Articolo metodologico

Monitoraggio del Astrocyte reattività e proliferazione in Vitro in condizioni ischemiche-come

DOI:

10.3791/55108

⸱

21 ottobre 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical Sciences, Campus, University of Puerto Rico

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ictus ischemico è un evento complesso in cui il contributo specifico degli astrociti nella regione colpite del cervello esposto alla privazione di ossigeno glucosio (OGD) è difficile da studiare. Questo articolo introduce una metodologia per ottenere gli astrociti isolati e studiare la loro reattività e la proliferazione in condizioni OGD.

Abstract

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Ictus ischemico è una lesione complessa del cervello causata da un trombo o embolo che ostruisce il flusso di sangue alle parti del cervello. Questo porta alla privazione di ossigeno e glucosio, che causa guasto di energia e morte neuronale. Dopo un insulto di colpo ischemico, astrociti diventano reattivi e proliferano attorno al sito di lesione, come si sviluppa. In questo scenario, è difficile studiare il contributo specifico dei astrocytes per la regione del cervello esposto ad ischemia. Di conseguenza, questo articolo introduce una metodologia per studiare la reattività Astrocita primario e proliferazione sotto un modello in vitro di un ambiente di ischemia-simile, chiamato privazione di ossigeno glucosio (OGD). Gli astrociti sono stati isolati da 1-4 giorno-vecchi ratti neonatali e il numero di cellule astrocytic aspecifica è stata valutata utilizzando Astrocita marcatore selettivo della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e macchiatura nucleare. Il periodo in cui gli astrociti sono sottoposti alla condizione OGD può essere personalizzato, così come la percentuale di ossigeno a che sono esposti. Questa flessibilità permette agli scienziati di caratterizzare la durata della condizione ischemica-come in diversi gruppi di cellule in vitro. Questo articolo discute i tempi di consegna di OGD che inducono la reattività di astrociti, morfologia ipertrofica e proliferazione come misurato dall'immunofluorescenza usando proliferando Cell Nuclear Antigen (PCNA). Oltre alla proliferazione, astrociti subiscono l'energia e lo sforzo ossidativo e rispondono agli OGD attraverso il rilascio di fattori solubili nel mezzo delle cellule. Questo mezzo possa essere raccolte e utilizzato per analizzare gli effetti delle molecole rilasciate dai astrocytes in colture neuronali primarie senza interazione cellula--cellula. In sintesi, questo modello della coltura cellulare primaria in modo efficiente consente di comprendere il ruolo degli astrociti isolati dopo un danno.

Introduzione

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Ictus è definito come "un'acuta disfunzione neurologica di origine vascolare con sviluppo rapido o improvviso dei sintomi e dei segni, corrispondenti alla partecipazione delle zone focali del cervello"1,2. Ci sono due tipi di ictus: ischemico ed emorragico. Quando la disfunzione vascolare è causata da un aneurisma o un malfunzionamento arterovenoso, accompagnato da indebolimento con posteriore rottura di un'arteria, questo è definito ictus emorragico3 che, nella maggior parte dei casi conduce alla morte. Quando un trombo o un embolo ostacola il flusso di sangue, causando una temporanea privazione di ossigeno e glucosio per una regione del cervello, si chiama colpo ischemico4. Inadempimento di nutrire le cellule intorno alla zona interessata o core ischemico conduce ad un squilibrio omeostatico e metabolico, disfunzione energetica, morte neuronale e l'infiammazione5, che può indurre una disabilità permanente per pazienti6.

L'ictus ischemico è una ferita multifattoriale che coinvolge diversi tipi di cellule che reagiscono ed esercitano i loro effetti in diversi momenti. Molte interazioni creano un ambiente difficile per studiare il comportamento delle singole celle. Così, come noi a studiare il contributo di un tipo specifico delle cellule in un ambiente così complesso? Un modello accettato in vitro di ischemia consiste di esponendo le cellule a deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD), per un certo periodo, seguito dal restauro delle cellule ad un ambiente normoxic. Questo sistema simula un colpo ischemico seguito da riperfusione di sangue. In questo metodo, le cellule o i tessuti sono esposti a una media glucosio-liberi in un ambiente che ha eliminato l'inceppo di ossigeno, utilizzando una camera ipossica specializzata. Il tempo di incubazione di OGD può variare da pochi minuti fino a 24 h, a seconda l'ipotesi che vuole essere testato. Studi hanno dimostrato che in base ai tempi di OGD e normoxic ambiente, fenotipi specifici del colpo (cioè, acuta o subcronica) può essere realizzato. Astrociti isolati, esposti a OGD con restauro posteriore a condizioni di normossia, è un modello di cellulare ben studiato per simulare la corsa in vitro7. Utilizzando OGD è possibile svelare i meccanismi molecolari indipendenti delle cellule isolate in un ambiente di colpo-come.

