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Articolo metodologico

Array Ligand Nano-cluster in un doppio strato lipidico supportati

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DOI:

10.3791/55060

⸱

23 aprile 2017

 ,  ,  ,  , 
1Aix-Marseille Université, CNRS, UMR 7325, CINaM, 2State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science of Jiangnan University

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo per funzionalizzare vetro con macchie proteiche nanometriche circondato da un doppio strato lipidico fluido. Questi substrati sono compatibili con la microscopia ottica avanzata e si prevede di utilizzare come piattaforma per gli studi di adesione cellulare e migrazione.

Abstract

Attualmente v'è un notevole interesse per la creazione di array ordinati di isole di proteine ​​adesive in un mare di superficie passivata per gli studi di biologia cellulare. Negli ultimi anni, è diventato sempre più chiaro che le cellule viventi rispondono, non solo per la natura biochimica delle molecole presentati a loro, ma anche per il modo in cui queste molecole sono presentati. Creazione di proteine ​​micro-modelli è quindi ora di serie in molti laboratori di biologia; nano-modelli sono anche più accessibile. Tuttavia, nel contesto delle interazioni cellula-cellula, non v'è la necessità di modello non solo proteine, ma anche doppi strati lipidici. Tale doppia patterning proteo-lipidica, non è stato finora facilmente accessibile. Offriamo una tecnica facile per creare proteine ​​nano-dots supportati su vetro e proporre un metodo per riempire lo spazio tra punti con un doppio strato lipidico supportato (SLB). Da fotometabolismo di tracciante lipidi fluorescenti incluse nel SLB, dimostriamo che il doppio strato presenta una considerevole in-plfluidità ane. Funzionalizzazione i puntini della proteina con gruppi fluorescenti ci permette di immagini di loro e per dimostrare che sono ordinate in modo regolare reticolo esagonale. La dimensione tipica punto è circa 800 nm e la spaziatura dimostrato qui è 2 micron. Questi substrati sono attesi per servire piattaforme utili per l'adesione cellulare, la migrazione e studi meccano-sensing.

Introduzione

L'adesione cellulare avviene attraverso le molecole di adesione cellulare specializzati (CAM), proteine ​​presenti sulla membrana cellulare che sono in grado di legarsi a loro controparte sulla matrice extracellulare o su un'altra cella. Su cellule aderite, la maggior parte delle molecole di adesione tra cui l'integrina onnipresente e caderina, si trovano in forma di cluster 1. L'interazione dei linfociti T (cellule T) con cellule presentanti l'antigene (APC) fornisce un'illustrazione particolarmente sorprendente l'importanza dei cluster recettori formata all'interfaccia tra le due cellule - spesso chiamata sinapsi immunologica. Su formare il primo contatto con i recettori delle cellule APC, T (TCR) sulla superficie dei cluster scala forma cella micron T che servono come segnalazione piattaforme 2, 3, 4, e sono eventualmente centralizzati per formare un cluster centrale supramolecolare grande (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. Recentemente, è stato dimostrato che sul lato APC, i ligandi del TCR sono raggruppati 8.

Nel contesto di interazione cellule T-APC, l'impiego di sistemi ibridi, in cui l'APC viene imitato da una superficie artificiale funzionalizzata con proteine di interesse, ha notevolmente avanzato la nostra comprensione dell'interfaccia sinaptica 2, 3, 4, 5, 6, 7 . In questo contesto, è di grande rilevanza per la progettazione di superfici mimetiche APC che catturano uno o più aspetti della cellula bersaglio. Ad esempio, se ligandi sono innestate su bistrati lipidici supportati, possono diffondere nel piano del doppio strato, mimare la situazione sulla superficie APC e allo stesso tempo consentire la formazione dellacSMAC 6, 7. Analogamente, i cluster sulla APC sono stati imitato creando isole di ligandi in un mare di polimeri 9, 10, 11, 12, 13, 14. Tuttavia, queste due caratteristiche finora non sono stati combinati.

