 3D. Presentiamo anche un nuovo metodo, denominato Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), per coltivare C. elegans in 3D per l'analisi microscopica. Questi metodi consentono agli scienziati di studiare la biologia di C. elegans in condizioni che riflettono maggiormente gli ambienti che incontrano in natura. Questi possono aiutarci a comprendere la rilevanza evolutiva sovrastante della fisiologia e del comportamento di C. elegans che osserviamo in laboratorio.

Introduzione

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Lo studio del nematode Caenorhabditis elegans in laboratorio ha portato a scoperte fondamentali nel campo della biologia negli ultimi cinque decenni1. C. elegans è stato il primo organismo multicellulare ad avere il suo genoma sequenziato nel 19982, ed è stato prezioso per comprendere i contributi dei singoli geni allo sviluppo, alla fisiologia e al comportamento di un intero organismo. Gli scienziati stanno ora cercando di capire meglio come questi geni possano contribuire alla sopravvivenza e all'idoneità riproduttiva degli organismi nei loro ambienti naturali, ponendo domande sull'ecologia e l'evoluzione a livello genetico3-5.

C. elegans ancora una volta può fornire un eccellente sistema per rispondere a queste domande. Tuttavia, si sa poco sulla biologia di C. elegans negli habitat naturali dei nematodi, e non ci sono metodi attuali per simulare le condizioni naturali controllate di C. elegans in laboratorio. In laboratorio, C. elegans viene coltivato sulla superficie di piastre di agar seminate con batteri E. coli 6. In natura, tuttavia, C. elegans e i nematodi correlati possono essere trovati scarsamente abitando i suoli di tutto il mondo, ma si trovano specificamente a prosperare nei frutti in decomposizione e nella materia vegetativa7,8. Questi ambienti complessi tridimensionali (3D) sono molto diversi dai semplici ambienti 2D a cui i vermi sono esposti in laboratorio.

Per iniziare a rispondere alle domande sulla biologia dei nematodi in un ambiente 3D più naturale, abbiamo progettato un habitat 3D per la coltivazione in laboratorio di nematodi che abbiamo chiamato Nematode Growth Tube 3D o NGT-3D in breve9. L'obiettivo era quello di progettare un sistema di crescita 3D che consentisse una crescita, uno sviluppo e una fertilità paragonabili a quelli delle piastre standard 2D per terreni di crescita per nematodi (NGM)10. Questo sistema supporta la crescita di batteri e nematodi durante il loro intero ciclo di vita in 3D, consente ai vermi di muoversi e comportarsi liberamente in tre dimensioni ed è facile ed economico da produrre e utilizzare.

Nell'attuale studio, forniamo un metodo passo dopo passo per produrre NGT-3D e valutare lo sviluppo e la fertilità dei vermi. Oltre a valutare l'idoneità dei vermi in 3D, abbiamo cercato di visualizzare, filmare e valutare il comportamento e la fisiologia dei vermi nella coltivazione 3D. Pertanto, oltre a NGT-3D, presentiamo qui un metodo alternativo chiamato Nematode Growth Bottle 3D o NGB-3D, per l'imaging microscopico di C. elegans durante la coltivazione 3D. Ciò sarà particolarmente importante per lo studio di comportamenti noti identificati in 2D e per l'identificazione di nuovi comportamenti unici per la coltivazione 3D.

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Protocollo

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1. Preparare Soluzioni per NGT-3D e NGB-3D

  1. Preparare le seguenti soluzioni sterili: 1 L di soluzione 0,1454 M di NaCl, 1 L di 1 M CaCl 2, 1 L di 1 M MgSO 4, lisogenia Broth (LB), 1 L di 1 M KPO 4 tampone (108,3 g di KH 2 PO 4 e 35,6 g di K 2 HPO 4, e riempire H 2 O a 1 L). Produzione di NGM utilizzando queste soluzioni può essere trovato in un precedente protocollo 10.
  2. Le soluzioni autoclave a 121 ° C, 15 min.
  3. Preparare 50 ml di 5 mg / ml soluzione colesterolo sterile. In una provetta conica da 50 ml, mescolare 0,25 g di colesterolo e 50 ml di etanolo 99,99% e mescolare bene. Non sterilizzare in autoclave. Sterilizzare la soluzione di colesterolo utilizzando una siringa da 50 ml con un filtro a siringa da 0,45 micron. Questo sarà anche eliminare ogni colesterolo non disciolto.
  4. (Opzionale) Preparare 10 ml di una 150 mm di 2'-desossi-5-fluorouridina (FUDR) stock. In un tubo conico da 15 ml, mescolare 0,3693 gdi FUDR e 10 ml di acqua distillata. Agitare bene.