Come aumenta la nostra conoscenza della biologia di astrociti, è diventato evidente che sono cruciali per mantenere la sinapsi ed il sostenimento di riparazione, di sviluppo e plasticità neurale8. In condizioni normali, gli astrociti rilasciare e rispondere alle citochine, chemochine, fattori di crescita e gliotrasmettitori, mantenendo l'equilibrio metabolico e l'omeostasi nelle sinapsi5,9. In neuroinflammation acuta, come l'ictus ischemico, queste cellule possono diventano reattive, mostrare una lungo termine sovraespressione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e mostrano ipertrofia nella loro morfologia5,10, 11 , 12. come si sviluppa l'infarto ischemico, l'omeostasi fornito da astrociti diventa affetto, per quanto riguarda l'assorbimento normale del glutammato, metabolismo energetico, scambio di molecole attive e antiossidante attività13.

Gli astrociti riattivati proliferano intorno al tessuto di infarto mentre leucociti migrano verso la zona leso14. Proliferazione astrocytic può essere misurata usando gli indicatori come antigene nucleare delle cellule di proliferazione (PCNA), Ki67 e bromodeossiuridina (BrdU)15. Questa risposta proliferativa viene generata in un modo dipendente dal tempo e aiuta a formare la cicatrice gliale, matrice di astrociti reattivi irreversibilmente lungo il parenchima del sito danneggiato dopo un infortunio9. Una delle funzioni iniziali di questa cicatrice è di limitare lo stravaso delle cellule immuni da questa zona. Tuttavia, gli studi hanno mostrato che la cicatrice diventa un impedimento fisico per gli assoni estendere, come essi rilasciare molecole inibendo la crescita assonale e creare una barriera fisica che impedisce che gli assoni che si estende intorno alla zona danneggiata16. Tuttavia, ci è prove scientifiche che dimostrano che dopo una lesione del midollo spinale, completamente prevenire la formazione di cicatrice gliale può alterare la rigenerazione di assoni17. Così, il contesto in cui viene misurata la risposta astrocytic specifica, deve essere considerato al momento il quadro della ferita ha studiato.

La metodologia presentata può essere applicata per studiare la funzione individualizzata dei astrocytes dopo privazione di ossigeno del glucosio e può essere modificato a seconda delle domande che lo sperimentatore vuole rispondere. Ad esempio, oltre il cambiamento morfologico e gli indicatori espressi in tempi diversi di OGD, i surnatanti dagli astrociti esposti a OGD possono essere analizzati ulteriormente per identificare fattori solubili rilasciati da queste cellule, o usato come un media condizionati per valutare la effetto in altre cellule del cervello. Questo approccio permette studi sulla reattività di astrociti che potrebbe portare alla delucidazione dei fattori che regolano e modulano la loro risposta in uno scenario di ictus ischemico.

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Protocollo

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ratti postnatali (Sprague Dawley) 1-4 giorni vecchi vengono utilizzate per isolare cortecce. Il metodo dell'eutanasia è la decapitazione, come approvato dalla linee guida NIH.

1. preparazione degli strumenti e materiali per la chirurgia

  1. strumenti di sterilizzare in autoclave (temperatura: 121 ° c, pressione: 15 psi, tempo: 30 minuti) utilizzando una scatola d'acciaio o un istante di sigillamento del sacchetto di sterilizzazione. Vedi materiali nella Tabella materiali.

2. Completare la preparazione di DMEM

  1. In un becher da un litro contenente 700 mL di acqua in autoclave, aggiungere Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Media polvere a temperatura ambiente.
  2. Aggiungere bicarbonato di sodio di 3,7 g/L, mentre la soluzione è agitata con un agitatore magnetico.
    3. Regolare il pH a 7.4, con acqua in autoclave
  3. portare il volume fino a 1 L, quindi filtrare. Ai fini della cultura, integrare il volume desiderato di media con 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina e caldo a 37 ˚ c. Vedi materiali nella Tabella materiali.
    Nota: Il pH è stato regolato a 7,4 tramite inserimento l'elettrodo di pH metro in media. I media devono essere mescolando, quindi aggiungere lentamente 1 M NaOH con un contagocce.

