Articolo metodologico

Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

DOI:

10.3791/55112

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28 dicembre 2016

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1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo protocolli di coltura cellulare umana per analizzare i fattori di inizio della traduzione che legano il cappuccio 5' dell'mRNA durante le condizioni fisiologiche di ossigeno. Questo metodo utilizza un analogo del tappo m7GTP legato all'agarosio ed è adatto per studiare i fattori di legame del tappo e i loro partner interagenti.

Abstract

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Il controllo traduzionale è un punto focale della regolazione genica, specialmente durante i periodi di stress cellulare. La traduzione cap-dipendente attraverso il complesso eIF4F è di gran lunga la via più comune per avviare la sintesi proteica nelle cellule eucariotiche, ma stanno emergendo variazioni specifiche per lo stress di questo complesso. La purificazione delle proteine leganti il cappuccio con una resina di affinità composta da m7GTP legato all'agarosio (un analogo del cappuccio dell'mRNA 5') è uno strumento utile per identificare i fattori coinvolti nella regolazione dell'inizio della traduzione. L'ipossia (basso contenuto di ossigeno) è uno stress cellulare riscontrato durante lo sviluppo fetale e la progressione del tumore ed è fortemente dipendente dalla regolazione della traduzione. Inoltre, è stato recentemente riportato che gli organi adulti umani hanno un contenuto di ossigeno inferiore (fisiossia 1-9% di ossigeno) che è più vicino all'ipossia rispetto all'aria ambiente in cui le cellule vengono abitualmente coltivate. Con la caratterizzazione in corso di un complesso ipossico eIF4F (eIF4FH), c'è un crescente interesse nella comprensione dell'inizio della traduzione ossigeno-dipendente attraverso il cappuccio dell'mRNA 5'. Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di coltura cellulare umana per analizzare le proteine che legano il tappo che sono regolate dalla disponibilità di ossigeno. Questo protocollo sottolinea che la coltura cellulare e la lisi devono essere eseguite in una workstation per ipossia per eliminare l'esposizione all'ossigeno. Le celle devono essere incubate per almeno 24 ore affinché il mezzo liquido si equilibri con l'atmosfera all'interno della postazione di lavoro. Per evitare questa limitazione, è possibile aggiungere alle celle mezzi precondizionati (deossigenati) se sono necessari punti temporali più brevi. Alcune proteine che legano il cappuccio richiedono interazioni con una seconda base o possono idrolizzare il GTP m7, quindi alcuni interattori del cappuccio possono essere persi nel processo di purificazione. L'agarosio legato ad analoghi di cap enzimaticamente resistenti può essere sostituito in questo protocollo. Questo metodo consente all'utente di identificare nuovi fattori di traduzione regolati dall'ossigeno coinvolti nella traduzione cap-dipendente.

Introduzione

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Il controllo traslazionale sta emergendo come un passo altrettanto importante regolazione trascrizionale dell'espressione genica, in particolare durante i periodi di stress cellulare 1. Un punto focale di controllo traduzione è al fattore limitante di iniziazione dove le prime fasi della sintesi proteica coinvolgono il legame della eucariotica fattore di iniziazione 4E (eIF4E) al 7-methylguanosine (m 7 GTP) 5 'tappo di mRNA 2 . eIF4E è parte di un complesso di nome trimeric eIF4F che include eIF4A, una elicasi RNA, e eIF4G, una proteina impalcatura necessaria per l'assunzione di altri fattori di traduzione e le 40S del ribosoma 3. In condizioni fisiologiche normali, la stragrande maggioranza degli mRNA vengono tradotti attraverso un meccanismo di cap-dipendente, ma sotto i periodi di stress cellulare circa il 10% di mRNA umani contiene 5 'UTR che potrebbero consentire di traduzione cap-indipendente rito di iniziazione 1,4. traduzione Cap-dipendente è stata storicamente sinonimounità organizzative con eIF4F, tuttavia, le variazioni specifiche di stress di eIF4F sono diventati un argomento di tendenza 5-8.

