Articolo metodologico

Analizzando Effetti benefici dei supplementi nutrizionali sulle funzioni intestinali epiteliali barriera durante Experimental Colitis

DOI:

10.3791/55095

⸱

5 gennaio 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 2Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 3Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

In questo articolo

Sommario

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Gli attuali trattamenti di malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) hanno lo scopo di alleviare i sintomi della malattia, ma possono causare gravi effetti collaterali. Così, strategie alternative sono allo studio in modelli animali colite. Qui, viene spiegato come gli effetti benefici della dieta completa sui segni clinici IBD sono analizzati in un tale modello di colite.

Abstract

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malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD), tra cui il morbo di Crohn e la colite ulcerosa, sono patologie croniche recidivanti dell'intestino. Essi causano gravi problemi, come crampi addominali, diarrea con sangue, e perdita di peso, in individui affetti. Purtroppo, non vi è ancora alcuna cura, e trattamenti mirano solo per alleviare i sintomi. Gli attuali trattamenti comprendono farmaci anti-infiammatori e immunosoppressori che possono causare gravi effetti collaterali. Questo garantisce la ricerca di opzioni di trattamento alternativi, come integratori alimentari, che non causano effetti collaterali. Prima della loro applicazione negli studi clinici, questi composti devono essere rigorosamente testati per l'efficacia e la sicurezza nei modelli animali. Un modello sperimentale affidabile è il modello di destrano solfato di sodio (DSS) la colite nei topi, che riproduce molti dei segni clinici della colite ulcerosa negli esseri umani. Recentemente abbiamo applicato questo modello per testare gli effetti benefici di un integratore alimentare contenentevitamine C ed E, L-arginina, e gli acidi grassi polinsaturi ω3-(PUFA). Abbiamo analizzato diversi parametri di malattia e abbiamo trovato che questo supplemento è stato in grado di migliorare la formazione di edema, danni ai tessuti, l'infiltrazione dei leucociti, stress ossidativo, e la produzione di citochine pro-infiammatorie, che porta a un miglioramento complessivo dell'indice di attività della malattia. In questo articolo, si spiega in dettaglio la corretta applicazione di supplementi nutrizionali che utilizzano il modello di colite DSS in topi C57BL / 6, e come parametri di malattie come l'istologia, lo stress ossidativo e l'infiammazione sono valutati. Analizzando gli effetti benefici dei diversi integratori alimentari può poi eventualmente aprire nuove strade per lo sviluppo di strategie terapeutiche alternative che alleviano i sintomi IBD e / o che prolungano le fasi di remissione senza causare gravi effetti collaterali.

Introduzione

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La colite è una condizione infiammatoria del colon che può causare diarrea e dolore addominale. Colite può essere acuta, in risposta a infezione o allo stress, o può svilupparsi come una malattia cronica, come nella colite ulcerosa (UC), che appartiene al gruppo di malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD). Anche se i segni clinici di UC sono stati ben descritti, la patogenesi è ancora poco conosciuta 1. E 'accettato tra gli esperti che UC è una malattia multifattoriale, con mutazioni genetiche e le risposte immunitarie aberranti che giocano un ruolo importante 2. Tuttavia, i fattori ambientali, come ad esempio lo stile di vita e l'alimentazione, contribuiscono allo sviluppo della malattia e la progressione 3.

Purtroppo, IBD non è curabile, ma ci sono molte opzioni di trattamento che hanno lo scopo di alleviare i sintomi clinici. Gli attuali trattamenti comprendono farmaci anti-infiammatori, come la sulfasalazina e corticosteroidi; immunosoppressori, come azathioPrine; anticorpi monoclonali che catturano pro-infiammatori citochine, come il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), o molecole di adesione a blocchi, come integrine, per ridurre un eccessivo reclutamento dei leucociti; e inibitori che hanno come target le chinasi che attivano percorsi pro-infiammatorie, come Janus chinasi (JAK) 4. Non tutti i pazienti rispondono a tutti i trattamenti, in modo da strategie terapeutiche devono essere personalizzati 5. Inoltre, la maggior parte di questi farmaci terapeutici interferire con il metabolismo e risposte immunitarie, causando spesso gravi effetti collaterali. Per questo motivo, le opzioni di trattamento alternativi sono stati indagati.