Qui si descrive una tecnica innovativa per creare nano-dots di anti-CD3 (un anticorpo che bersaglia il complesso TCR) circondato da un doppio strato lipidico con i lipidi diffondenti. Il doppio strato viene depositato mediante Langmuir-Blodgett / tecnica Langmuir-Schaefer 7, 15, 16 e, se desiderato, potrebbe essere funzionalizzato con una proteina specifica - per esempio, il legante di integrina cellule T (chiamato ICAM1). Inoltre, gli anti-CD3 punti proteina could essere sostituito con un altro anticorpo o CAM. Mentre abbiamo scelto le proteine ​​per uso futuro come piattaforma per gli studi di adesione cellulare T, la strategia dettagliato qui può essere adattato per qualsiasi proteina e persino il DNA.

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Protocollo

1. pulizia del vetro Cover-diapositive e di osservazione Chambers

  1. Disporre il vetro di copertura-scorre su un vassoio multi-slide in materiale inerte, come politetrafluoroetilene (PTFE).
  2. Immergere il vassoio con scivoli e la camera di osservazione in una soluzione di tensioattivo (qualsiasi prodotto consigliato per pulizia cuvette di quarzo è adatto).
  3. Utilizzando un bagno ad ultrasuoni, ultra-sonicato nella soluzione di tensioattivo per 30 minuti a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
  4. Lavare 5 volte con acqua ultrapura (18,2 MΩ.cm, 0.059 mS / cm).
  5. Ultra-ultrasuoni in soluzione di tensioattivo per 30 min a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
  6. Risciacquare 10 volte con acqua ultrapura.
  7. Ripetere i punti 1.5 e 1.6 due volte.
  8. Conservare in acqua a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C) per un massimo di una settimana.

2. Realizzazione di proteine ​​Nano-punti

  1. Deposizione di perline
    1. Deposit la sospensione di perline di silice (2% v / v, 70 mL) goccia a goccia su un coperchio-slitta (24 x 24 mm, spessore 170 um) tenuti con un'inclinazione di 15 gradi.
    2. Lasciate che la sospensione si sviluppa per circa 1 minuto, mentre sfogliando il vetro di 90 ° ogni 15 s.
    3. Che il liquido evapori in condizioni ambiente.
    4. Conservare in un bicchiere pulito o camera PTFE in condizioni ambiente per un massimo di 2 giorni.
  2. Deposizione di alluminio
    1. Porre i vetrini (preparati in sezione 2.1) all'interno una frequenza radio (RF) magnetron sputtering attrezzature 8, su una tavola rotante ad una distanza di circa 105 mm dal in alluminio (99%): silicio (1%) porta.
    2. Pump down della camera di deposizione a 2,6 x 10 -4 Pa utilizzando una pompa turbomolecolare. Questo passaggio è importante per la rimozione di eventuali impurezze gassose.
    3. Introdurre pura atmosfera di Argon (5N, 99,999%) con un flusso di 10 sccm a una pressione di 0,8 Pa (6,6 mTorr).
      NOTA: L'argon flusso in ingresso è controllato da un controllore di flusso di massa e la pressione di processo è controllata mediante un manometro. Il flusso di gas argon è continua ed è controllato da un equilibrio tra l'ingresso e l'apertura delle valvole di uscita.