Vari stress cellulari causano attività eIF4E da reprimere attraverso la mammalian target of complesso rapamicina 1 (mTORC1). Questa chinasi diventa compromessa sotto stress, che provoca l'aumento di attività di uno dei suoi obiettivi, la proteina 4E-binding (4E-BP). Non fosforilata 4E-BP si lega ad eIF4E e blocca la sua capacità di interagire con eIF4G causando la repressione della traduzione cap-dipendente 9,10. È interessante notare che, un omologo di eIF4E chiamato eIF4E2 (o 4EHP) ha un'affinità molto più basso per 4E-BP 11, forse permettendogli di eludere la repressione dello stress-mediata. Infatti, inizialmente caratterizzato come un repressore della traduzione a causa della sua mancanza di interazione con eIF4G 12, eIF4E2 avvia la traduzione di centinaia di mRNA che contengono RNA elementi di risposta all'ipossia nella loro 3 'UTR durante lo stress ipossico 6,13. Questo mi attivaziones raggiunto attraverso le interazioni con eIF4G3, RNA-binding protein 4 motivo, e il fattore inducibile dall'ipossia (HIF) 2α a costituire un complesso eIF4F ipossica, o eIF4F H 6,13. Come un repressore in condizioni normali, eIF4E2 si lega con GIGYF2 e ZNF598 14. Questi complessi sono stati, in parte, identificati attraverso Agarose-linked m 7 resine GTP affinità. Questo metodo classico 15 è standard nel campo della traduzione ed è i saggi migliore e più tecnica comunemente usata per isolare complessi cap-binding in pull down e in vitro di legame 16-19. Come le macchine di traduzione cap-dipendente sta emergendo come flessibile ed adattabile con le parti tra loro cambiare 6-8,13, questo metodo è un potente strumento per individuare rapidamente nuove proteine di legame della cap coinvolti nella risposta allo stress. Inoltre, le variazioni di eIF4F potrebbe avere vaste implicazioni come diversi sistemi modello eucarioti sembrano utilizzare un omologo eIF4E2 per le risposte di stress talicome A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, e C. elegans 23.

L'evidenza suggerisce che le variazioni di eIF4F non possono essere strettamente limitato a condizioni di stress, ma essere coinvolti nella fisiologia normale 24. La fornitura di ossigeno ai tessuti (alle estremità capillari) o all'interno dei tessuti (misurata tramite microelettrodi) varia dal 2-6% nel cervello 25, 3-12% nei polmoni 26, 3.5-6% nell'intestino 27, 4% in il fegato 28, 7-12% nel rene 29, 4% nel muscolo 30, e 6-7% nel midollo osseo 31. Le cellule e mitocondri contengono meno del 1,3% di ossigeno 32. Questi valori sono molto più vicini a ipossia che l'aria ambiente in cui le cellule sono normalmente coltivate. Questo suggerisce che ciò che è stato precedentemente pensato come processi cellulari specifici per ipossia possono essere rilevanti in un ambiente fisiologico. È interessante notare che, eIF4F e eIF4F H partecipare attivamente al inizio della traduzione di piscine distinte o classi di mRNA in diverse linee cellulari umane differenti esposti all'ossigeno fisiologica o "physioxia" 24. Low ossigeno spinge anche il corretto sviluppo del feto 33 e le cellule hanno generalmente più alti tassi di proliferazione, durata della vita più lunga, meno danni al DNA e meno risposte allo stress generale in physioxia 34. Pertanto, eIF4F H è probabilmente un fattore chiave per l'espressione dei geni selezionati in condizioni fisiologiche.