Trattamenti alternativi includono probiotici e integratori alimentari, che sono state applicate in modelli animali e studi clinici con diversi livelli di successo 6,7. Abbiamo recentemente dimostrato che l'applicazione di diversi supplementi nutrizionali singoli, quali vitamine antiossidanti o acidi grassi ω3-poli-insaturi (PUFAS), è inferiore alla applicazione di una combinazione di tali integratori per alleviare colite e sintomi della malattia cardiovascolare 8,9. Questi studi sono stati effettuati su topi, così studi clinici devono essere effettuate in esseri umani per determinare se questi risultati saranno applicabili anche agli esseri umani. Prima di studi clinici sono iniziati, l'efficacia e la sicurezza di nuove opzioni di trattamento devono essere valutati in modelli animali.

Per IBD, il modello destrano solfato di sodio (DSS) è stato ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi di sviluppo della malattia e gli effetti benefici dei farmaci e integratori alimentari 6,10. Nella maggior parte degli studi, solo una malattia acuta per un periodo di sette giorni è indotti; tuttavia, i segni clinici osservati in questi animali sono molto simili a quelli osservati nei pazienti con malattia infiammatoria intestinale (ad esempio, diarrea con sangue, perdita di peso, disfunzione epiteliale, e l'infiltrazione di cellule immunitarie) 10. DSS induce erosioni della mucosa,con conseguente disfunzione barriera e in un aumento della permeabilità epiteliale intestinale 11. L'esatto meccanismo resta sconosciuto. Tuttavia, uno studio suggerisce che DSS interagisce con acidi a catena media lunghezza grassi per formare nano-lipocomplexes che sono in grado di entrare nelle cellule epiteliali e indurre segnalazione infiammatoria Percorsi di 12. In questo articolo, si descrive in dettaglio come colite è indotta e analizzato nei topi, come integratori alimentari sono applicate dalla sonda gastrica per garantire un dosaggio costante in ogni animale, e in che modo vengono esaminati gli effetti di tali supplementi su vari sintomi colite.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali di Cinvestav.

1. Preparazione del DSS acqua potabile e l'induzione della colite

  1. Preparare un 3,5% w / v soluzione di destrano solfato di sodio (DSS) in acqua potabile autoclavato. DSS scioglie facilmente e non è necessario filtrare la soluzione finale.
    NOTA: 7 giorni di trattamento DSS induce grave colite. Se inducendo la colite lieve, 3 - sono raccomandati 4 giorni di trattamento. Finché l'acqua potabile DSS rimane chiara, non è necessario cambiare l'acqua. Tuttavia, se diventa torbida, deve essere sostituito.
  2. Registrare il peso di base di topi maschi. Garantire che essi sono 8 - 12 settimane di età e in un intervallo di 21 - 25 g di peso corporeo.
    NOTA: La concentrazione DSS appropriato deve essere ottimizzata in ogni laboratorio. I risultati possono variare notevolmente, a seconda delle condizioni abitative. Concentrazioni 2,5-5% di solito sono segnalati per indurre forti colitis in C57Bl / 6J WT topi 10. DSS da diverse società e diversi lotti deve essere testato, come i risultati possono anche variare con diverse fonti di DSS.
  3. Fornire acqua ad libitum e sostituirla con acqua fresca DSS 3,5%, se necessario.

2. Applicazione di integratori alimentari da Gavage

  1. Preparare una soluzione "alimentabile" dei supplementi nutrizionali desiderati in un solvente appropriato. Per questo studio, abbiamo utilizzato una miscela contenente 200 mg / kg di L-arginina, 83 mg / kg di vitamina C, 46 mg / kg di vitamina E, 77 mg / kg eicosapentaenoico acido (EPA) e / kg acido docosaesaenoico 115 mg (DHA ) in una soluzione 1: 1 di acqua e olio di cartamo.
  2. Riempire una siringa da 1 mL collegato ad un ago sonda gastrica (15 G x 50 mm) con la miscela integratore nutrizionale. Pulire l'esterno dell'ago gavage per rimuovere qualsiasi composto esterna dell'ago e per assicurare l'applicazione giusta dose.
  3. Trattenere il mouse afferrando la base della coda conuna mano e saldamente presa una piega della pelle nella parte posteriore del collo con il pollice e l'indice dell'altra mano. Posizionare la coda tra il terzo dito e la base del pollice della stessa mano che impugna il manico.
  4. Pur mantenendo il mouse in posizione verticale, inserire l'ago nel lato sinistro della bocca dell'animale e seguire attentamente il tetto della bocca per individuare l'esofago. Se si incontra alcuna resistenza, far avanzare l'ago verso lo stomaco.
    NOTA: verificare che l'animale sta respirando correttamente prima di procedere.
  5. Somministrare la miscela lentamente, rimuovere il tubo lentamente tirando fuori la siringa, e rilasciare il mouse. Applicare supplementi nutrizionali volta al giorno mediante sonda gastrica nel corso dell'esperimento colite.