3. Colture primarie di astrociti

Nota: dopo la semina, cell supporti devono essere cambiati ogni tre giorni e le cellule possono essere coltivate fino a confluenza (11-13 giorni). Il terzo giorno, tocca il pallone più volte ascensore alle cellule della microglia e cellule progenitrici del oligodendrocyte fuori la cultura, rimuovere tutti i ' vecchio ' media, lavare due volte utilizzando 10 mL di PBS, aspirare il PBS, quindi aggiungere fresca nuovi media. Vedi materiali nella Tabella materiali.

    1. Eseguire la dissezione in una cappa di coltura del tessuto la dissezione del cervello di ratto neonato. Ottenere 1-4 giorni vecchi cuccioli di ratto neonato (2 cervelli di ratto sono utilizzati per fiaschetta di 75 cm 2).
    2. Preparare tre piastre di petri da 60 mm e pipettare 5 mL di DMEM completo su ciascuno.
      Nota: Essi possono essere suddivisi come segue: #1 per ogni ratto del cervello, #2 per tutte le cortecce dei cervelli e #3 per tutte le cortecce sbucciate (senza meningi).
    3. Afferrare il cucciolo e spray con etanolo al 70%. Esso decapitare e gettare il corpo in un contenitore per rifiuti biologici piccolo.
    4. Con le pinzette micro-dissezione, tenere la testa e tagliare la pelle in cima alla testa per esporre il cranio.
    5. Con un altro paio di forbici, fare una " T " incisione a partire dalla parte posteriore del cranio verso il naso. Usare un paio di pinze per rimuovere delicatamente il cranio.
    6. Rimuovere il cervello esposto con un paio di pinzette e mettere il cervello in uno dei piatti petri precedentemente riempiti con medie.
    7. Utilizzare un altro set di strumenti sterili per i passi successivi.
    8. Utilizzare micro-dissezione forcipe per posizionare delicatamente un cervello sul coperchio rovesciato di una capsula di Petri 60 mm. Quando la capsula di Petri è collocato su garza sterile, è possibile visualizzare chiaramente il cervello ed è più facile sezionare.
    9. Costante del cervello con il forcipe micro-dissezione e separare l'emisfero cerebrale di delicatamente prendere in giro lungo la fessura del midline con la punta della pinza micro-dissezione.
    10. Trasferimento e sbucciare le cortecce, lasciando dietro di sé la materia bianca e trasferirli in una capsula di Petri, in precedenza denominata #2. Ripetere la procedura per tutti i cervelli, che unisce tutte le cortecce dissecate nella capsula di Petri con etichettata #2.
    11. Estrarre l'ippocampo da sotto ogni corteccia e gettare esso.
    12. Utilizzare le pinzette micro-dissezione e un petri 60mm per Sbucci delicatamente le meningi dai singoli lobi corticali e metterli nel piatto petri denominato #3.
  2. Dissociazione del tessuto: Metodo frullatore omogeneizzatore
    1. versare sospensione tessuto/medio (pelate cortecce del cervello) nel sacchetto sterile frullatore e aggiungere abbastanza terreno per portare il volume totale nel sacchetto a 5ml.
    2. Mettere il sacchetto nel frullatore omogeneizzatore, lasciando circa 2 cm della borsa visibile sopra la porta chiusa. La dissociazione di cella avviene durante 2,5 min ad alta velocità.
      Nota: In alternativa, questo può essere fatto di chiusura del sacchetto e battere delicatamente con un becher nella cappa. Assicurarsi di utilizzare un panno tra la borsa e il bicchiere per evitare attriti.
    3. Versare la sospensione cellulare in un setaccio con maglie numero 60 e poi versare il flusso filtrato attraverso sul setaccio numero 100, permettendogli di filtrare dalla forza di gravità.
    4. Utilizzando 15 mL provette, centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g in una centrifuga clinica (preferibilmente rotore oscillazione) per 5 min.
    5. Versare il sovranatante in un becher, quindi utilizzando una pipetta sierologica, risospendere e dissociare il pellet di cellule in un massimo di 5 mL di media.
  3. Conta cellulare
    1. con una micropipetta, raccogliere 100 µ l di sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere 100 µ l di blu di trypan.