Qui, forniamo un protocollo per le cellule di coltura in condizioni di ossigeno fisiologiche fissi o in un intervallo di fluttuazione dinamica che rischia più rappresentativa di microambienti tissutali. Un vantaggio di questo metodo è che le cellule sono lisate nella workstation ipossia. E spesso non è chiaro come la transizione dalla coltura cellulare ipossica a lisi cellulare avviene in altri protocolli. Le cellule vengono spesso rimossi prima da un piccolo incubatore ipossia esserefore lisi, ma questa esposizione all'ossigeno potrebbe influenzare percorsi biochimici come risposta cellulare a ossigeno è rapida (uno o due min) 35. Alcune proteine di legame della cap richiedono interazioni con una seconda base o possono idrolizzare il GTP m 7, quindi alcuni interattori capitalizzazione possono perdere nel processo di purificazione. Agarosio-linked per analoghi cap enzimaticamente resistenti può essere sostituito in questo protocollo. Esplorare l'attività e la composizione di eIF4F H e altre varianti del eIF4F attraverso il metodo descritto qui farà luce sui complessi macchinari di espressione genica che le cellule utilizzano in condizioni fisiologiche o risposte allo stress.

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Protocollo

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1. Preparativi per colture cellulari

  1. Acquisto commercialmente disponibili scorte di cellule umane.
    NOTA: Questo protocollo utilizza il carcinoma del colon-retto HCT116 e renali cellule primarie umane prossimali tubulari epiteliali (HRPTEC).
  2. Fare 500 ml di mezzo per la cultura di HCT116: Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) / medio alta di glucosio integrato con 7,5% siero fetale bovino (FBS) e 1% penicillina / streptomicina (P / S).
  3. Fare 500 ml di mezzo per la cultura di HRPTEC: media delle cellule epiteliali integrato con il 5% FBS, 1% supplemento di crescita delle cellule epiteliali, e l'1% P / S.
  4. Preparare 500 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS): 140 mm NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 15 mm KH 2 PO 4. Regolare il pH a 7,4 e sterilizzare in autoclave per 40 minuti a 121 ° C.

2. Apertura di Cell Coltura

  1. Con attenzione aspirare il medium da un piatto confluenti 80-90% senza disturbare tegli cellule.
  2. Aliquota 3-5 ml di PBS 1x per piatto cultura, rock delicatamente ogni pallone per rivestire la superficie del piatto, e con attenzione aspirare il PBS 1x. Ripetere l'operazione per un secondo lavaggio 1x PBS.
  3. Aliquota 3 ml di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico 0,05% (EDTA) in ogni piatto cultura e delicatamente in modo uniforme di roccia per rivestire le cellule con tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 2-3 minuti.
  4. Trasferire le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 4000 xg per 90 sec.
  5. Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di DMEM completo.
  6. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Calcolare quanti apirogene e polistirolo 100 millimetri cella cultura piatti sono necessari per raggiungere una densità di semina iniziale di circa 2.500-5.000 cellule per cm 2.
  7. terreno completo Pre-caldo coltura cellulare made in passi 1.2 o 1.3 in un bagno d'acqua C 37 ° C per 30-45 minuti.
  8. Decontaminare la bottiglia medio e fiala cella con il 70% di etanolo. Da questo punto in avanti tuttile operazioni devono essere eseguite in modo asettico.
  9. Aliquotare 6 ml di DMEM completo in altrettante piatti di coltura cellulare 100 mm richiesti per utilizzare l'intero volume di cellule congelate nella densità di semina di cui al punto 2.6.
  10. Trasferire il volume di sospensione cellulare calcolata al punto 2.6 a ciascuno dei piatti 100 coltura mm. Oscillare ciascuna piastra manualmente per distribuire uniformemente le cellule sulla superficie della piastra.
  11. Posizionare la testa di serie 100 millimetri piatto di coltura cellulare in incubatore a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%. Consentono alle cellule di incubare, almeno 24 ore prima che i passi successivi.