3. Determinazione del Disease Activity Index

NOTA: L'indice di attività della malattia è la combinazione dei punteggi per la perdita di peso, sanguinamento perianale, e la consistenza delle feci, che sono obnuto giornaliera 13.

  1. Misurare il peso corporeo al giorno e assegnare un punteggio da 0 a 4 in base alla percentuale di perdita di peso (0: 0%, 1: 1 - 5%, 2: 5 - 10%, 3: 10 - 20% e 4:> 20 %).
    NOTA: peso corporeo perdita è determinato calcolando la differenza percentuale tra il peso basale prima dell'induzione di DSS-colite e il peso reale.
  2. Per determinare il livello di sanguinamento perianale, raccogliere un campione di feci fresco e utilizzare i applicatori forniti per applicare un sottile striscio su un vetrino da un kit di guaiaco fecale test del sangue occulto. Utilizzare un applicatore fresco per ogni campione.
    1. Chiudere il coperchio sulla parte anteriore e aprire la finestra sul retro del vetrino. Applicare due gocce di soluzione di sviluppo alla parte posteriore nella posizione del campione.
    2. Leggere i risultati dopo 30 s. Qualsiasi traccia di colore blu è positivo per sangue occulto. Assegnare un punteggio di 0 a 4 (0: nessuno, 0,5-2,5: guaiaco positivo di test fecale del sangue occulto (a seconda della potenza del segnale), e 3 - 4: gross sanguinamento).
      NOTA: Se il sangue nelle feci è visibile, il test del sangue occulto fecale guaiaco non deve essere eseguito, e un punteggio di 3, 3,5, o 4 viene assegnato, a seconda della quantità di sangue visibile.
  3. Determinare la consistenza delle feci osservando un campione di feci fresco. Assegnare un punteggio di 0 a 4 (0: normale solido, 0,5 / - 2,5: sgabello pastosa, e 3 - 4: diarrea).

4. Determinazione epiteliali intestinali permeabilità In Vivo da Evans Blu Assay

  1. Anestetizzare gli animali iniettando loro per via intraperitoneale con una miscela di ketamina (100 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (13 mg / kg di peso corporeo) diluito in soluzione salina (0,9% NaCl), e valutare la profondità dell'anestesia monitorando il colpo ritiro reflex.
  2. Mettere gli animali anestetizzati in posizione supina ed eseguire una laparotomia per esporre l'intestino.
  3. Individuare il cieco e fare una piccola incisione nel segmento prossimale del colon unscendens (idealmente, immediatamente adiacente al cieco).
  4. Inserire un ago di alimentazione (G22) e fissarlo con una legatura con un filo di seta comune. Attenzione a filo abbondante PBS attraverso il tubo di sciacquare tutti feci dal colon. Instillare soluzione Evans blue (1,5% w / v in PBS) nel colon fino a raggiungere l'ano.
  5. Incubare il blu di Evans per 15 min. Lavare il colorante irrigando il tubo con abbondante PBS fino a quando il washout perianale è chiara.
  6. Eutanasia gli animali da dislocazione cervicale.
  7. Accise L'colon e sciacquare di nuovo con abbondante PBS. Risciacquare una volta con 1 ml di 6 mm N -acetylcysteine in PBS per eliminare il colorante attaccarsi alla mucosa del colon.
  8. Tagliare il colon longitudinalmente e risciacquare ancora una volta con PBS e 1 mL di 6 mM N -acetylcysteine.
  9. Registrare il peso e lunghezza. Per estrarre il colorante blu Evans, posizionare il colon in 2 ml di N, N -dimethylformamide notte a temperatura ambiente con delicata agitation. Misurare la concentrazione di colorante spettrofotometricamente a 610 nm.