2. Preparare Coltura dei batteri per NGT-3D e NGB-3D

  1. Inoculare 10 ml di brodo LB con i batteri. I batteri standard utilizzati per la C. elegans alimentazione è ceppo di E. coli OP50.
  2. Cultura l'inoculazione batterica a 37 ° C in un incubatore agitazione durante la notte.
  3. In preparazione per una diluizione seriale, aliquote 9 ml di soluzione NaCl in sterili 15 ml provette coniche. Ad esempio, aliquota 9 ml in un totale di 7 tubi per fare una diluizione 10 -7 del ceppo OP50 E. coli.
  4. Usando una pipetta sterile, 1.000 ml, pipetta 1 ml di coltura batterica o coltura batterica diluito nella nuova provetta sterile con 9 ml di soluzione di NaCl e vortice bene il composto 10 ml. Ripetere fino a raggiungere la diluizione batterica desiderato.
    NOTA: La diluizione batterica desiderata dipende dal tipo e dalle condizioni di batteri e le condizioni sperimentali esatti.Ad esempio, a 10 -6 - diluizione del ceppo OP50 E. coli 10 -8 era sufficiente a produrre da 1 - 200 colonie batteriche per 6,5 ml tubo NGT-3D. Worms affidabile sviluppati e riprodotti normalmente quando il numero delle colonie era finita 60, avvenuta ad una diluizione di 10 -6 - 10 -7. Per NGB-3D, usare una diluizione di 10 -8.

3. Fare NGT-3D e NGB-3D (200 ml)

  1. Dopo preparazione della coltura batterica, miscela 0,6 g di NaCl, 1 g granulato agar, e 0,5 g di peptone in un pallone da 500 ml. Inserire una ancoretta magnetica nel pallone.
  2. Aggiungere 195 ml di acqua distillata e coprire la bocca del pallone con un foglio di alluminio.
  3. Autoclave 121 ° C per 15 min.
  4. Porre il pallone in autoclave a caldo su un piatto mescolare, e mescolare a velocità moderata per almeno 2 ore. Raffreddare il pallone a 40 ° C. Assicurati di raffreddare sufficientemente come si continua da qui a temperature elevate può portare a opacità del agar finito.Tuttavia, temperature più basse possono provocare il rapido indurimento di agar.
    1. (Facoltativo) Per accelerare il processo di raffreddamento, mettere il pallone in un 40 ° C bagnomaria 15 minuti prima di mettere su un piatto mescolare.
  5. Quando la temperatura del supporto agar raggiunge 40 ° C, aggiungere 200 ml 1 M CaCl 2, 200 ml di 5 mg / soluzione colesterolo ml, 200 ml 1 M MgSO 4 e 5 ml 1 M KPO 4 buffer come la soluzione continua a mescolare a concentrazioni finali di 1 mM CaCl 2, 5 ug / ml di colesterolo, 1 mM MgSO 4, 1 mM KPO 4.
    1. (Opzionale) per test di durata della vita NGT-3D aggiungere 80 ml di 150 mm FUDR ad una concentrazione finale di 120 micron 12.
  6. Aggiungere 6 ml di 10 ml diluiti coltura batterica dal punto 2.4 nel pallone direttamente.
    1. (Opzionale) per NGT-3D, rimuovere le 6 ml di terreni di coltura prima del punto 3.6 e tenere in caldo separatamente. Questo supporto sarà utilizzato per i batteri senzastrato superiore.
  7. Utilizzando le procedure sterili, erogare i media in una camera di cultura sterile. Assicurarsi che il coperchio della camera si chiude ermeticamente.
    1. (Opzionale) Per evitare colonie batteriche formazione sulla superficie superiore della agar, fare uno strato di priva di batteri agar dal punto 3.6.1 sulla sommità prima che il supporto dal punto 3.7 completamente indurisce. Ciò creerà una zona libera da batteri nella parte superiore della NGT-3D.
    2. Per NGT-3D, versare 6,5 ml supporti nelle provette di plastica trasparenti 8 ml di fare uno strato di batteri agar, e dispensare accuratamente 200 ml di mezzi di comunicazione priva di batteri sulla parte superiore del supporto semi-indurito 3D per fare un sottile bacteria- strato libero sulla parte superiore.
    3. Per NGB-3D, versare 65 ml di media nel 25 centimetri bottiglia coltura cellulare 2 plastica trasparente. Tale importo deve riempire il corpo della bottiglia 25 centimetri cultura 2 cellule.
  8. Lasciare camere verticalmente a temperatura ambiente per una settimana per consentire colonie batteriche di crescerenotevoli dimensioni del diametro minimo di 1 mm.
    1. (Opzionale) per test di durata della vita in NGT-3D, camere di coprire con un foglio di alluminio per evitare il degrado luce di FUDR.