3. Trapianto

  1. Mostra ogni piatto di coltura cellulare al microscopio per determinare la percentuale di confluenza cellule (cellule% coprono l'area del piatto). le cellule per l'incubatore e pre-caldo terreno completo e PBS 1x Return. Procedere al passaggio successivo, se le cellule sono 80-100% confluenti.
  2. aspirare accuratamente la media trascorsa senza disturbare ilcellule in ogni piatto cultura.
  3. Aliquota 3-5 ml di PBS 1x per piatto cultura, rock delicatamente ogni pallone per rivestire la superficie del piatto, e con attenzione aspirare il PBS 1x. Ripetere l'operazione per un secondo lavaggio 1x PBS.
  4. Aliquota 3 ml di 0,05% tripsina-EDTA in ogni piatto cultura e agitare delicatamente per rivestire in modo uniforme le cellule con tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 2-3 minuti.
  5. Durante questa incubazione, un'aliquota di 10 ml di terreno completo in altrettanti piatti della cultura sono necessari per ottenere la densità cellulare di 2.500-5.000 cellule per cm 2.
  6. Quando le cellule hanno staccata dalla piastra, aggiungere rapidamente 3 ml di inibitore della tripsina 1x definito e miscelare delicatamente il piatto per 1 min per garantire che tutte le tripsina-EDTA è stato neutralizzato.
  7. Trasferire le cellule staccate in una sterile 15 ml provetta e mettere da parte. Aggiungere 3 ml di PBS 1X per il piatto per raccogliere tutte le cellule rimanenti e il trasferimento che per lo stesso 15 ml provetta.
  8. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 150 xgper 5 min.
  9. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di mezzo completo.
  10. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare 150 mm piastre di coltura contenente 15 ml di terreno completo per ottenere una densità cellulare di 2.500-5.000 cellule per cm 2. Utilizzare due di 150 mm per ogni test cap-binding.
    NOTA: diffusione di ossigeno alle cellule tramite mezzo liquido dipende dal volume di 36. Si raccomanda di mantenere il volume dei mezzi coerenti tra esperimenti se le cellule aderenti o cellule in sospensione sono utilizzati. I supporti possono essere pre-condizionati (incubate nella postazione di lavoro per 24 ore, come discusso in discussione) per evitare questi variabilità in diffusione.
  11. Porre le capsule testa di serie-cultura nel termostato a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%. Consentono alle cellule di incubare, almeno 24 ore prima di procedere alle fasi successive.

4. L'esposizione Physioxic

  1. Visualizza le cellule sotto il microscopio. per besrisultati t, in modo che le cellule sono 70-80% confluenti per una esposizione di 24 ore, il 50-60% confluenti per un'esposizione 48 ore, e il 40-50% confluenti per un'esposizione 72 ore.
  2. Posizionare le cellule in una workstation ipossia per il tempo desiderato (24, 48, o 72 ore a seconda dell'esperimento).
  3. Impostare la workstation per la physioxia appropriata.
    NOTA: Ad esempio, un'impostazione 3% O 2 sarebbe accompagnata da 5% di CO 2 e il 92% N 2.
    NOTA: Se le fluttuazioni di ossigeno all'interno di una gamma dinamica si desiderano su una linea temporale specifico, il programma il programma nello strumento o regolare manualmente le impostazioni di ossigeno agli intervalli desiderati.
  4. Impostare l'umidità al 60%. L'atmosfera workstation è molto secca comunque, e dei media sarà notevolmente evapora durante lunghi esperimenti (> 48 ore). Mantenere una riserva media in un pallone di coltura di cellule all'interno della stazione di lavoro (in modo che il supporto viene equilibrato con l'ambiente workstation) per ricostituire i mezzi di comunicazione nel DIS coltura cellularelui è.
    NOTA: Ogni soluzione che interagirà con le cellule prima di lisi (come PBS e tripsina-EDTA) deve essere pre-condizionato per 24 ore prima dell'uso nella workstation ipossia in modo che l'ossigeno disciolto equilibra con l'ossigeno atmosferico 36.
  5. Mantenere le cellule all'interno della stazione di lavoro fino lisi.