5. Tessuto Collection

  1. Anestetizzare gli animali iniettando loro per via intraperitoneale con una miscela di ketamina (100 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (13 mg / kg di peso corporeo) diluito in soluzione salina (0,9% NaCl), e valutare la profondità dell'anestesia monitorando il colpo ritiro reflex.
  2. Eutanasia gli animali da dislocazione cervicale.
  3. Posizionare gli animali in posizione supina ed eseguire una laparotomia per esporre la cavità addominale.
  4. Utilizzando le forbici, sezionare tutto il colon e registrare la sua lunghezza.
  5. Lavare il colon con cura più volte con refrigerata PBS per rimuovere le feci. Registrare il peso del tessuto e preparare le seguenti esperimenti, come descritto ai punti 5.6 - 5.8.
  6. Per l'isolamento di RNA e mieloperossidasi (MPO) saggi, tagliare un campione di tessuto di dimensioni adeguate (100 mg di solito è sufficiente), posizionarlo all'interno di un tubo, e SNAp-congelare in azoto liquido. Conservare i tessuti a -80 ° C per un uso futuro.
  7. Per immunofluorescenza e la determinazione dello stress ossidativo (vedi sotto), tagliare un piccolo campione del colon (0,5-1 cm) e immergere in tazze in alluminio piccoli pieni di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto. Posizionare le coppe su ghiaccio secco e lasciarli congelare lentamente, per evitare la formazione di bolle. campioni di tessuto congelati possono essere conservati a -80 ° C per un uso futuro.
  8. Per svizzero rotola 14, aprire il colon longitudinalmente e rimuovere con cautela le feci con pinze. Arrotolare, con la mucosa rivolto verso l'interno, con pinze punta fine o una sottile, tondo bastone di legno. Posizionare con cura dentro una cassetta embedding e continuare con il passo 6.1.
    NOTA: DSS induce danni nel colon. Tuttavia, la distribuzione danni varia dal prossimale al colon distale, con la maggior parte dei danni di solito visto nel colon distale e del retto. Così, si consiglia di analizzare l'istologia sia nella col distaleo in ruoli svizzeri di tutto il colon.

6. Analisi di Colon Istologia da ematossilina-eosina

  1. Preparazione del tessuto
    1. Per l'analisi istologica, immergere entrambi i rulli svizzeri o piccoli pezzi di tessuto da alcune regioni del colon di controllo e topi trattati in 5 mL di formaldeide al 10% per 48 ore a temperatura ambiente (RT) per ottenere il corretto fissaggio.
      NOTA: Tutte le fasi successive al passaggio 6 vengono effettuate a temperatura ambiente, se non diversamente indicato.
    2. lavarli con acqua corrente per 18 h.
    3. li Disidratare con 15 ml di etanolo al 70% per 1 h, 96% per 1 h, ed etanolo assoluto per 1 h. Ripetere ogni passo con l'alcol fresca prima di procedere alla successiva concentrazione.
    4. Continuare la disidratazione in una miscela di 7,5 ml di etanolo assoluto e 7,5 ml di xilene assoluta per 1 h. Ripetere una volta prima di passare i campioni da 15 ml di xilene assoluta per 1 h. Ripetere questo passaggio una volta con xilene fresco.
  2. Incorporare campioni Colon tessuti in paraffina
    1. Immergere i campioni in 50 mL di paraffina liquida per 17 h. Ripetere questo passaggio una volta, ma solo per 3 ore.
    2. Immergere i campioni a cubetti (plastica, stampo quadrato, formato: 22 x 22 x 22 mm) in 810 ml di paraffina liquida.
    3. Lasciare la paraffina con i campioni di tessuto del colon solidificare per 24 ore a RT.
  3. Taglio del tessuto sezioni trasversali utilizzando un microtomo
    1. Tagliare i campioni del colon utilizzando un microtomo, secondo le istruzioni del produttore, con uno spessore di 5 micron.
    2. Raccogliere i tagli in un bagno d'acqua (1 L) contenente 0,3% di gelatina. Ciò impedisce la piegatura del tessuto sezioni trasversali. Recuperare le sezioni di tessuto e montarli su vetrini.
  4. Colorazione ematossilina-eosina di tessuto Sezioni
    1. Deparaffinare i campioni per 18 ore a 60 ° C in un incubatore. A questo scopo, utilizzare un vetro slide cremagliera con un manico.
    2. Dopo deparaffinizzazione, immergere i vetrini in 70 ml di xilene assoluto per 5 min. Ripetere questo passaggio una volta con xilene fresco.
    3. Trasferire i campioni in 70 ml di alcool assoluto per 1 min. Ripetere questo passaggio una volta con l'alcol fresco.
    4. Incubare i campioni di tessuto del colon in 70 ml di etanolo al 96% per 1 min. Ripetere questo passaggio una volta con l'alcol fresco.
    5. Lavare i campioni in acqua di rubinetto due volte per 2 s.
    6. Incubare i tessuti in ematossilina di Harris per 7 minuti.
    7. Lavare i campioni in acqua di rubinetto due volte per 2 s.
    8. Incubare i campioni in alcol acida (70 ml di etanolo al 70% e 700 ml di 1 M di acido cloridrico) per 7 s.
    9. Lavare i campioni in acqua di rubinetto due volte per 2 s.
    10. Incubare i campioni di tessuto in 70 mL di carbonato di litio (1 g di carbonato di litio in 100 ml di acqua distillata) per 7 s.
    11. Lavare i campioni in acqua di rubinetto due volte per 2 s.
    12. Incubare i campioni in 70 ml di etanolo 80% Per 1 min.
    13. Trasferire i campioni in 70 ml di Eosina-Y per 15 s.
    14. incubare in 70 ml di etanolo al 96% per 1 min. Ripetere questo passaggio una volta con l'alcol fresco.
    15. Incubare i campioni di tessuto in 70 ml di etanolo assoluto (alcool etilico anidro assoluto) per 1 min. Ripetere questo passaggio una volta con l'alcol fresco.
    16. Incubare i campioni in 70 mL di una miscela di 35 ml di alcol assoluto e 35 ml di xilene assoluta per 1 min.
    17. Trasferire i campioni in 70 mL di xilene assoluta per 1 min. Ripetere questa operazione per 5 minuti in 70 ml di xilene fresco assoluta.
    18. Aggiungere 80 ml di resina sintetica per i campioni di tessuto del colon, coprirli con coprioggetto, e lasciarli asciugare per 24 ore a temperatura ambiente. Infine, analizzare i campioni utilizzando in campo chiaro microscopia a 8.

