Qui, presentiamo protocolli di coltura cellulare umana per analizzare i fattori di inizio della traduzione che legano il cappuccio 5' dell'mRNA durante le condizioni fisiologiche di ossigeno. Questo metodo utilizza un analogo del tappo m7GTP legato all'agarosio ed è adatto per studiare i fattori di legame del tappo e i loro partner interagenti.
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Articolo metodologico
Analisi delle proteine di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il controllo traduzionale è un punto focale della regolazione genica, specialmente durante i periodi di stress cellulare. La traduzione cap-dipendente attraverso il complesso eIF4F è di gran lunga la via più comune per avviare la sintesi proteica nelle cellule eucariotiche, ma stanno emergendo variazioni specifiche per lo stress di questo complesso. La purificazione delle proteine leganti il cappuccio con una resina di affinità composta da m7GTP legato all'agarosio (un analogo del cappuccio dell'mRNA 5') è uno strumento utile per identificare i fattori coinvolti nella regolazione dell'inizio della traduzione. L'ipossia (basso contenuto di ossigeno) è uno stress cellulare riscontrato durante lo sviluppo fetale e la progressione del tumore ed è fortemente dipendente dalla regolazione della traduzione. Inoltre, è stato recentemente riportato che gli organi adulti umani hanno un contenuto di ossigeno inferiore (fisiossia 1-9% di ossigeno) che è più vicino all'ipossia rispetto all'aria ambiente in cui le cellule vengono abitualmente coltivate. Con la caratterizzazione in corso di un complesso ipossico eIF4F (eIF4FH), c'è un crescente interesse nella comprensione dell'inizio della traduzione ossigeno-dipendente attraverso il cappuccio dell'mRNA 5'. Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di coltura cellulare umana per analizzare le proteine che legano il tappo che sono regolate dalla disponibilità di ossigeno. Questo protocollo sottolinea che la coltura cellulare e la lisi devono essere eseguite in una workstation per ipossia per eliminare l'esposizione all'ossigeno. Le celle devono essere incubate per almeno 24 ore affinché il mezzo liquido si equilibri con l'atmosfera all'interno della postazione di lavoro. Per evitare questa limitazione, è possibile aggiungere alle celle mezzi precondizionati (deossigenati) se sono necessari punti temporali più brevi. Alcune proteine che legano il cappuccio richiedono interazioni con una seconda base o possono idrolizzare il GTP m7, quindi alcuni interattori del cappuccio possono essere persi nel processo di purificazione. L'agarosio legato ad analoghi di cap enzimaticamente resistenti può essere sostituito in questo protocollo. Questo metodo consente all'utente di identificare nuovi fattori di traduzione regolati dall'ossigeno coinvolti nella traduzione cap-dipendente.
Introduzione
Il controllo traslazionale sta emergendo come un passo altrettanto importante regolazione trascrizionale dell'espressione genica, in particolare durante i periodi di stress cellulare 1. Un punto focale di controllo traduzione è al fattore limitante di iniziazione dove le prime fasi della sintesi proteica coinvolgono il legame della eucariotica fattore di iniziazione 4E (eIF4E) al 7-methylguanosine (m 7 GTP) 5 'tappo di mRNA 2 . eIF4E è parte di un complesso di nome trimeric eIF4F che include eIF4A, una elicasi RNA, e eIF4G, una proteina impalcatura necessaria per l'assunzione di altri fattori di traduzione e le 40S del rib....
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Protocollo
1. Preparativi per colture cellulari
- Acquisto commercialmente disponibili scorte di cellule umane.
NOTA: Questo protocollo utilizza il carcinoma del colon-retto HCT116 e renali cellule primarie umane prossimali tubulari epiteliali (HRPTEC). - Fare 500 ml di mezzo per la cultura di HCT116: Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) / medio alta di glucosio integrato con 7,5% siero fetale bovino (FBS) e 1% penicillina / streptomicina (P / S).
- Fare 500 ml di mezzo per la cultura di HRPTEC: media delle cellule epiteliali integrato con il 5% FBS, 1% supplemento di crescita delle cellule epiteliali, e l'1% P / S.
- Preparare 50....
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Risultati
Analisi di Capacità Cap-binding in risposta ad ossigeno di eIF4E e eIF4E2 in un m 7 GTP Affinity Colonna
Le figure 1 e 2 rappresentano le macchie occidentali del tipico m 7 GTP affinità purificazione delle due principali proteine di legame della cap in risposta alle fluttuazioni di ossigeno in due linee cellulari umane: umane renale prossimale cellule primarie tubulari epite.......
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Discussione
L'analisi delle proteine di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni di ossigeno fisiologiche può consentire l'identificazione di nuovi fattori di inizio della traduzione di ossigeno-regolamentato. L'affinità di questi fattori per tappo di mRNA o di altre proteine cap-associate al 5 'può essere misurata con la forza della loro associazione di m 7 GTP-linked perline agarosio. Un avvertimento di questa tecnica è che misura il potenziale cap-legame delle proteine post-lisi, ma e.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio di Scienze Naturali e Ingegneria del Canada e dal Ministero della Ricerca e dell'Innovazione dell'Ontario.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| γ-amminofenil-m7GTP agarosio C10 perline legate Jena | Bioscience | AC-1555 | Agarosio m7GTP |
| Piatto di coltura | Corning | 877222 | 10 cm |
| mm | Thermofisher | 130183 | piatto di coltura da 15 cm |
| AEBSF Cloridrato | ACROS Organici | A0356829 | AEBSF |
| Perle di agarosio | Jena Bioscience | AC-0015 | Controllo delle perle di agarosio |
| Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Componente del tampone di caricamento SDS-PAGE |
| Provette da centrifuga da 1,5 ml | FroggaBio | 1210-00S | Utilizzato per centrifugare piccoli volumi |
| Provette da centrifuga coniche da 15 ml | Fisher | 1495970C | Utilizzato nella coltura di cellule primarie |
| Inibitore della tripsina definito | Fisher | R007100 | DTI |
| Ditiotreitolo | Fisher | BP172-25 | DTT |
| Terreno cellulare epiteliale (kit completo) | ScienCell | 4101 | Include integratori di siero e fattore di crescita) |
| Glicerolo | Fisher | BP229-1 | Componente del tampone di caricamento SDS-PAGE |
| 100 mM Guanosina 5'-trifosfato, 1 ml | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 carcinoma colorettale | ATCC | CCL-247 | Linea cellulare tumorale umana |
| Cellule epiteliali tubulari prossimali renali umane | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Terreni standard per colture cellulari umane |
| Soluzione di iclone penicillina-streptomicina | GE Life Sciences | SV30010 | Componente antibiotico di DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Stazione di lavoro per ipossia |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Componente detergente del tampone di lisi |
| Fosfato monopotassico | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
| Cloruro di potassio | Fisher | P217-500 | KCl |
| Cloruro di magnesio | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Cloruro di sodio | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Fluoruro di sodio | Fisher | 5299-100 | NaF (componente inibitore della fosfatasi del tampone di lisi) |
| Fosfato disodico | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Siero fetale bovino di grado premium | Seradigm | 1500-500 | FBS |
| Cocktail di inibitori della proteasi (100x) | Segnalazione cellulare | 58715 | Componente del tampone di lisi |
| Sodio Dodecil solfato | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Sodio Ortovanadato | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Componente dei tamponi |
| 0,05% Tripsina-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Tripsina utilizzata per staccare le cellule aderenti |
Riferimenti
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), ....
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Ristampe e permessi