5. Buffer Preparazione per il saggio Cap-binding

  1. Preparare 1x Tris-Buffered Saline (TBS).
    1. In 800 ml di dH 2 O, sciogliere 8,76 g di NaCl e 6,05 g Tris Base.
    2. Portare la soluzione ad un pH finale di 7,4 usando 1 M HCl.
    3. Portare il volume finale di 1 L con dH 2 O.
  2. Preparare tampone di lisi non denaturazione. Preparare Lysis Buffer il giorno del test tappo vincolante. Fare tampone di lisi in più per lavare le perline agarosio vuote e la γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked (passi 7.9 e 7.13).
    1. In 7 ml di dH 2 O, aggiungere 160 ml 5 M NaCl, 160 microlitri 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 microlitri 200 mM NaF, 40 microlitri 1 M MgCl 2 e 40 microlitri 1 mM sodio orthovanadate.
    2. Aggiungere 40 ml di Igepal alla soluzione 7 ml. Tagliare la punta della pipetta per aiutare recuperare Igepal in quanto è estremamente viscoso.
    3. Mescolare pipettando su e giù, o vortice, la soluzione 7 ml finché tutti i Igepal è stato dissolto.
    4. Aumentare il volume finale della soluzione a 8 ml e tenere in ghiaccio.
  3. Preparare 4x dodecil solfato di sodio (SDS) -page Sample Buffer.
    1. In un becher, unire 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml di glicerolo, e 8 ml ditiotreitolo (DTT).
    2. Aggiungere 3,2 g di SDS e 0,16 g di blu di bromofenolo. Lasciare in polvere per sciogliere completamente mescolando con un bastoncino magnetico.
    3. Aliquota in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C.

6. cellulare Lysis

  1. Preparare non denaturazione-tampone di lisi e tenere in ghiaccio il giorno di The cap-binding assay.
  2. Pre-calda 1x PBS e tripsina in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min.
  3. Aliquota 980 ml di tampone di lisi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per ogni test cap-binding in corso di esecuzione.
  4. Aggiungere 10 ml di 4- (2-amminoetil) benzensolfonile fluoruro cloridrato e 10 ml di 100x cocktail di inibitori delle proteasi ai 980 ml di tampone di lisi. Tenere in ghiaccio.
  5. Eliminare il supporto da ogni piatto 150 millimetri in un contenitore di rifiuti all'interno della stazione di lavoro ipossia.
  6. Lavare le cellule con 3-4 ml di caldo 1x PBS e scartare tutto il liquido.
  7. Aggiungere 1 ml di caldo 0,05% tripsina-EDTA per ogni piatto e lasciate riposare per 2 minuti o fino a quando le cellule non sono rispettate piastra.
  8. Usando una pipetta, trasferire le cellule di una piastra in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere se necessario in modo che ciascuna piastra di cellule viene trasferito in un 1,5 ml provetta separata.
  9. Centrifugare le provette da 1,5 ml microcentrifuga a 6.000 g per 90 sec to agglomerare le cellule.
  10. Aspirare il tripsina con una pipetta senza disturbare il pellet. Se il pellet è disturbato, ri-centrifugare la provetta da 1,5 ml a 6.000 g per 90 sec.
  11. Lavare le cellule con caldo PBS 1x pipettando gentilmente 200 ml di PBS nella provetta appena sopra il pellet. Re-centrifuga se il pellet è disturbato.
  12. Aspirare il PBS senza disturbare il pellet.
  13. Pipettare 500 microlitri dalle 1 ml preparati soluzione tampone di lisi sul primo pellet cellulare. Risospendere il pellet interamente pipettando su e giù.
  14. Combinare le cellule risospese con il secondo pellet di cellule e risospendere il secondo pellet pipettando su e giù. Ripetere questo processo fino a quando tutti i pellet sono stati combinati e risospese per ogni campione.
  15. Combinare il lisato con i restanti 500 ml di tampone di lisi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
  16. Rimuovere campioni dalla workstation ipossia.
    NOTA: Dopo aver aggiunto tampone di lisi, unall fasi successive devono essere eseguite in aria ambiente come workstation ipossia è impostato a 37 ° C e le seguenti operazioni devono essere eseguite a freddo (4 ° C o su ghiaccio).
  17. Lisare le cellule utilizzando blanda agitazione ruotando i campioni a 4 ° C per 1,5-2 ore.
  18. Centrifugare le cellule lisate a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari.
  19. Trasferire il lisato in una nuova provetta da 1,5 ml e scartare il pellet.
  20. Prenotare una porzione (5-10%) del surnatante da utilizzare nel suo complesso controllo di input lisato cellulare per future analisi western blot.