    2. Inserire 10 µ l della sospensione raccolta nell'emocitometro e contare tutte le celle che sono vitali ai quattro angoli del quadrato.
    3. Le formule per calcolare la densità delle cellule prima di preparare le beute sono:
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
    4. aggiungere almeno 500.000 cellule per fiaschetta 2 25 cm. Pipettare fino a 5 mL di DMEM in ciascuna beuta. La miscela non deve raggiungere il collo del pallone. Metterli in un incubatore a 37 ° C 5% CO 2, per 3 giorni, poi cambiare il supporto.
  4. Tecniche di purificazione del astrocyte: supporto di modifica, meccaniche e chimiche strategie
    Nota: il tasso metabolico degli astrociti è alto rispetto ad altri tipi di cellule, di conseguenza, in nutrizionalmente privato condizioni, queste cellule mostrano tassi di sopravvivenza basso dopo pochi giorni. A differenza di astrociti, microglia non sono interessati da privazione nutrizionale e proliferano in tali ambienti 18. Per mantenere un numero ridotto di cellule microgliali, gli autori modificare il terreno di coltura delle cellule astrogliali ogni 3 giorni. Questo continuo cambiamento nella media delle cellule diminuirà anche la popolazione di microglial che può crescere in cima il monostrato di cellule astrocitiche a pallone 19.
    1. Uso un Pasteur pipetta per aspirare i media con le cellule microglial antiaderente da ciascuno dei palloni. Lavare i detriti lasciati alle spalle con PBS sterile filtrata a ciascuno dei palloni in maniera goccia a goccia (5 mL/boccetta).
    2. Aggiungere goccia a goccia il DMEM sterile filtrata (con siero bovino fetale e antibiotico) a ciascuna beuta (5 mL/boccetta). Agitare delicatamente con un movimento circolare per coprire l'intera superficie.
    3. Cellule di posizione in un 37 ° Incubatrice di C in 5% CO 2 per 8-10 giorni fino a raggiungono le beute confluency (> 95% di copertura di lamiera).
      Nota: Diversi protocolli hanno dimostrato che quando gli astrociti raggiungono confluency, metodi meccanici, quali scuotendo la cultura da 2 a 24 h, porta al distacco di cellule che si trovano in cima a questi astrociti, microglia ed il precursore cellule 19 , 20.
    4. Cellule Non-astrocytic sono ridotti nella cultura eseguendo agitazione orbitale a 180 rpm per 30 min. Dopo la rimozione di cellule nel surnatante, media fresco è dispensato nel pallone (~ 15 mL).
    5. Per eliminare le cellule progenitrici del oligodendrocyte, aumentare la velocità di agitazione a 200 giri/min per 6 h 21 , 22 , 23, aspirare il surnatante e dispensare fresca media.
      Nota: Per diminuire la presenza di microglia nelle culture, due metodi chimici possono essere utilizzati in sequenza (non contemporaneamente) nella metodologia cultura cellula primaria: arabinosio citosina (Ara-C) e L-leucina metil estere (LME) 24.
    6. Immediatamente quando le cellule raggiungono la confluenza (100%), 3-4 giorni dopo la rimozione meccanica della microglia, queste cellule possono essere trattate con 8 µM della citosina di arabinosio composta antimitotiche (Ara-C) in DMEM per 5 giorni (cambio giornaliero di Ara-C fresca in DMEM).
      Nota: Il punto di tempo per aggiungere Ara-C è critico, poiché questo composto è una droga antimitotica, che riduce il numero di cellule si dividono rapidamente come fibroblasti e microglia 19 , 25 26 . A differenza di microglia, quando confluenti, astrociti smettere proliferando via inibizione da contatto 27.
    7. 2 giorni per le cellule di recuperare dal trattamento di Ara-C.
    8. Per ridurre ulteriormente la contaminazione microglial, dopo che le cellule di raggiungere confluency, utilizzare 50mm di metilestere di L-leucina (LME) in DMEM fissata a pH 7.4, per 1 h a 37 ˚ c.
      Nota: LME attraversa la membrana delle cellule e degli organelli, e dopo essere idrolizzato, L-leucina prodotta si accumula nei lisosomi di queste cellule. L'accumulo di questo aminoacido porta ad un rigonfiamento osmotico e la rottura dei lisosomi 28 , 29. LME è altamente efficace ad eliminare microglia, rispetto alle altre cellule 20 , 30.