7. Analisi Junction Composizione per immunofluorescenza

  1. Preparare il tessuto come descritto al punto 5.7 e tagliare 8 micron di spessore sezioniutilizzando un criostato.
  2. Fissare e permeabilize colon sezioni con 96% di etanolo a -20 ° C per 20 min.
    NOTA: Tutte le incubazioni successive deve essere effettuata a temperatura ambiente, se non diversamente specificato, in una scatola buia umido per evitare l'essiccazione e fluorocromo sbiadimento.
  3. campioni di aria secca, e poi sciacquare li 3 volte per 5 minuti ciascuno con PBS 1x
  4. Incubare i campioni con soluzione bloccante (PBS contenente 0,01% di Tween e il 2% BSA) per 2 ore.
  5. Rimuovere la soluzione di saturazione e sciacquarlo con PBS-Tween 0,01% per 10 min.
  6. Durante questo tempo, diluire gli anticorpi primari alle concentrazioni desiderate in PBS-Tween 0,01%.
  7. Rimuovere la soluzione di lavaggio, applicare la soluzione di anticorpi dal passaggio precedente, e incubare una notte a 4 ° C in una scatola umidificata.
  8. Rimuovere la soluzione di anticorpi e lavare 3 volte con PBS-Tween 0,01% per 5 minuti ciascuno e una volta con acqua deionizzata per 10 min, con molto blanda agitazione.
  9. Durante il lavaggio, centrifuga Fluorochromeconjugated, specie-specifici anticorpi secondari a 14000g per 20 min a 4 ° C.
  10. Diluire gli anticorpi secondari senza precipitati come indicato dal fornitore in PBS-Tween 0,01%, applicarle, e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
  11. Ripetere passaggio 7.8 e rimuovere la soluzione di lavaggio più completo possibile.
  12. Dispensare 4 ml di agente anti-sbiadimento sopra ogni campione sul vetrino.
  13. Coprire i campioni con un coprioggetto.
  14. asciugare all'aria per 1 ora.
  15. scivolo Seal con smalto. Diapositive possono essere conservati a -20 ° C fino ad ulteriore analisi.
  16. Analizzare su un microscopio laser confocale 8.

