Articolo metodologico

Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

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DOI:

10.3791/55150

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20 gennaio 2017

 , 
1Department of Molecular Biology - Functional Genomics, Laimburg Research Centre

In questo articolo

Sommario

proteine ​​effettrici batteriche sono importanti per stabilire le infezioni di successo. Questo protocollo descrive l'identificazione sperimentale di partner di legame proteici di una proteina batterica effettrici nel suo ospite vegetali naturali. Identificare queste interazioni effettrici via lievito schermi doppio ibrido è diventato uno strumento importante per svelare le strategie di patogenicità molecolari.

Abstract

Svelare i meccanismi molecolari di manifestazioni della malattia è importante per capire le patologie e lo sviluppo dei sintomi in scienza delle piante. I batteri si sono evoluti diverse strategie per manipolare il loro metabolismo ospite a proprio vantaggio. Questa manipolazione batterica è spesso accoppiato con sviluppo sintomo grave o la morte delle piante colpite. Determinare le molecole batteriche specifici responsabili della manipolazione ospite è diventato un settore importante nella ricerca microbiologica. Dopo l'identificazione di tali molecole batteriche, chiamati "effettori", è importante chiarire la loro funzione. Un approccio semplice per determinare la funzione di un effettore è individuare partner proteico obbligatorio in ogni suo ospite naturale tramite uno schermo di lievito doppio ibrido (Y2H). Normalmente l'ospite ospita numerosi potenziali partner di legame che non possono essere previsti in misura sufficiente dagli qualsiasi algoritmo in silico. E 'quindi la scelta migliore per Perform a schermo con l'ipotetico effettrici contro un'intera biblioteca di proteine ​​ospite espresse. E 'particolarmente difficile se l'agente eziologico è incoltivabile come fitoplasmi. Questo protocollo fornisce istruzioni passo-passo per la purificazione del DNA da un impianto di fitoplasma-infettati ospite legnoso, l'amplificazione delle potenzialità effettori, e la successiva identificazione di partner di interazione molecolare della pianta con uno schermo Y2H. Anche se gli schermi Y2H sono comunemente usati, vi è una tendenza a esternalizzare questa tecnica per le aziende biotecnologiche che offrono il servizio Y2H ad un costo. Questo protocollo fornisce istruzioni su come eseguire un Y2H in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare decentemente attrezzata con tecniche di laboratorio standard.

Introduzione

Lievito schermi a due ibridi (Y2H) sono stati sviluppati circa 27 anni fa 1 e da allora sono stati ampiamente utilizzati in vari campi di determinare specifiche interazioni proteina-proteina 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . L'interazione fisica di un effettore batterica con una proteina bersaglio host è spesso il presupposto per la manipolazione funzionale di questo proteina bersaglio. Analizzando queste interazioni si è spostato al centro di molti diversi settori della biologia delle infezioni 12, 13, 14, 15,"> 16, 17, 18. Il principio della schermata Y2H è che l'interazione di due proteine porta alla ricostituzione di un fattore di trascrizione funzionale che guida l'espressione di geni reporter. L'effettore noto (la" esca ") è traduzionali fuso al dominio di legame al DNA (DBD) del fattore di trascrizione, e le potenziali partner di interazione (il "preda") vengono fuse al dominio di attivazione (aD) del rispettivo fattore di trascrizione. Poiché il partner interagenti è noto, una libreria di potenziale interattori è clonati nel cosiddetto "preda-library." Normalmente, questa libreria è fatta da clonazione cDNA in un apposito preda vettore di espressione plasmidico codificante l'AD che è compatibile con l'esca vettore codificato DBD. Nel caso di una interazione, la fattori di trascrizione ricostituiti inducono l'espressione di geni reporter, che generalmente consentono la selezione crescita del lievito. ilidentificazione di interattori si ottiene sequenziamento del plasmide preda con primer specifici plasmide.

I batteri hanno sviluppato diverse strategie per manipolare e sfruttare il metabolismo del loro ospite o di eludere i meccanismi di difesa e secernere molecole effettrici tramite diversi sistemi di secrezione batterici 19, 20, 21. Determinare i partner di legame di questi effettori batterici è dunque il primo passo per identificare il percorso manipolato nell'ospite. Questo porta ad una migliore comprensione dei meccanismi specifici di patogenicità.