    4. Accendere il generatore di potenza RF.
      NOTA: Qui, è stata utilizzata una gamma tipica di 400-600 W di potenza a radiofrequenza a frequenza 13,56 MHz. Il generatore RF viene utilizzato con una rete di adattamento in una modalità di accoppiamento capacitivo plasma. La potenza riflessa è monitorata e minimizzata utilizzando l'adattamento rete.
    5. Dopo il plasma è stabilizzato, sputter per 2 min mantenere l'otturatore chiuso per rimuovere eventuali impurezze dalla superficie del bersaglio.
    6. Aprire l'otturatore e consentire lo sputtering proseguire per 60 min per depositare alluminio sul vetrino ad uno spessore di 200 nm.
    7. Tagliare il flusso di argon, chiudere la valvola a saracinesca per isolare la pompa turbomolecolare dalla camera di deposizione e sfiatare la camera con pulito nitrogen per ottenere la pressione ambiente. Recuperare i vetrini rivestiti di alluminio. Conservare fino a un mese in una scatola di vetro o PTFE pulito e chiuso ermeticamente in condizioni ambientali.
  3. deposizione a vapore di organosilano
    1. Immergere il vetrino rivestito di alluminio-preparata nella fase 2.2.6 in acqua ultrapura a temperatura ambiente e ultra-ultrasuoni per 30 s in bagno ad ultrasuoni (50 W, 50/60 Hz, tra 20 e 30 ° C).
    2. Deposito 0,5 mL di (3-amminopropil) -triethoxysilane (APTES) al fondo di un essiccatore.
      ATTENZIONE: APTES è un organosilano, che evapora facilmente ed è tossico. APTES devono essere trattati solo sotto un flusso cappuccio e con i guanti.
    3. Mettere i vetrini (preparati in 2.3.1) su una griglia ceramica e posto all'interno essiccatore.
    4. Collegare l'essiccatore ad una pompa a membrana e funzionare alla massima potenza per 30 min per generare un basso vuoto.
    5. Chiudere la valvola di essiccatore e spegnere la pompa.
    6. Scaldare l'essiccatorea circa 50 ° C per 1 h.
    7. Aprire un essiccatore e raccogliere le diapositive.
    8. Trasferimento ad un altro essiccatore pulito per memorizzare fino a 48 ore a temperatura ambiente (da 20 a 30 ° C).
  4. Deposizione di primo strato di proteine ​​- sieroalbumina bovina marcata con biotina (BSA-biotina)
    1. Mettere uno dei vetrini preparati nella sezione 2.3 su un supporto in PTFE.
    2. Cassetta 1 ml di 25 mg / ml BSA-biotina sciolti in tampone fosfato isotonico (PBS). Lasciare agire per 30 minuti a temperatura ambiente (da 20 a 30 ° C).
    3. Risciacquare 10 volte con PBS. Conservare il campione fino a 24 ore a 4 ° C al riparo dalla sorgente luminosa.
  5. Rimozione di maschera in alluminio
    1. Incubare i vetrini in una soluzione di NaOH in PBS (preparato da gocce di NaOH 1 M e circa 100 ml di PBS per ottenere pH≈12) durante la notte a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
      ATTENZIONE. NaOH è corrosivo e deve essere maneggiato con i guanti.
    2. Sciacquare10 volte in acqua ultrapura.

