Monitoraggio del Astrocyte reattività e proliferazione in Vitro in condizioni ischemiche-come

Sommario

Ictus ischemico è un evento complesso in cui il contributo specifico degli astrociti nella regione colpite del cervello esposto alla privazione di ossigeno glucosio (OGD) è difficile da studiare. Questo articolo introduce una metodologia per ottenere gli astrociti isolati e studiare la loro reattività e la proliferazione in condizioni OGD.

Abstract

Ictus ischemico è una lesione complessa del cervello causata da un trombo o embolo che ostruisce il flusso di sangue alle parti del cervello. Questo porta alla privazione di ossigeno e glucosio, che causa guasto di energia e morte neuronale. Dopo un insulto di colpo ischemico, astrociti diventano reattivi e proliferano attorno al sito di lesione, come si sviluppa. In questo scenario, è difficile studiare il contributo specifico dei astrocytes per la regione del cervello esposto ad ischemia. Di conseguenza, questo articolo introduce una metodologia per studiare la reattività Astrocita primario e proliferazione sotto un modello in vitro di un ambiente di ischemia-simile, chiamato privazione di ossigeno glucosio (OGD). Gli astrociti sono stati isolati da 1-4 giorno-vecchi ratti neonatali e il numero di cellule astrocytic aspecifica è stata valutata utilizzando Astrocita marcatore selettivo della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e macchiatura nucleare. Il periodo in cui gli astrociti sono sottoposti alla condizione OGD può essere personalizzato, così come la percentuale di ossigeno a che sono esposti. Questa flessibilità permette agli scienziati di caratterizzare la durata della condizione ischemica-come in diversi gruppi di cellule in vitro. Questo articolo discute i tempi di consegna di OGD che inducono la reattività di astrociti, morfologia ipertrofica e proliferazione come misurato dall'immunofluorescenza usando proliferando Cell Nuclear Antigen (PCNA). Oltre alla proliferazione, astrociti subiscono l'energia e lo sforzo ossidativo e rispondono agli OGD attraverso il rilascio di fattori solubili nel mezzo delle cellule. Questo mezzo possa essere raccolte e utilizzato per analizzare gli effetti delle molecole rilasciate dai astrocytes in colture neuronali primarie senza interazione cellula--cellula. In sintesi, questo modello della coltura cellulare primaria in modo efficiente consente di comprendere il ruolo degli astrociti isolati dopo un danno.

Introduzione

Ictus è definito come "un'acuta disfunzione neurologica di origine vascolare con sviluppo rapido o improvviso dei sintomi e dei segni, corrispondenti alla partecipazione delle zone focali del cervello"^1,2. Ci sono due tipi di ictus: ischemico ed emorragico. Quando la disfunzione vascolare è causata da un aneurisma o un malfunzionamento arterovenoso, accompagnato da indebolimento con posteriore rottura di un'arteria, questo è definito ictus emorragico³ che, nella maggior parte dei casi conduce alla morte. Quando un trombo o un embolo ostacola il flusso di sangue, causando una temporanea ....

Protocollo

ratti postnatali (Sprague Dawley) 1-4 giorni vecchi vengono utilizzate per isolare cortecce. Il metodo dell'eutanasia è la decapitazione, come approvato dalla linee guida NIH.

1. preparazione degli strumenti e materiali per la chirurgia

1. strumenti di sterilizzare in autoclave (temperatura: 121 ° c, pressione: 15 psi, tempo: 30 minuti) utilizzando una scatola d'acciaio o un istante di sigillamento del sacchetto di sterilizzazione. Vedi materiali nella Tabella materiali.

2. Completare la preparazione di DMEM

1. In un becher da un litro contenente 700 mL di acqua in autocla....

Risultati

Una delle preoccupazioni principali della cultura astrocytic primario è la presenza di altre cellule come i neuroni, oligodendrociti, fibroblasti e microglia. Nella Figura 1, cellule isolate da cortecce di ratto avevano preparato cambia ogni 3 giorni e sono stati o non trattata o trattata con aggiunto LME per 1 h. 24 h più successivamente, le cellule immunostained per GFAP e controcolorati con DAPI. Le cellule non trattate hanno mostrato una media di 39% non-.......