Schermi Y2H vengono eseguiti per identificare interazioni effettori batterica durante fitoplasmosi, e spesso, Y2H è un primo esperimento cruciale per l'ulteriore caratterizzazione dei meccanismi molecolari di patogenicità nella ricerca fitoplasmi 22, 23. Tuttavia, il riunitoDescrizione hod nella maggior parte delle pubblicazioni è piuttosto scarsa, e queste tecniche sono spesso in outsourcing alle aziende biotech. Per attirare l'attenzione sulla fattibilità di questo metodo, questo protocollo fornisce informazioni passo-passo per identificare i partner di interazione di una molecola effettore batterica nel suo ospite naturale.

Nonostante l'ampio uso e l'approccio avanzamento veloce di schermi Y2H, non si deve dimenticare che alcune interazioni non potrebbero verificarsi nel sistema lievito. Ciò è dovuto al fatto che la cellula di lievito viene utilizzato come una sorta di "recipiente di reazione in vivo" con alcune limitazioni biologiche. Diversi autori hanno affrontato i vantaggi e gli svantaggi di Y2H e suoi derivati 11, 24, 25, 26, 27. Considerazioni generali sono, per esempio, che la cellula di lievito potrebbe non fornire la appropriatal'espressione genica, (post) traslazionale, o le condizioni translocational per le rispettive proteine ​​in fase di studio. Questo può portare a risultati falsi negativi nella schermata. Interazioni positive possono a loro volta essere artefatti e potrebbero non verificarsi nella situazione fisica (cioè, nel caso di effettori nell'ospite appropriato). È quindi indispensabile confermare le interazioni del sistema di espressione di lievito eterologa con una prova di interazione indipendente in un sistema biologico più strettamente correlati.

In questo studio, sono stati individuati i partner vincolanti del ATP_00189 effettori del patogeno per le piante non coltivabili Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). I risultati forniscono importanti informazioni sui meccanismi molecolari alla base dello sviluppo dei sintomi della proliferazione mela 28, una malattia che provoca elevate perdite economiche nelle regioni melicoltura colpite in Europa 29.

Protocollo

1. Raccolta radice e foglia di campioni da alberi di mele infette

Nota: DNA del patogeno-specifica può essere purificato dalle radici o foglie. La sezione seguente fornisce un protocollo per il campionamento di entrambi.

  1. Per la preparazione del DNA
    1. Raccolta dei campioni e preparazione dalle radici
      1. Identificare gli alberi infetti con "Apple proliferation" sintomi specifico d'30, 31 e gli alberi di controllo che sono senza sintomi. Utilizzando forbici pulite, tagliare campioni radice che hanno un diametro di 0,5 - 1 cm e una lunghezza di circa 5 cm. I campioni tagliati dalla tre diversi, i siti distanti del sistema radicale, e metterli in sacchetti di plastica adeguatamente etichettati.
        1. Conservare i campioni in una scatola fredda con pacchetti termali refrigerati e conservarli in frigorifero a 4 ° C, fino al procedimento.
          Nota: l'architettura e la struttura della radice può variare rispetto allo stato fisiologico of l'albero. È importante campionare a tre siti diversi e non prendere radichette troppo sottili. I campioni possono essere conservati per diversi giorni a 4 ° C, ma i tempi di inattività aumentano il rischio di stampaggio. campioni Moldy non possono essere utilizzati per la preparazione del DNA.
      2. Risciacquare i campioni radicolari con acqua per rimuovere il terreno. Metteteli in una capsula di Petri sterile e usare un bisturi sterilizzato per rimuovere l'epidermide radice e la corteccia.
        1. Pulire il bisturi con un panno pulito e privo di lanugine pulire, immergerlo nel 70% (v / v) di acqua di etanolo, e il calore-sterilizzare sopra una fiamma aperta (ad esempio, becco Bunsen). Gratta il floema con il bisturi, tagliare in piccoli pezzi, e un'aliquota di 30 - 100 mg di floema tritato in un tubo di reazione 2,0 ml sterile. Conservare i campioni a -80 ° C per diversi mesi.
    2. la raccolta e la preparazione di foglie di esempio
      1. Identificare un infetto e un albero di controllo asintomatico, unas descritto al punto 1.1.1.1, e raccogliere dieci foglie indenne per albero. Un albero per ogni condizione è sufficiente.
      2. Lavare le foglie con acqua e pulire le superfici a spruzzo 70% (v / v) di etanolo. Mettere le foglie in una capsula di Petri sterile e sezionare la nervatura centrale (vena centrale) di ogni foglia con un bisturi sterile. Rimuovere l'epidermide e la corteccia dalla nervatura centrale, tagliare la nervatura centrale in piccoli pezzi, e un'aliquota di 100 mg del tessuto nervatura centrale in un tubo di reazione da 2,0 ml sterile. Utilizzare i campioni immediatamente per la preparazione del DNA o conservare a -80 ° C per diversi mesi.
        Nota: È conveniente Aliquotare il materiale vegetale in porzioni di 100 mg ed eventualmente congelarli per la conservazione. Ogni aliquota può essere utilizzato direttamente per la preparazione del DNA. Pesatura materiale vegetale surgelati è ingombrante, poiché il materiale vegetale congelato tende a formare blocchi.