3. Deposizione di supportati doppio strato lipidico (SLB)

  1. Pulizia della depressione Langmuir
    1. Rimuovere l'acqua nel contenitore PTFE del trogolo Langmuir utilizzando una pompa.
    2. Pulito con un panno monouso non tessuto privo di lanugine imbevuto di cloroformio.
      ATTENZIONE. Il cloroformio è tossico e deve essere manipolato in un'area ben ventilata, con una maschera (o sotto flusso-cappa) e con i guanti appropriati.
    3. Pulite 4 volte con acqua ultrapura tiepida (40 a 50 ° C).
    4. Pulire almeno 6 volte con acqua ultrapura fredda.
  2. Deposizione del primo strato lipidico
    1. Posizionare i vassoi di PTFE nel recinto PTFE del trogolo Langmuir e poi riempirlo con acqua ultrapura.
    2. Utilizzare il software di controllo dell'apparato Langmuir per impostare la pressione misurata a 0 mN / m.
    3. Utilizzare una siringa di vetro a tenuta di gas / metallo di depositare 30 microlitri di una / soluzione lipidica mL 1 mg (1, 2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (DOPC) in cloroformio) sulla superficie dell'acqua. Il cloroformio evaporare e le molecole lipidiche spontaneamente formano un monostrato.
    4. Utilizzare il software di controllo per comprimere il monostrato lipidico chiudendo la barriera PTFE fino alla pressione desiderata (27 mN / m per DOPC) viene raggiunto.
    5. Utilizzare il software di controllo di immergere il vetrino preparato in sezione 2.5.2 nel contenitore di PTFE utilizzando un morsetto motorizzato.
    6. Tenere il vetrino, nel morsetto, perpendicolare all'interfaccia aria-acqua. Utilizzare il software di controllo di aumentare lentamente (15 mm / min) attraverso l'interfaccia, mantenendo costante la pressione a 27 mN / m.
    7. Posto in un ambiente secco sia per uso immediato o per la conservazione fino a 24 ore a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
  3. Deposizione del secondo strato lipidico
    1. Mantenere la pressione superficiale nel trogolo Langmuir al valore desiderato di 27 mN / m. Comprimere utilizzando ilsoftware di controllo del dispositivo e / o Langmuir aggiungere una piccola quantità di lipidi per ottenere la pressione desiderata.
    2. Porre i vetrini trasportano il monostrato lipidico, preparato in sezione 3.2.6, orizzontalmente sulla superficie dell'acqua. Assicurarsi che ciascuna slitta galleggia sopra un vassoio PTFE.
    3. Spingere i vetrini giù, una diapositiva alla volta, nel suo vassoio di PTFE corrispondente con PTFE o metallo pinzette tale che sono immersi in acqua. Evitare di inclinare le diapositive mentre si spinge.
    4. Utilizzare PTFE o metallo pinzetta per trasferire i vassoi di PTFE contenenti i vetrini in un cristallizzatore riempito con acqua ultrapura assicurandosi che i vetrini non sono esposti all'aria.
    5. Utilizzare PTFE o metallo pinzette per trasferire, mentre lavora sott'acqua, un doppio strato rivestito vetrino in una camera di osservazione.
      NOTA: La camera di osservazione è posto sotto acqua all'interno del cristallizzatore. La camera di osservazione è personalizzato e costituito da un anello in PTFE con una guarnizione in gommaintelaiature d'acciaio d, che possono essere assemblati subacqueo per fare una camera stagna la cui superficie inferiore è realizzato dal vetrino precedentemente rivestito con il doppio strato lipidico.
    6. Chiudere la camera pur continuando a lavorare sott'acqua e assicurando che circa 1 mL di acqua è intrappolato all'interno della camera.
    7. Prendere la camera assemblato fuori dall'acqua. Assicurarsi che è libero a tenuta d'acqua e perdite.
    8. Sostituire i 1 ml di acqua ultrapura presente nella camera di osservazione con PBS aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri di PBS per 10 volte. Assicurarsi che la camera non è mai priva di liquido.
  4. SLB passo blocco
    1. Introdurre 100 ug / ml di albumina di siero bovino (BSA) nella camera di osservazione contenente il vetrino preparato in sezione 3.3.6 e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
    2. Risciacquare bistrato rimuovendo e aggiungendo 500 pl di PBS per 10 volte. Il doppio strato può essere mantenuta 24 ore a 4 ° C.

4. Funzionalizzazione con ligandi

  1. Aggiungere fluorescente o neutravidina non fluorescente (VPN, una versione deglicosilata di avidina non caricata a pH 7) a 2 ug / ml nella camera contenente il vetrino preparato in sezione 3.4.2 per 30 min a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
  2. Risciacquare aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri di PBS per 10 volte.
  3. Aggiungere biotinilato anti-CD3 a 2 ug / mL alla camera contenente il vetrino preparato in sezione 3.4.2. Per doppia funzionalizzazione della SLB e puntini, aggiungere Fc-ICAM1 His-tag a 5 mg / ml (qui, il doppio strato è fatto di DOPC + 1% di acido nitrilotriacetico NTA) lipidi (). Lasciare agire per 30 minuti a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
  4. Risciacquare aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri di PBS 10 volte
  5. Sostituire la PBS con mezzo di cella (PBS + 0,1% BSA) aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri del mezzo cellulare 10 volte.
  6. Lasciare 200 ml di media cella nel Chamber con la slitta.
  7. Posizionare la camera per 10 min a 37 ° C prima di aggiungere le cellule.

5. cellulare Deposizione (rinvio 7 per i dettagli)

  1. depositare accuratamente 400 microlitri della sospensione cellulare nella camera. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C.
  2. Fissare la cella con il 2% di paraformaldeide (PFA) per 15 min a 37 ° C. Sostituire il PFA con PBS mediante rimozione ripetuta e l'aggiunta di 500 ml di PBS.