8. Determinazione dello Stress Ossidativo per ossidazione di etidio

  1. Dopo 7 giorni di DSS colite, preparare il tessuto come descritto al punto 5.7 e tagliare sezioni del colon in un criostato ad uno spessore di 5 micron. Mount sezioni su vetrini trattati con soluzione di lisina poli-L-e incubare il campione ingegnoh 5 mM di dihydroethidium (DHE) in acqua a 37 ° C per 30 minuti al buio.
  2. Lavare i campioni con PBS (pH 7,6) tre volte per 15 minuti ciascuno con agitazione a temperatura ambiente. Far asciugare i campioni e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio per proteggere la fluorescenza. Osservare la fluorescenza di etidio ossidato su un microscopio confocale a scansione laser (ingrandimento 40X, 568 nm).

9. Analisi dei leucociti reclutamento da parte MPO Assay

  1. Dopo 7 giorni di DSS colite, raccogliere il tessuto del colon e omogeneizzare i campioni (200-400 mg) con 1 ml di esadeciltrimetilammonio (HTAB) tampone (0,5% HTAB in tampone fosfato 50 mM, pH 6,0) usando un omogeneizzatore sul ghiaccio.
  2. Risciacquare la punta del omogeneizzatore due volte con 1 ml di tampone di HTAB per includere tutti i tessuti nel lisato e sonicare cinque volte a 40% di ampiezza per 10 s ciascuno. Gelo-disgelo in azoto liquido per tre volte.
  3. Centrifugare a 14.000 xg per 15 minuti e raccogliere il surnatante.Preparare 2,2'-Azino-bis soluzione (3-ethylbenzothiazoline-6-solfonico) (ABTS) mescolando ABTS, 5 ml di citrato di sodio (1 M in acqua), 0,1 ml di perossido di idrogeno, e 45 mL di bi -acqua distillata.
  4. Mescolare 0,1 ml di ciascun surnatante con 0,1 ml di ABTS soluzione in una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto. Dopo 10 minuti, misurare l'assorbanza a 460 nm utilizzando uno spettrofotometro.

10. Valutare l'espressione di citochine pro-infiammatorie mediante PCR

  1. Tissue omogeneizzazione
    1. Omogeneizzare 50 a 100 mg di campioni di tessuto del colon in 1 mL di una miscela guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio acido usando un omogeneizzatore alimentazione.
    2. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
  2. fase di separazione
    1. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e agitare vigorosamente per 30 s.
    2. Incubare a 4 ° C per 30 min.
    3. Centrifugare a 12.000 xg per 60 min a 4 ° C.
    4. Trasferire la ufase acquosa pper in una nuova provetta (~ 500 mL).
  3. RNA Precipitazione e Resuspension
    1. Aggiungere 0,5 ml di alcool isopropilico e incubare i campioni a 4 ° C per 60 min.
    2. Centrifugare a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C.
    3. Rimuovere completamente il surnatante.
    4. Aggiungere 1 ml di etanolo al 75% e vortice.
    5. Centrifugare a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C.
    6. Rimuovere il surnatante.
    7. Consentire l'etanolo restante asciugare all'aria per 3-5 minuti.
      NOTA: E 'importante non lasciare che il pellet di RNA asciughi completamente, in quanto questo diminuisce notevolmente la sua solubilità.
    8. Re-sciogliere il pellet in 0,3 ml di dietilpirocarbonato (DEPC) acqua -treated. trascrivere immediatamente i campioni di RNA in cDNA (più stabile, vedere il punto 10.5) o conservare a -80 ° C.
  4. RNA Quantificazione
    1. Diluire 1 ml di RNA con 99 ml di acqua DEPC-trattata.
    2. Leggere THe OD a 260 nm e 280 nm usando un UV / VIS spettrofotometro per determinare la concentrazione del campione e purezza.
  5. cDNA Synthesis
    1. Mescolare campioni di RNA (1-5 mcg) con 1 ml di Oligo (dT) 12-18 (0,5 mg / mL) e acqua DEPC trattati (volume totale di 12 mL) in provette sterili RNase-free.
    2. Incubare a 70 ° C per 10 min.
    3. Aggiungere 2 ml di 10x PCR Buffer, 1 ml di 50 mM MgCl 2, 1 ml di 10 mM dNTP mix, e 2 ml di 0,1 M ditiotreitolo (DTT).
    4. Incubare a 4 ° C per 5 min.
    5. Aggiungere 1 ml di trascrittasi inversa e incubare a 42 ° C per 5 min.
    6. Incubare a 70 ° C per 15 min.
    7. Incubare a 4 ° C per 15 min. cDNA può essere conservato a -20 ° C fino all'utilizzo.
  6. PCR
    1. Mescolare 2,5 ml di 10x PCR Buffer, 1,5 ml di 25 mM MgCl 2, 0,5 ml di 10 mM dNTP Mix, 0,25 μL di Taq DNA polimerasi, 0,25 ml di ciascun primer (10 pM) e cDNA (100 ng), e acqua sterile fino ad un volume totale di 25 microlitri.
    2. Eseguire i campioni su un termociclatore a 96 pozzetti. Per evitare l'amplificazione del DNA genomico, avanti e indietro primer devono essere situati in differenti esoni: IL1β-FW: GCAACTGTTCCTGAACTCAACT e IL1β-RE: TCTTTTGGGGTCCGTCAACT; IL6-FW: CCTTCCTACCCCAATTTCCAA e IL6-RE: AGATGAATTGGATGGTCTTGGTC; KC-FW: TGTCAGTGCCTGCAGACCAT e KC-RE: CCTGAGGGCAACACCTTCA; e Actina-FW: TATCCACCTTCCAGCAGATGT e Actina-RE: AGCTCAGTAACAGTCCGCCTA. Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: 95 ° C per 5 min seguita da 30 cicli a 95 ° C per 15 s, 58 ° C per 30 s, e 72 ° C per 30 s, più una estensione finale per 10 minuti a 72 ° C .