2. cetiltrimetilammonio bromuro (CTAB) a base di DNA Preparazione

Nota: il DNA può essere purificato con qualsiasi metodo di purificazione del DNA basata su colonne di materiale vegetale. In questa sezione, un metodo CTAB-based per la purificazione del DNA è descritto. Purificazione del DNA viene eseguito in base ad un protocollo modificato descritto altrove 32.

  1. Preparare i seguenti tamponi:
    1. Tampone CTAB: Sciogliere 1% w / v cetiltrimetilammonio bromuro (CTAB, M r: 364,45 g / mol), 100 mM tris-idrossimetilamminometano (Tris, M r: 121.14 g / mL), 1,4 M di cloruro di sodio (NaCl, M r: 58,44 g / mol), e 20 mm etilendiamminotetraacetico sale disodio (L 'NaEDTA, M R: 372,24 g / mol) in acqua e ad adattarsi a pH 8.0.
    2. N-Lauroylsarcosine buffer: Sciogliere 10% w / v sale di sodio N-lauroylsarcosine 33 (M r: 293,38 g / mol), 100 mM Tris, e 20 mM L 'NaEDTA in acqua e regolare il pH a 8,0.
    3. Tris-EDTA (TE) buffer: Sciogliere 10 mM Tris e 1 mM L 'NaEDTA in acqua e autoclave la soluzione.
    4. Soluzione di acetato di ammonio: Preparare un 5 M di acetato di ammonio (M r: 77,0825 g / mol) soluzione in acqua e autoclave è a 120 ° C e 1,2 bar per 20 min.
  2. Mix 30 - 100 mg di materiale vegetale tritato fresco o surgelato (passo 1.1.2.2.) Con 300 ml di tampone CTAB, 30 ml di tampone N-Lauroylsarcosine, 6 ml di proteinasi K (10 mg / mL) e 12 ml di 2-mercaptoetanolo 34 (M r: 78,13 g / mol). Agitare per 60 min a 60 ° C. Lasciate che la miscela raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere.
  3. Aggiungere 360 ​​ml di soluzione di acetato di ammonio e mescolare energicamente. Sia la soluzione riposare per 5 minuti, quindi si centrifuga che a 15.000 xg per 10 min a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante in una provetta pulita e aggiungere 720 ml di ghiacciata isopropanolo 35. Precipitare il DNA per almeno 30 min a -20 ° C.
  4. Centrifugare la miscela a 15.000 xg per 30 min a 4° C e scartare il surnatante. Lavare il pellet con 500 ml di ghiacciata etanolo al 70% e spin giù a 15.000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  5. Eliminare il surnatante etanolo e immergere immediatamente il flaconcino su un tovagliolo di carta pulito per rimuovere le goccioline residue. Assicurarsi di rimuovere quanto più liquido possibile. Far asciugare il pellet per 15-20 minuti o per 2-3 minuti in una centrifuga a vuoto concentratore. Non over-asciugare il pellet da tempi di evaporazione estesi riscaldamento eccesso o.
  6. Risospendere il pellet in 700 ml di tampone TE e infine scaldare a 37 ° C per facilitare la dissoluzione. Aggiungere 10 ml di RNAsi (10 mg / mL) e incubare per 15 min a 37 ° C, agitando a 300 rpm.
  7. Aggiungere 700 ml di cloroformio: alcool isoamilico 36 24: 1 e mescolare bene. Centrifugare la miscela a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C e trasferire la fase superiore del surnatante in una nuova provetta pulita.
  8. Precipitare il DNA nel surnatante aggiungendo700 ml di 2-propanolo 35 (isopropanolo, M r: 60.1 g / mol) e incubando per almeno 30 min a -20 ° C. Centrifugare la miscela a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
  9. Lavare il pellet con 500 microlitri di etanolo al 70% e centrifugare a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Asciugare il pellet come descritto al punto 2.5. Sciogliere in 50 ml di TE.