6. osservazione

  1. Proteo-lipidico Nano-modello e la fluidità SLB
    1. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per l'immagine del profilo proteico in modalità epi-fluorescenza utilizzando appropriata lunghezza d'onda di illuminazione (639 nm) e cubi filtro (p.es. qui, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
      NOTA: L'intensità del segnale può essere quantificata per stimare la quantità di proteine ​​dentro e fuori il punto. Utilizzare opportuna lunghezza d'onda di illuminazione (330 nm) ed fcubo ilter all'immagine bistrato (BP 365/12, FT 395, LP 397), che appare luminoso con fori scuri.
    2. Usare la tecnica continua fotobleaching (CPB) 13, 15 per misurare la costante diffusione dei lipidi traccianti nel doppio strato. Questa osservazione è preferibilmente realizzato subito dopo la deposizione SLB.
      NOTA: Al fine di quantificare la costante di diffusione, due parametri sono misurati durante CPB processo: il tempo sbianca specifica del colorante (teso) e la lunghezza di caduta del profilo fluorescente dell'alone formata intorno alla zona sbiancato (TAUD). Il primo è ottenuto tracciando l'evoluzione temporale della fluorescenza al centro del campo illuminato durante il processo di CPB. La seconda è ottenuta tracciando il profilo di intensità ai margini della zona illuminata (media su 12 linee e 5 immagini dopo il raggiungimento dello stato stazionario). Le curve sono montati avere tesa e TAUD. La costante diffusione è dato da tauD 2 / teso (D = figure-protocol-1 ).

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Risultati

Le immagini di fluorescenza sono stati analizzati per misurare la distanza e la dimensione dei puntini. Spaziatura tipico è risultato essere 1.900 ± 80 nm e tipico dot-size era 600 ± 100 nm (Figura 1g). La spaziatura viene impostato dalla dimensione dei granuli utilizzati per la maschera. Dot-dimensioni è impostato dal tallone-size e condizioni di deposizione. La SLB è depositato unicamente attorno ai punti proteine e non sulla loro (figura 2), con perfe...

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Discussione

Le fasi critiche nel protocollo sopra descritto sono legati alla formazione della proteina nano-punti o back-riempimento dello spazio intorno ai punti da un bistrato lipidico supportato. Il primo passo critico rispetto alle proteine ​​nano-dots è la preparazione del cordone maschera. La pulizia del coperchio-scivolo è critica. I vetrini devono essere sia pulito con una soluzione detergente che è raccomandato per pulizia cuvette di quarzo, o con plasma di ossigeno. Altre tecniche di pulizia come immersione in etanolo o t...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Laurent Limozin, Pierre Dillard e Astrid Wahl per continuare discussioni fruttuose su applicazioni cellulari. Ringraziamo anche Frederic Bedu dalla struttura camera bianca PLANETE per il suo aiuto con le osservazioni SEM. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Consiglio europeo della ricerca tramite concessione n ° 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vetrini coprioggettiAssistent, Karl Hecht KG 
Camera di osservazionefatto in
(Hellmanex)Hella Analytics9-307-011-4-507
Ultra-sonicatoreThermoFisher
EssiccatoreLabbox
Cristallizzatore Shott
NeutravidinaThermo Fischer Scientifique84607
PBS Sigma-aldrichP3813
Acqua MQ ELGA, Veolia Francia
Perle di siliceCorpuscolare Inc147114-10
APTESSigma-aldrichA3648
BSA-BiotinaSigma-aldrichA8549
DOPCAvanti Lipidi polari850375C
Dansyl-PEAvanti Lipidi polari810330C
CloroformioSigma-aldrich650471
Siringa a tenuta di gas Dominique Dustcher , Francia74453
Bilancia per filmNIMAMicroscopio medio
Zeiss, GermaniaSistema
Bersaglio in alluminioKurt J. Lesker Compagny, USA
Sistema di sputtering magnetron a radiofrequenza io utensile SMC 600 modificato da ALCATEL , Francia
Concentrato di tensioattivo alcalino casaTIRF-III

Riferimenti

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