4. Misurare Fitness di Worm Popolazione al NGT-3D (Brood dimensione relativa del saggio)

  1. Scegliere un verme L4 fase utilizzando un filo di platino raccogliere e trasferire su un piatto NGM senza batteri. Lasciare verme di spostarsi liberamente per alcuni minuti per rimuovere batteri attaccati al suo corpo.
  2. Ripetere il passaggio 4.1 e fare in modo che il worm è esente da batteri. In generale, due repliche di 4.1 sono sufficienti.
  3. posizionare con cura il verme pulita sulla superficie del supporto 3D con un pick filo di platino. Il worm dovrebbe finalmente entrare l'agar agar nella matrice 3D.
  4. Chiudere il coperchio senza bloccare consentendo una certa aria nel tubo, ma impedendo l'essiccazione dei media agar.
  5. Incubare per 96 ore a 20 ° C.
  6. Dopo 4 giorni, chiudere ermeticamente i coperchi e posizionare ilNGT-3D camera di cultura in un bagno d'acqua C 88 ° per sciogliere l'agar. Il calore uccide i vermi, ma i loro corpi rimangono intatti.
    NOTA: L'utilizzo 8 ml tubi per NGT-3D, 20 - 30 minuti di incubazione è di solito sufficiente.
  7. Usando una pipetta di vetro, trasferire i mezzi fuso su un piatto di plastica 9 centimetri di Petri. pipette di plastica non sono invitati, come i vermi possono spesso bastone a loro.
  8. Utilizzando un microscopio stereoscopico dissezione trasmissione, contare il numero di vermi al L3, L4 e stadi adulti. Non contare i vermi che sono L2 fase e più giovani, come le generazioni F1 e F2 possono essere confusi qui. Così, questo test è un test relativo dimensione covata piuttosto che un dosaggio totale dimensioni covata.

5. Immagine e Record Worm Comportamento NGB-3D

  1. Scegli uno stadio verme L4 utilizzando un filo di platino raccogliere e rimuovere i batteri attaccati alla superficie trasferendo ad una piastra NGM senza batteri e permettendo di muoversi liberamente per alcuni minuti.
  2. Ripetere il passaggio 5.1 per assicurarsi che il worm è esente da batteri.
  3. posizionare accuratamente il verme pulito sul centro della superficie agar del NGB-3D vicino al collo della bottiglia con un pick filo di platino. Il worm dovrebbe finalmente entrare l'agar agar nella matrice 3D.
  4. Chiudere il coperchio senza bloccare consentendo una certa aria nel tubo, evitando l'asciugatura dei media agar.
  5. Immagine o registrare il verme sotto una dissezione stereo microscopio di trasmissione. Regolare la messa a fuoco come il verme si muove attraverso la matrice 3D.

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Risultati

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La costruzione di NGT-3D è un protocollo semplice e lineare che si traduce in una provetta agar-riempita con piccole colonie batteriche distanziati tutto il agar (Figura 1A). Worms possono muoversi liberamente attraverso la matrice agar, trovare e consumare le colonie batteriche. Per confermare se C. elegans possono riprodursi e di crescere normalmente in NGT-3D, abbiamo confrontato la fertilità e lo sviluppo larvale in 3D con piastre standard 2D NGM. Nel saggio...

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Discussione

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La coltivazione laboratorio di C. elegans utilizzando le piastre di terreni di crescita nematode classici è stato fondamentale per le centinaia di importanti scoperte che la ricerca in C. elegans ha fornito. Qui, vi presentiamo i nuovi metodi per coltivare C. elegans in un ambiente che rifletta più accuratamente i loro naturale habitat tridimensionali. Sebbene altri metodi sono stati usati per osservare C. elegans in 3D 13, questo è il primo protocollo che permette la colti...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da un nuovo investigatore di Grant [2014R1A1A1005553] dalla Fondazione Nazionale delle Ricerche di Corea (NRF) per JIL; e Università di Yonsei Future Leader sovvenzione sfida [2015-22-0133] per JIL

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
LB brodo, Miller (Luria-Bertani)Difco224620
Cloruro di sodioDAEJUNG7548-440058.44 MW
Agar, granulatoDifco214530
PeptoneBacto211677
Cloruro di calcio, diidratoBio BasicCD00502*H2O; 147.02 MW
ColesteroloBio BasicCD0122386.67 MW
Alcool etilicoB& JRP090-199,99%; 46,07 MW
Solfato di magnesio, anidroBio BasicMN1988120,37 MW
Fosfato di potassio, monobasico, anidroBio BasicPB0445136,09 MW
2'-Deossi-5-fluorouridinaTokyo Chemical IndustryD2235246,19 MW
Fosfato di potassio, bibasico, anidroBio BasicPB0447174,18 MW
Provette multiusoStockwell ScientificST.8570
Chiusure per provetteStockwell ScientificST.8575
Fiaschetta per colture cellulariSPL Lifescience7012525 cm2
Research StereomicroscopioNikonSMZ18
Testa della fotocamera a colori ad alta definizioneNikonDS-Fi2
Unità di controllo basata su PCNikonDS-U3
NIS-Elements Ricerca di base, software di imaging per microscopioNikonMQS32000
da 8 ml

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  2. Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  3. Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
  4. Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
  5. Cutter, A. D. Caenorhabditis evolution in the wild. Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
  8. Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
  9. Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
  10. Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
  11. Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056(2015).
  12. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
  13. Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484(2013).
  14. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
  15. Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564(2015).

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