3. Individuare Candidatus Phytoplasma DNA mali-specifica mediante PCR

  1. Diluire il DNA purificato dal materiale vegetale 1:10 in acqua priva di nucleasi ed eseguire una PCR con primer specifici patogeni 37.
    1. Verificare la presenza di P. DNA specifiche mali nel materiale vegetale utilizzando un protocollo quantitativa PCR con primer e sonde specifiche per P. fitoplasmi mali 37. Controllare l'assenza degli altri membri fitoplasmi 16SrX eseguendo la stessa PCR con le rispettive sonde per CaND. P. prunorum e per Cand. P. pyri DNA 37.
      NOTA: DNA da un albero non infetto deve essere testato anche per confermare l'assenza di un agente patogeno in questo controllo. A questo punto, è importante che il DNA da altre specie strettamente correlate fitoplasmi è assente nel campione, poiché ciò aumenta il rischio di amplificare l'effettore da una specie fitoplasmi diversi da P. mali. Una infezione mista con un altro strettamente correlato P. mali gruppo fitoplasmi 16SrX è escluso analizzando il campione con le rispettive sonde. Poiché i risultati attesi dovrebbero essere negativa per altri phytoplasma 16SrX, è importante includere i controlli appropriati positivi che indicano PCR efficacia.

4. amplificando il potenziale Effector Gene e subcloning nel vettore Y2H Bait

  1. Amplificare il gene atp_00189 phytoplasmal (che non comprende la parte del segnale peptide) di P. Mali utilizzando i primer 5-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (in avanti) e 5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (reverse), con siti di restrizione per EcoRI e SalI al 5 'e al 3' estremità, rispettivamente. Purificare il prodotto di PCR con un metodo di purificazione di DNA basata su colonne.
  2. Clonare il amplicone nel vettore Y2H esca PLEXA-N tramite EcoRI e SalI legatura.
    NOTA: Qui, 100 ng di EcoRI e SalI linearizzato PLEXA-N vettore è stato combinato con 15 ng di simile digerito atp_00189 PCR amplicone e 1 U di T4-ligasi. La legatura è stata effettuata in tampone contenente 40 mM Tris-HCl (pH 7,9 a 25 ° C), 10 mM MgCl 2, 10 mM ditiotreitolo (DTT, M r: 154.25 g / mol), e 0,5 mM adenosina trifosfato (ATP, M r: 507,18 g / mol) in un volume totale di 10,0 microlitri a 16 ° C per una notte (14-20 h). Analizzare il DNA dall'albero non infetto con gli stessi primer per escludere fondo non specifico legame con Malus domestica x </ Em> DNA.
  3. Transform 1 ml di miscela di legamento in cellule di E. coli electrocompetent e selezionare per i cloni resistenti kanamicina su Luria-Bertani (LB) piastre integrato con 50 mg / ml kanamicina solfato 38.
  4. Purificare il DNA plasmide dai cloni batterici selezionati con un mini kit di preparazione plasmide colonna a base seguendo le istruzioni del produttore, e controllare la riuscita integrazione e l'orientamento dell'inserto mediante sequenziamento 39.