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Risultati

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Dieta Supplementi possono proteggere dal DSS colite

supplementi dietetici anti-infiammatorie e antiossidanti, come la vitamina C, vitamina E, l'ossido nitrico (NO) -source L-arginina, e acidi grassi polinsaturi ω3-(ω3-PUFA), sono stati utilizzati con successo variabile in animali modelli per alleviare i segni di malattie infiammatorie 3,6,15. Malnutrizione, stress ossidativo, e la produzione di citochine pro-infiammato...

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Discussione

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Per poter utilizzare integratori alimentari negli studi clinici, i benefici e la sicurezza di tali supplementi devono essere attentamente valutati in vivo negli studi sugli animali. Nel caso di colite, diversi modelli animali appropriati che ricordano i segni clinici di IBD sono state stabilite, compresi i modelli chimici utilizzando DSS, TNBS, o acido acetico; modelli (KO), come IL10-KO out knock-; e la colite immuno-mediata dalle cellule utilizzando il trasferimento adottivo di cellule T 19-21. Il ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Consiglio messicano per la Scienza e la Tecnologia (Conacyt, 207.268 e 233.395 a Michael Schnoor). KFCO è un destinatario di una borsa di studio Conacyt (396.260) per ottenere una laurea magistrale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,3% di gelatinaBioxon158
10% formaldeideJ.T. Baker2106-03
Piastra a 96 pozzetti con fondo piattoCorning3368
Etanolo assoluto J.T. Baker9000-03
Xilene assolutoJ.T. Baker9490-03
ABTSSigma AldrichH5882
Albumina sierica bovinaSigma-Aldrich9048-46-8
ColoScreenHelena Laboratories5072
Corabion (gentilmente fornito da Merck, Naucalpan, Messico)Merck
Destrano solfato sale di sodioAffymetrix9011-18-1(M.W. 40.000-50.000)
DiidroetidioLife TechnologyD11347
Eosin-Y J.T. BakerL087-03
Evans bluSigma-Aldrich314-13-6
Ago di alimentazioneCadence Science Inc.9921
Rack per vetrini in vetro con manigliaMicroscopia elettronica70312-16
Vetrini in vetroCorning2947
Ematossilina di HarrisSigma-AldrichH3136
Esadeciltrimetiammonio (HTAB)Sigma AldrichH6269
Histosette (cassetta di inclusione)SimportM498.2
Acido cloridrico 1 MJ.T. Baker9535-62
Perossido di idrogenoSigma AldrichH3410
KetaminaPiSA AgropecuariaQ-7833-028
Paraffina liquidaParaplast39501-006
Carbonato di litio Sigma-Aldrich2362
N,N-dimetilformammideJ.T. Baker68-12-2
N-acetilcisteinaSigma-AldrichA9165
Cubi di plastica Microscopiaelettronica70181
Soluzione di poli-L-lisinaSigma-Aldrich25988-63-0
Prisma 5 statistico softwareGraphPad softwarePrism 5
Soluzione salina 0,9% NaClCS PiSAQ-7833-009
Citrato di sodioSigma-AldrichW302600
Resina sintetica Poly Mont7987
Taq DNA polimerasiInvitrogen11615-010
Tissue-tek. O.C.T CompoundSakura Finetek4583
Siringa tuberculinaBD Plastipak305945
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5
VECTASHIELD Antifade Mezzo di montaggio con DAPIVector LaboratoriesH-1200
XilazinaPiSA AgropecuariaQ-7833-099