Discussione

Questo protocollo descrive l'isolamento degli astrociti da cortecce di ratto. In questo metodo, è fondamentale per ridurre la contaminazione con altri tipi cellulari come microglia, oligodendrociti e fibroblasti. Per ridurre il numero di microglia, si possono adottare diverse misure: cambiando la media, agitazione orbitale e trattamenti chimici. Una volta che la purezza di cultura è confermata dall'immunofluorescenza usando gli indicatori cellulari selettivi o per i contaminanti più prominenti di cella, gli esperimenti p.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumenti per Chirurgia - Step 1
Forbice operativa 5.5"	Roboz Company	RS-6812	Strumenti utilizzati per decapitare i topi.
Pinza curva 7"	Roboz Company	RS-5271	Trattiene la pelle del topo mentre il cranio viene rimosso.
Forbici per micro-dissezione 4"	Roboz Company	RS-5882	Taglia sia la pelle che il cranio del topo.
Pinza per micro-dissezione da 4" angolata, finemente affilata	Roboz Company	RS-5095	Trattiene la pelle del topo mentre il cranio viene rimosso.
Pinza per micro-dissezione da 4" leggermente curva 0.8	Roboz Company	RS-5135	Strumento utilizzato per separare le cortecce.
Pinzetta per micro-dissezione	Roboz Company	RS-4972	Sbuccia le meningi cerebrali.
Microscopio di dissezione	Olympus	SZX16	Importante per rimuovere la meninge dalle cortecce naturali.
Preparazione DMEM - fase 2
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)	GibCo. Azienda	11995-065	Supporta la crescita delle cellule.
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich Company	S7277	Integratore per i terreni di coltura cellulare.
Siero fetale bovino (FBS)	GibCo. Azienda	10437-010	Integratore sieristico per la coltura cellulare.
Penicillina-Streptomicina	GibCo. L'azienda	15140-148	inibisce la crescita dei batteri nella coltura cellulare.
Sistema di filtraggio 1L con pori da 0,22 um	Corning	431098
Coltura di astrociti - fase 3
Pipette sierologiche 5mL	VWR	89130-896	Per pipettare il DMEM in contenitori con cellule.
Pipette sierologiche 10mL	VWR	89130-898	Per pipettare DMEM in contenitori con cellule.
Pipette sierologiche 25mL	VWR	89130-900	Per pipettare DMEM in contenitori con cellule.
Provetta conica per centrifuga 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Provetta safe-lock 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
Piastre di Petri da 60 mm	Falcon	351007
Tamponi di garza sterili	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturare il tessuto cerebrale.
Stomacher 80 Blender Sacchetti sterili Sewar	Lab System	BA6040	Sacchetto sterile per l'omogeneizzatore cellulare stomacher.
Becher 400mL	Pyrex	1000
Setaccio sterile per dissociazione cellulare, maglia #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	Per ottenere una sospensione uniforme a cella singola.
Setaccio sterile per dissociazione cellulare, maglia #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	Per ottenere una sospensione uniforme di una singola cellula.
Microscopio a fase invertita	Nikon	Eclypse Ti-S	Verifica la presenza di contaminazioni o crescita cellulare anomala.
Palloni sterili da 75 cm2	Falcon	353136
Piastra multipozzetto	Falcon	353046
Micro vetri di copertura (vetrini coprioggetti), 18 mm, rotondi	VWR	48380-046
Bright-Line emacitometro	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pipette Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D
Alcool etilico	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucina metil estere cloridrato 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promuove l'eliminazione delle cellule microgliali nel cultutre corticale primario degli astrociti.
Citosina β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poli-D-lisina bromidrato, mol wt 70.000-150.000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Tripsina/EDTA	GibCo. Azienda	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Compresse di soluzione salina tampone fosfato (PBS)	Calbiochem	524650
Acqua sterile	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparazione - fase 5
Centrifuga provetta conica 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco' s Eagle modificato' s glucosio libero medio	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supporta la crescita delle cellule.
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich Company	S7277	Integratore per i terreni di coltura cellulare.
Penicillina-Streptomicina	GibCo. L'azienda	15140-148	inibisce la crescita dei batteri nella coltura cellulare.
200mM  L-glutammina	GibCo. Azienda	25030-081	Aminoacido che integra la crescita delle cellule.
Compresse di soluzione salina tampone Phospahet (PBS)	Calbiochem	524650
Sistema di filtraggio 50 ml con pori da 0,22 um	Corning	430320
Tubo conico da centrifuga 50 mL	VWR	89039-658
Flussometro singolo	Billups-Rothenberg	SMF3001	Misura del flusso di gas nello spurgo dell'ossigeno.
Camera dell'incubatrice dell'ipossia	StemCell	27310	Genera un ambiente ipossico per la coltura cellulare.
Misuratore di ossigeno disciolto tracciabile	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Miscela di gas	Linde		Elimina l'ossigeno dall'ambiente.
immunofluorescenza primaria degli astrociti - fase 6Compresse di
fosfato (PBS)	Calbiochem	524650
Soluzione di formalina Tampone neutro 10%	Soluzione di HT501128 Sigma-Aldrich		utilizzata per fissare le cellule.
Metanolo	Fisher	A4544	Soluzione utilizzata per fissare le cellule.
Tensioattivo non ionico (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Siero fetale bovino (FBS)	GibCo. Azienda	10437-010	Integratore sieristico per la coltura cellulare.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Rileva i neuroni maturi, serve a convalidare la coltura astrocitica.
Segnalazione cellulare	anti-PCNA	2586	Rileva le cellule proliferanti.
Ioduro di propidio (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Colorazione per apoptosi.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Rileva gli oligodendrociti maturi.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Rileva le cellule microgliali.
Anti-GFAP coniugato con Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Rileva gli astrociti reattivi nelle cellule trattate.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anticorpo secondario anti-topo.
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anticorpo secondario anti-coniglio.
4',6'-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Colorazione nucleare.
Microscopio confocale	Olympus

soluzione salina tampone