5. Prova di auto-attivazione (Auto-attivazione) della proteina potenziale Effector

  1. Preparare i seguenti tamponi e mezzi di crescita:
    NOTA: La nomenclatura per piatti divide le lievito-selettivo le abbreviazioni degli aminoacidi mancanti nella rispettiva media con un "-" prima della sigla. Ad esempio, SD-TRP-Leu-sue lastre contengono tutti gli amminoacidi, ma trp, leu e la sua.
    1. 10x dropout mix: Pesare200 mg di L-arginina monocloridrato (M r: 210,66 g / mol), 300 mg di L-isoleucina (M r: 131.17 g / mol), 269 mg di monoidrato L-lisina (M r: 164.21 g / mol), 200 mg di L-metionina (M r: 149.21 g / mol), 500 mg di L-fenilalanina (M r: 165,19 g / mol), 2 g di L-treonina (M r: 119.12 g / mol), 300 mg di L-tirosina (Mr: 181.19 g / mol), 200 mg di L-uracile (112.09 g / mol), e 1,5 g di L-valina (M r: 117.15 g / mol). li Sciogliere in 1 L di acqua bidistillata e autoclave la soluzione. Mantenere la soluzione a 4 ° C.
      NOTA: Il rispettivo mix di abbandono può essere premiscelato anche acquistati.
    2. 10x L-adenina supplemento: Pesare 100 mg di sale di L-adenina hemisulfate (ade, M r: 184.17 g / mol) e scioglierli in 50 ml di acqua bidistillata. Filtro sterilizzare la soluzione con un filtro pori 0,22 micron.
    3. 10x L-istidina supplemento: Pesare 100 mg di L-istidina monocloridrato monoidrato (il suo, M r : 209.63 g / mol) in 50 mL di acqua bidistillata e filtro sterilizzare con un filtro pori 0,22 micron.
    4. 10x L-leucina supplemento: Pesare 500 mg di L-leucina (Leu, M r: 113.17 g / mol) in 50 mL di acqua bidistillata e filtro sterilizzare con un filtro pori 0,22 micron.
    5. 10x L-triptofano supplemento: Pesare 100 mg di L-triptofano (trp, M r: 204.23 g / mol) in 50 mL di acqua bidistillata e filtro sterilizzare con un filtro pori 0,22 micron.
    6. SD-trp-leu-his-ade-media e piastre: Sciogliere 0,67% w / v base azotata di lievito (senza amminoacidi) e 2% w / v D-glucosio monoidrato (M r: 198,17 g / mol) in doppio acqua e autoclave distillata. Per piastre di agar, aggiungere 2% w / v di agar (grado microbiologica) prima di sterilizzazione in autoclave.
    7. Per preparare piatti selettive, aggiungere 1x del aminoacido soluzione madre al mezzo Sd-TRP-Leu-la-ade autoclave. Nel preparare lastre, assicurarsi che l'agar viene raffreddata a ~ 50 ° C prima di aggiungeregli aminoacidi. Conservare le soluzioni madre sterili.
    8. Media YPAD: sciogliere 1% w / v di estratto di lievito, 2% w / v peptone (grado microbiologica), 0,004% w / v adenina hemisulfate sale (M r: 184.17 g / mol), e 2% w / v di glucosio monoidrato per acqua e autoclave bidistillata. Per piastre di agar YPad, aggiungere 2% w / v di agar prima di sterilizzazione in autoclave. Per preparare 2x YPAD, utilizzare due volte le concentrazioni degli ingredienti di cui sopra.
      Nota: (opzionale) A causa della elevata concentrazione di glucosio nel mezzo, medio 2x YPAD diventa scuro-brunastro dopo la sterilizzazione in autoclave. In alternativa, un 40% (w / v) di soluzione di glucosio può essere preparato e sterilizzato facendolo passare attraverso un filtro di 0,22 micron. Il glucosio magazzino soluzione sterilizzata per filtrazione viene quindi aggiunto al autoclavato 2x YPAD (privo di glucosio) in condizioni sterili. Per evitare errori di volume, l'2x YPAD deve essere preparato, tenendo presente che una soluzione di glucosio 10x viene successivamente aggiunto. Ciò significa che, per esempio, invece di 1 L of media, solo 900 ml è preparato (che contiene tutti gli ingredienti tranne il glucosio) e sterilizzati in autoclave, e poi viene aggiunto 100 ml di soluzione di glucosio.
  2. trasformazione di lievito litio acetato-mediata per il test di auto-attivazione
    1. Streak il ceppo Saccharomyces cerevisiae giornalista NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ADE2 LYS2: :( lexAop) 4 HIS3 URA3: :( lexAop) 8-lacZ ADE2: :( lexAop) 8-ADE2 GAL4) da un glicerolo congelati magazzino su una piastra di agar YPAD e incubare per 48 ore a 30 ° C. Scegliere colonie di questo piatto e inoculare 50 ml di terreno YPAD. Lasciate che il lievito crescere e misurare il diametro esterno 600 regolarmente per monitorare la crescita.
    2. Lasciate che il lievito a crescere ad un diametro finale 600 di 0,5-0,8. Agglomerare le cellule da essi centrifugazione a 700 xg per 5 minuti e risospendere in 2,5 ml di acqua bidistillata, autoclave.
    3. Preparare sei aliquote con 100 ml di sospensione di lievito e aggiungere 240 ml di 50% W / v polietilenglicole 4000 (PEG, M r: 3.500-4.000 g / mol), 36 ml di 1 M di litio acetato diidrato (LiOAc, M r: 102.02 g / mol), e 25 ml di 2% w / v DNA dello sperma di salmone (disciolto). Preparare tutti i reagenti con acqua bidistillata sterile.
    4. Etichettare i sei fiale contenenti la sospensione di lievito da "a" a "f" e aggiungere il seguente DNA plasmide vettore: controlli negativi: (a) 1,5 mg di esche plasmide con il effettrici (Plexa-N-atp00189 28), (b) 1,5 mg di plasmide preda vuoto PGAD-HA 41, (c) 1.5 mg di vettore esca vuoto PLEXA-N 41, e (d) 1,5 mg di esche vettore vuoto PLEXA-N e 1,5 mg di vuoto preda plasmide PGAD-HA; controlli positivi: (e) 1,5 mg di positivo-controllo esca plasmide DNA PLEXA-p53 41 e 1,5 mg di positivo-preda plasmide PACT-larget 41; e il test di auto-attivazione: (f) 1,5 mg di baesso plasmide con il effettrici (Plexa-N-atp00189) e 1,5 mg di vuoto preda plasmide PGAD-HA.
    5. Mescolare le reazioni vigorosamente e incubare per 45 min a 42 ° C in un bagno d'acqua. Agglomerare le cellule per 5 minuti a 700 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 250 ml di 0,9% (w / v) di cloruro di sodio (NaCl, M r: 48.44 g / mol) e la diffusione 50 microlitri sui seguenti piastre selettive: SD-trp, Sd-leu, SD-trp- leu, SD-TRP-Leu-la, e SD-TRP-Leu-la-Ade.
    6. Incubare le piastre per 3 - 4 giorni a 30 ° C. Dopo il primo giorno di incubazione, sigillare le piastre con parafilm plastica per evitare che le piastre si secchi.
    7. Controllare la crescita del lievito sulle piastre.