4. Coltivare gli astrociti in piastre da 6 pozzetti

  1. rivestimento coprioggetti con poli-D-lisina
    1. vetrino coprioggetto di mettere uno in ogni piatto di petri 35mm, quindi aggiungere 100 µ l della soluzione diluita poli-D-lisina per ogni vetrino coprioggetto e attendere 1 h.
    2. Rimuovere il poli-D-lisina e lavare due volte con 2 mL di acqua sterile.
    3. Rimuovere l'acqua e attendere per vetrini coprioggetti asciugare all'interno della cappa. Memorizzare i coprioggetti a-20 ° C fino a due settimane.
      Nota: Congelare la soluzione diluita di poli-D-lisina; può essere conservato fino a due settimane.
  2. Trypsinization
    1. usando una pipetta Pasteur, aspirare il mezzo dai palloni. Aggiungere 5 mL/flacone di PBS sterile filtrata per sciacquare delicatamente le cellule.
    2. Aspirato fuori il PBS e quindi aggiungere 5 mL/flacone di filtrato sterile 0,25% tripsina e 0,5 mM soluzione EDTA. Collocare la beuta nel 37 ˚ c, 5% CO 2 incubatore per 10 min.
      Nota: Mentre sono incubando le cellule, caldo 5 mL/flacone di DMEM fresca completa a 37 ° C.
    3. Dopo 10 min di incubazione, agitare per assicurarsi che tutte le celle sono sollevate da pallone. Aggiungere rapidamente i 5 mL di caldo DMEM completo a ciascuna beuta, per neutralizzare la tripsina.
    4. Pipetta delicatamente le cellule su e giù più volte per spezzare qualsiasi " ciuffi ". Trasferimento celle sospese da due boccette a una provetta conica per centrifuga da 15 mL.
    5. Centrifuga per 5 min a 200 x g per raccogliere il pellet cellulare. Risospendere il pellet in 500 µ l di terreno e procedere per inserire le celle in beute.
      Nota: Esempi di analisi da effettuarsi con le cellule: 1) reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR) per analizzare l'espressione genica; 2) Western blot per valutare l'espressione della proteina; 3) analisi di citometria a flusso per quantificare il numero di cellule progenitrici neurali e le proteine di interesse; 4) immunofluorescenza per analizzare l'espressione della proteina e la localizzazione.
  3. Seeding astrociti
    1. dopo il trattamento gli astrociti primari con tripsina (vedere 4.2), raccogliere 100 μL della sospensione di cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere 100 μL di 0,5% del blu di trypan.
    2. Aggiungere 10 μL della sospensione raccolta in trypan blu per l'emocitometro e contare tutte le celle che sono vitali.
    3. Utilizzare le formule in fase 3.3 per calcolare la densità delle cellule prima di preparare le beute.
    4. Preparare il multi-pozzo piatti con l'aggiunta di una sterile, poli-D-lisina rivestito coprioggetto in ciascun pozzetto. Pipettare le 50.000 cellule e riempire il resto del volume in ogni piatto multi-pozzetto con medium fresco (circa 2 mL).
    5. Inserire i piatti multi-pozzetto in incubatore 37 ° c a 5% CO 2 e, dopo 5-7 giorni, gli astrociti possono crescere e ricoprire tutta la superficie delle lamelle.

5. OGD protocollo per astrociti di

  1. preparazione media OGD
    1. supplemento Dulbecco ' s modificato Eagle ' glucosio privo di mezzo di s con 3,7 g/L bicarbonato di sodio e 1% penicillina/streptomicina. Vedi materiali nella tabella 4.
    2. 20 mL di glucosio libero terreno di spurgo dalla bollitura con 95% N 2 / 5% CO 2 per 10 min a un flusso di 15 L/min (indicato con il misuratore di portata) inserendo una pipetta sierologica al sistema del gas nel medio.
      Nota: Dopo l'eliminazione il mezzo di ossigeno, regolare il pH 7,4 (vedere nota sul punto 2.1).
    3. Filtrare l'inceppo medium senza glucosio utilizzando un sistema di filtro tubo 50 mL.
      Nota: Fare mezzo OGD fresco per ogni esperimento, spumeggiante con 95% N 2 / 5% CO 2 prima dell'uso, per garantire che le cellule sono esposte ad un ambiente che ha eliminato l'inceppo di ossigeno.
  2. Procedura sperimentale
    1. all'interno della cappa di coltura del tessuto, rimuovere supporti Astrocita da precedentemente preparati vetrini coprioggetti (fare riferimento al passaggio 4.3.5) e lavare con PBS cellulare due volte per rimuovere tutto il glucosio sulle cellule.
    2. Aggiungere 2 mL di media OGD a ciascun bene e posizionare i piatti multi pozzetto all'interno della camera di ipossia con loro coperchi off.
    3. Collegare la miscela di gas alla valvola d'ingresso e lasciare aperta la valvola di uscita. Lavare la camera con la miscela di gas di 95% N 2 / 5% CO 2, a 15 L/min per 5 min.
    4. Fermare il flusso di gas e prima chiudere il morsetto della valvola di uscita, quindi chiudere il morsetto del tubo valvola di entrata gas.
      Nota: Assicurarsi che non vi siano perdite di gas coprendo il sigillo della camera con acqua e sapone. Se il sigillo è sicuro, non bolle.
    5. Inserire l'intera camera l'incubatrice della coltura cellulare a 37 ° C per 1 h o h 6 in OGD.
    6. Dopo tempo di incubazione è finita, aspirare i media OGD e attentamente Pipettare 2 mL di DMEM completo a ogni 4,67 cm 2 per le condizioni di normossia elaborare 24 h.