Riferimenti

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  1. Souza, H. S., Fiocchi, C. Immunopathogenesis of IBD: current state of the art. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 13-27 (2016).
  2. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
  3. Neuman, M. G., Nanau, R. M. Inflammatory bowel disease: role of diet, microbiota, life style. Transl Res. 160, 29-44 (2011).
  4. Lowenberg, M., D'Haens, G. Next-Generation Therapeutics for IBD. Current Gastroenterol Rep. 17, 21(2015).
  5. Bernstein, C. N. Does everyone with inflammatory bowel disease need to be treated with combination therapy. Curr Opin Gastroenterol. , (2016).
  6. Nanau, R. M., Neuman, M. G. Nutritional and probiotic supplementation in colitis models. Dig Dis Sci. 57, 2786-2810 (2012).
  7. Yamamoto, T. Nutrition and diet in inflammatory bowel disease. Curr Opin Gastroenterol. 29, 216-221 (2013).
  8. Vargas Robles, H., et al. Experimental Colitis Is Attenuated by Cardioprotective Diet Supplementation That Reduces Oxidative Stress, Inflammation, and Mucosal Damage. Ox Med Cell Longev. , 8473242(2016).
  9. Vargas-Robles, H., Rios, A., Arellano-Mendoza, M., Escalante, B. A., Schnoor, M. Antioxidative diet supplementation reverses high-fat diet-induced increases of cardiovascular risk factors in mice. Ox Med Cell Longev. 2015, 467471(2015).
  10. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617(2012).
  11. Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Curr. Protoc. Immunol. 104, Unit 15 25(2014).
  12. Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, 32084(2009).
  13. Mennigen, R., et al. Probiotic mixture VSL#3 protects the epithelial barrier by maintaining tight junction protein expression and preventing apoptosis in a murine model of colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, 1140-1149 (2009).
  14. Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, 115-120 (1987).
  15. Shen, W., Gaskins, H. R., McIntosh, M. K. Influence of dietary fat on intestinal microbes, inflammation, barrier function and metabolic outcomes. J Nutr Biochem. , (2013).
  16. Bruewer, M., et al. Interferon-gamma induces internalization of epithelial tight junction proteins via a macropinocytosis-like process. FASEB J. 19, 923-933 (2005).
  17. Fournier, B. M., Parkos, C. A. The role of neutrophils during intestinal inflammation. Muc Immunol. 5, 354-366 (2012).
  18. Yan, Y., et al. Temporal and spatial analysis of clinical and molecular parameters in dextran sodium sulfate induced colitis. PLoS One. 4, 6073(2009).
  19. Maxwell, J. R., Viney, J. L. Overview of mouse models of inflammatory bowel disease and their use in drug discovery. Curr Prot Pharmacol, S.J. Enna. , Chapter 5, Unit 5.57 (2009).
  20. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, 135-146 (2009).
  21. Randhawa, P. K., Singh, K., Singh, N., Jaggi, A. S. A review on chemical-induced inflammatory bowel disease models in rodents. Kor J Physiol Pharmacol. 18, 279-288 (2014).
  22. Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). JoVE. , (2010).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Prot. 2, 541-546 (2007).
  24. Naydenov, N. G., et al. Nonmuscle Myosin IIA Regulates Intestinal Epithelial Barrier in vivo and Plays a Protective Role During Experimental Colitis. Sci Rep. 6, 24161(2016).
  25. Sumagin, R., Robin, A. Z., Nusrat, A., Parkos, C. A. Transmigrated neutrophils in the intestinal lumen engage ICAM-1 to regulate the epithelial barrier and neutrophil recruitment. Muc Immunol. 7, 905-915 (2014).
  26. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).
  27. Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 360(2013).

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