7. Assay Cap-binding

  1. Per ogni campione, trasferire 50 ml di vuoto agarosio liquami controllo tallone e 50 ml di liquame tallone γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio C10-linked per separare 1,5 ml microprovette. Utilizzare forbici per rimuovere la punta della pipetta per facilitare la raccolta della poltiglia tallone.
  2. Agglomerare le perline by centrifugazione della poltiglia a 500 xg per 30 sec.
  3. Rimuovere il surnatante con attenzione e risospendere le sfere in 500 ml di TBS.
  4. Ripetere i punti 7.2 e 7.3. Agglomerare le perline a 500 xg per 30 sec e rimuovere il surnatante.
  5. Trasferire il surnatante contenente il lisato dal punto 6.19 al tubo di 1,5 ml microcentrifuga contenente le perline agarosio vuote.
    NOTA: Le perle di agarosio bianco agiscono come una fase di pre-compensazione per rimuovere le proteine ​​dal lisato che interagiscono in modo non specifico con il tallone.
  6. Incubare per 10 minuti a 4 ° C con agitazione.
  7. Pellet le perline agarosio vuote per centrifugazione a 500 g per 30 sec.
  8. Trasferire il lisato alla provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked.
  9. Lavare le perline agarosio vuote da risospendere le sfere in 500 ml di tampone di lisi, pellet le perline per centrifugazione a 500 xg per 30 secondi, e scartando la Supernatant. Ripetere questa operazione quattro volte per un totale di cinque lavaggi.
  10. Risospendere le sfere agarosio vuote nel tampone campione 1x SDS-PAGE, e far bollire le perline per 90 secondi a 95 ° C. Conservare a -20 ° C per una futura analisi western blot per osservare se la proteina di interesse si lega in modo non specifico per il tallone.
  11. Incubare il lisato con le perline γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio C10-collegate con agitazione per 1 ora a 4 ° C per catturare le proteine di legame della cap.
  12. Agglomerare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked per centrifugazione a 500 g per 30 sec. Eliminare il surnatante.
  13. Lavare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked ripetendo il passaggio 7.9.
  14. Risospendere le sfere in 600 microlitri di tampone di lisi.
  15. Aggiungere GTP ad una concentrazione finale di 1 mM.
  16. Incubare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked + 1 mM GTP con agitazione per 1 ora a 4 ° C. Nota: Questosarà dissociarsi proteine che interagiscono in modo non specifico con m 7 GTP (vale a dire, di interagire anche con GTP non metilato).
  17. Agglomerare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked per centrifugazione a 500 g per 30 sec.
  18. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere 200 ml di 4x tampone campione SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% blu di bromofenolo e 10% glicerolo). Conservare il campione di controllo GTP a -20 ° C per una futura analisi Western Blot 37. Lavare le perline ripetendo il passaggio 7.9.
  19. Risospendere le sfere in 1x tampone campione SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% blu di bromofenolo e 10% glicerolo) e ebollizione a 95 ° C per 90 sec. Conservare il m frazione 7 GTP-bound a -20 ° C per una futura analisi Western Blot 37.