6. Protocollo per la preparazione di immunofluorescenza Astrocyte primaria

Nota: per valutare la purezza di astrociti, cellule cerebrali differenti tipi come neuroni, microglia ed oligodendrociti possono essere rilevati da immunofluorescenza usando gli indicatori differenti delle cellule. Gli indicatori di proliferazione, PCNA e ioduro di propidio (PI) può essere utilizzati su astrociti di ratto esposti a OGD seguita da condizioni di normossia. Vedi materiali nella Tabella materiali.

  1. Preparazione di immunofluorescenza
    Nota: si tratta di un protocollo generale di immunofluorescenza, piccole modifiche possono essere eseguite per ottenere un segnale ottimo (per esempio, periodi di incubazione più lungo, temperatura di incubazione). Ogni marcatore da tabella 1 può essere utilizzato secondo il produttore ' protocollo s.
    1. Per valutare la vitalità cellulare, le cellule possono essere incubate per 5 min a 37 ° C con PI (5 µM in DMEM completo) e lavare due volte con 2 mL di PBS per 5 min. cellule che mostrano la macchiatura di PI sono meno praticabile.
      Nota: Uso le cellule trattate nel passaggio 5.2.6.
    2. Per fissare le cellule dopo colorazione PI, aggiungere 2 mL di formalina 4% a 4,67 cm 2 bene, per 20 min a 4 ° c. Per campioni etichettati con PCNA, la soluzione di fissaggio comodo è metanolo per 10 min a 4 ° c.
      Attenzione: Formalina e metanolo sono tossici.
      Nota: Controllare sempre i protocolli dell'anticorpo specifico da ogni società.
    3. Lavare le cellule con 2 mL di PBS per 5 min e ripetere il passaggio 3 volte.
    4. Incubare le cellule nella soluzione di blocco (0,5% tensioattivi non ionici, 10% FBS in PBS) per 30 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
    5. Lavare le cellule con 2 mL di PBS per 5 min, ripetere il lavaggio 3 volte.
    6. Incubare a 4 ° C, durante la notte (16h), con l'anticorpo primario (PCNA, GFAP) in una soluzione di 1% FBS in PBS.
    7. Rimuovere la soluzione di anticorpo primario, lavare le cellule con 2 mL di PBS per 5 min e ripetere questa operazione 3 volte.
    8. Incubate con l'anticorpo secondario coniugato con fluoroforo in una soluzione di 1% FBS in PBS, per 1 h a temperatura ambiente.
    9. Lavare le cellule con 2 mL di PBS per 5 min, ripetere questa operazione 3 volte. Aggiungere 1 µ g/mL di DAPI (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) per 5 min a macchiare i nuclei delle cellule.
    10. Lavare le cellule con 2 mL di PBS 5 min, ripetere questo passaggio due volte e tenere in PBS.
    11. Preparare i coprioggetti su un vetrino da microscopio utilizzando il mezzo di montaggio a.
  2. Microscopio confocale
    1. dopo aver impostato il microscopio, posizionare il lato di coprioggetto sul palco microscopio.
    2. Utilizzando il software, selezionare un raggio laser a 543nm per l'anticorpo coniugato GFAP-Cy3.

7. Analisi di attuabilità di cella

  1. Trypsinize e quantificare gli astrociti seguendo la procedura descritta 4.3 e 4.4.
  2. Aggiungere 1 x 10 4 cellule/pozzetto in piastre da 96 pozzetti e farle crescere al confluency.
  3. Usando la metodologia dal passaggio 5, esporre coltivate piastre da 96 pozzetti per entrambi normoxic 1h OGD o 6h OGD.
  4. Trattamento dopo OGD, normoxic multimediale viene aggiunto a tutte le celle per 24 h e redditività è misurata usando l'analisi di MTT reagente (utilizzare come produttore ' s istruzioni indicano).
  5. Da una soluzione MTT di 5 mg/mL, aggiungere il 10% del volume totale ad ogni pozzetto e incubare per 3 ore a 37 ˚ c con il reagente MTT.
  6. Rimuovere i supporti e risospendere cristalli con solfossido dimetilico di 200 µ l. Leggere la piastra con uno spettrofotometro a 570 nm.
    Nota: Una capacità di assorbimento in diminuzione rispetto a cellule di controllo mette in correlazione con meno vitalità.

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Risultati

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Una delle preoccupazioni principali della cultura astrocytic primario è la presenza di altre cellule come i neuroni, oligodendrociti, fibroblasti e microglia. Nella Figura 1, cellule isolate da cortecce di ratto avevano preparato cambia ogni 3 giorni e sono stati o non trattata o trattata con aggiunto LME per 1 h. 24 h più successivamente, le cellule immunostained per GFAP e controcolorati con DAPI. Le cellule non trattate hanno mostrato una media di 39% non-...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive l'isolamento degli astrociti da cortecce di ratto. In questo metodo, è fondamentale per ridurre la contaminazione con altri tipi cellulari come microglia, oligodendrociti e fibroblasti. Per ridurre il numero di microglia, si possono adottare diverse misure: cambiando la media, agitazione orbitale e trattamenti chimici. Una volta che la purezza di cultura è confermata dall'immunofluorescenza usando gli indicatori cellulari selettivi o per i contaminanti più prominenti di cella, gli esperimenti p...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori vogliono ringraziare Paola López Pieraldi per l'assistenza tecnica. A.H.M è grato per le borse di studio 8G12MD007600 e U54-NS083924 supportato questa pubblicazione. Ringraziamo NIH-NIMHD-G12-MD007583 borsa di studio per il supporto della struttura. D.E.R.A. è grata per la borsa di studio fornito da NIHNIGMS-R25GM110513. Siamo grati per l'uso della zona di strumentazione comune e concedere l'aiuto del dottor Priscila Sanabria per l'uso della struttura Imaging ottico del programma RCMI da G12MD007583. Inoltre, vogliamo ringraziare Jose Padilla per il suo ruolo eccezionale in riprese e montaggio il protocollo visual.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Strumenti per Chirurgia - Step 1
Forbice operativa 5.5"Roboz CompanyRS-6812Strumenti utilizzati per decapitare i topi.
Pinza curva 7"  Roboz CompanyRS-5271Trattiene la pelle del topo mentre il cranio viene rimosso.
Forbici per micro-dissezione 4"  Roboz CompanyRS-5882Taglia sia la pelle che il cranio del topo.
Pinza per micro-dissezione da 4" angolata, finemente affilata Roboz CompanyRS-5095Trattiene la pelle del topo mentre il cranio viene rimosso.
Pinza per micro-dissezione da 4" leggermente curva 0.8Roboz CompanyRS-5135Strumento utilizzato per separare le cortecce.
Pinzetta per micro-dissezioneRoboz CompanyRS-4972Sbuccia le meningi cerebrali.
Microscopio di dissezioneOlympusSZX16Importante per rimuovere la meninge dalle cortecce naturali.
Preparazione DMEM - fase 2
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)GibCo. Azienda11995-065Supporta la crescita delle cellule.
Bicarbonato di sodioSigma-Aldrich CompanyS7277Integratore per i terreni di coltura cellulare.
Siero fetale bovino (FBS)GibCo. Azienda10437-010Integratore sieristico per la coltura cellulare.
Penicillina-Streptomicina GibCo. L'azienda15140-148inibisce la crescita dei batteri nella coltura cellulare.
Sistema di filtraggio 1L con pori da 0,22 umCorning431098
Coltura di astrociti - fase 3
Pipette sierologiche 5mLVWR89130-896Per pipettare il DMEM in contenitori con cellule.
Pipette sierologiche 10mLVWR89130-898Per pipettare DMEM in contenitori con cellule.
Pipette sierologiche 25mLVWR89130-900Per pipettare DMEM in contenitori con cellule.
Provetta conica per centrifuga 15mLSanta Cruz Biotechnologysc-200250
Provetta safe-lock 1.5mLEppendorf022363204
Barrier Tips 200 uLSanta Cruz Biotechnologysc-201725
Barrier Tips 1 mLSanta Cruz Biotechnologysc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"VWR14220-048
Piastre di Petri da 60 mmFalcon351007