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Risultati

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Analisi di Capacità Cap-binding in risposta ad ossigeno di eIF4E e eIF4E2 in un m 7 GTP Affinity Colonna

Le figure 1 e 2 rappresentano le macchie occidentali del tipico m 7 GTP affinità purificazione delle due principali proteine di legame della cap in risposta alle fluttuazioni di ossigeno in due linee cellulari umane: umane renale prossimale cellule primarie tubulari epite...

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Discussione

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L'analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni di ossigeno fisiologiche può consentire l'identificazione di nuovi fattori di inizio della traduzione di ossigeno-regolamentato. L'affinità di questi fattori per tappo di mRNA o di altre proteine cap-associate al 5 'può essere misurata con la forza della loro associazione di m 7 GTP-linked perline agarosio. Un avvertimento di questa tecnica è che misura il potenziale cap-legame delle proteine ​​post-lisi, ma e...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio di Scienze Naturali e Ingegneria del Canada e dal Ministero della Ricerca e dell'Innovazione dell'Ontario.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
γ-amminofenil-m7GTP agarosio C10 perline legate JenaBioscienceAC-1555Agarosio m7GTP
Piatto di colturaCorning87722210 cm
mmThermofisher130183piatto di coltura da 15 cm
AEBSF CloridratoACROS OrganiciA0356829AEBSF
Perle di agarosioJena Bioscience AC-0015Controllo delle perle di agarosio
Bromophenol BlueFisherBP112-25Componente del tampone di caricamento SDS-PAGE
Provette da centrifuga da 1,5 mlFroggaBio1210-00SUtilizzato per centrifugare piccoli volumi
Provette da centrifuga coniche da 15 mlFisher1495970CUtilizzato nella coltura di cellule primarie
Inibitore della tripsina definitoFisherR007100DTI
DitiotreitoloFisherBP172-25DTT
Terreno cellulare epiteliale (kit completo)ScienCell4101Include integratori di siero e fattore di crescita)
GliceroloFisherBP229-1Componente del tampone di caricamento SDS-PAGE
100 mM Guanosina 5'-trifosfato, 1 mlJena Bioscience272076-0251MGTP
HCT116 carcinoma colorettaleATCCCCL-247Linea cellulare tumorale umana
Cellule epiteliali tubulari prossimali renali umaneATCCPCS-400-010HRPTEC
Hyclone DMEM/High GlucoseGE Life SciencesSH30022.01Terreni standard per colture cellulari umane
Soluzione di iclone penicillina-streptomicinaGE Life SciencesSV30010Componente antibiotico di DMEM
H35 HypOxystationHypoxygenN/AStazione di lavoro per ipossia
Igepal CA-630MP Biomedicals2198596Componente detergente del tampone di lisi
Fosfato monopotassicoFisherP288-500KH2PO4
Cloruro di potassioFisherP217-500KCl
Cloruro di magnesioFisherM33-500MgCl2
Cloruro di sodioFisherBP358-10NaCl
Fluoruro di sodioFisher5299-100NaF (componente inibitore della fosfatasi del tampone di lisi)
Fosfato disodicoFisher5369-500Na2HPO4
Siero fetale bovino di grado premiumSeradigm1500-500FBS
Cocktail di inibitori della proteasi (100x)Segnalazione cellulare58715Componente del tampone di lisi
Sodio Dodecil solfatoFisherBP166-100SDS
Sodio OrtovanadatoSigma56508Na3VO4
Tris BaseFisherBP152-5Componente dei tamponi
0,05% Tripsina-EDTA (1x)Life Technologies2500-067Tripsina utilizzata per staccare le cellule aderenti
Piatto di coltura da 150

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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