Tamponi di garza steriliHoneywell Safety89133-086
Stomacher 80 BiomasterSewar Lab System030010019Triturare il tessuto cerebrale.
Stomacher 80 Blender Sacchetti sterili SewarLab SystemBA6040Sacchetto sterile per l'omogeneizzatore cellulare stomacher.
Becher 400mLPyrex1000
Setaccio sterile per dissociazione cellulare, maglia #60 Sigma-Aldrich CompanyS1020Per ottenere una sospensione uniforme a cella singola.
Setaccio sterile per dissociazione cellulare, maglia #100Sigma-Aldrich CompanyS3895Per ottenere una sospensione uniforme di una singola cellula.
Microscopio a fase invertitaNikonEclypse Ti-SVerifica la presenza di contaminazioni o crescita cellulare anomala.
Palloni sterili da 75 cm2Falcon353136
Piastra multipozzettoFalcon353046
Micro vetri di copertura (vetrini coprioggetti), 18 mm, rotondiVWR48380-046
Bright-Line emacitometroSigma-Aldrich CompanyZ359629
Pipette PasteurFisher Scientific13-678-20D
Alcool etilico Sigma-Aldrich CompanyE7023
L-leucina metil estere cloridrato 98% (LME)Sigma-Aldrich CompanyL1002Promuove l'eliminazione delle cellule microgliali nel cultutre corticale primario degli astrociti.
Citosina β-D-arabinofuranoside (Ara-C)Sigma-Aldrich CompanyC1768
Poli-D-lisina bromidrato, mol wt 70.000-150.000Sigma-Aldrich CompanyP0899
Tripsina/EDTAGibCo. Azienda15400-054
Trypan BlueSigma-Aldrich CompanyT8154
Compresse di soluzione salina tampone fosfato (PBS)Calbiochem524650
Acqua sterileSigma-Aldrich CompanyW3500
  OGD Medium Preparazione - fase 5
Centrifuga provetta conica 50 mLVWR89039-658
Dulbecco' s Eagle modificato' s glucosio libero medioSigma-Aldrich CompanyD5030Supporta la crescita delle cellule.
Bicarbonato di sodioSigma-Aldrich CompanyS7277Integratore per i terreni di coltura cellulare.
Penicillina-Streptomicina GibCo. L'azienda15140-148inibisce la crescita dei batteri nella coltura cellulare.
200mM  L-glutammina GibCo. Azienda25030-081Aminoacido che integra la crescita delle cellule.
Compresse di soluzione salina tampone Phospahet (PBS)Calbiochem524650
Sistema di filtraggio 50 ml con pori da 0,22 umCorning430320
Tubo conico da centrifuga 50 mLVWR89039-658
Flussometro singolo Billups-RothenbergSMF3001Misura del flusso di gas nello spurgo dell'ossigeno.
Camera dell'incubatrice dell'ipossia StemCell27310Genera un ambiente ipossico per la coltura cellulare.
Misuratore di ossigeno disciolto tracciabileVWR21800-022
95% N2/ 5% CO2 Miscela di gasLindeElimina l'ossigeno dall'ambiente.
immunofluorescenza primaria degli astrociti - fase 6Compresse di
fosfato (PBS)Calbiochem524650
Soluzione di formalina Tampone neutro 10%Soluzione di HT501128 Sigma-Aldrichutilizzata per fissare le cellule.
Metanolo FisherA4544Soluzione utilizzata per fissare le cellule.
Tensioattivo non ionico (Triton X-100)Sigma-AldrichT8787
Siero fetale bovino (FBS)GibCo. Azienda10437-010Integratore sieristico per la coltura cellulare.
Anti-NeuNCell Signaling24307Rileva i neuroni maturi, serve a convalidare la coltura astrocitica.
Segnalazione cellulareanti-PCNA2586Rileva le cellule proliferanti.
Ioduro di propidio (PI)Sigma-Aldrich CompanyP4170Colorazione per apoptosi.
Anti-Olig1AbcamAB68105Rileva gli oligodendrociti maturi.
Anti-Iba1+Wako016-20001Rileva le cellule microgliali.
Anti-GFAP coniugato con Cy3 Sigma-Aldrich CompanyC9205Rileva gli astrociti reattivi nelle cellule trattate.
Alexa Fluor 488Molecular Probe Life TechnologyA1101Anticorpo secondario anti-topo.
Alexa Fluor 555Molecular Probe Life TechnologyA21428Anticorpo secondario anti-coniglio.
4',6'-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)Sigma-Aldrich CompanyD9542Colorazione nucleare.
Microscopio confocaleOlympus
soluzione salina tampone

Riferimenti

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