6. Verificare l'espressione del Effector

  1. Testare l'espressione del effettore mediante Western blot 42 con un anticorpo contro la Lex-A tag che è accoppiato al N-terminale della effettore quandoespresso da PLEXA-N.
    Nota: Si consideri che il translationally fuso Lex-Un tag aggiunge circa 24 kDa al peso effettivo della proteina di interesse. Questo è importante quando si identifica la dimensione proteina nel Western blot.

7. La schermata Y2H

  1. Streak il PLEXA-atp00189 (attuatore) -transformed NMY51 su un piatto SD-trp fresco e lasciarlo crescere per 2 - 3 giorni a 30 ° C, fino a quando appaiono colonie rosse.
  2. Seminare 3 mL di terreno SD-trp in una piccola boccetta agitando con una colonia rossa dalla piastra agar e incubare una notte a 30 ° C con agitazione a 120 - 150 rpm.
  3. Inoculare 20 mL di SD-trp in un pallone agitazione con 1 ml di cultura durante la notte e lasciarlo crescere per 8 ore.
  4. Regolare la cultura di OD 600 = 0,2 con l'aggiunta di media SD-trp e inoculare 2x 100 ml in agitazione boccette con 10 ml di coltura starter ciascuno. Crescere durante la notte con agitazione a 30 ° C.
    Nota: Assicurarsi che il lievito non cresce a OD 600> 0.5 e diluire con fresca SD-trp.
  5. Misurare il diametro esterno 600 e il pellet 120 OD 600 "unità". Ad esempio, se un OD 600 di 1,2 è misurata, centrifugare 100 mL, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 800 ml di pre-riscaldato 2x YPAD in un pallone shaker con ancoretta magnetica.
    1. Spin giù una aliquota di 2 ml, togliere il surnatante, e risospendere il pellet in acqua. Assicurarsi che il diametro esterno 600 della sospensione di lievito è compresa tra 0,15 e 0,2. In caso contrario, regolare con 2x YPAD o aggiungere più lievito dalla cultura durante la notte.
      Nota: 2x YPAD è marrone scuro e può influenzare i risultati della misurazione OD. Pertanto, è necessario per risospendere le cellule di lievito in acqua prima di determinare il OD. In alternativa, 2x YPAD può essere preparato mediante sterilizzazione glucosio separatamente, come descritto nel passaggio 5.1.8 nota, che impedisce la colorazione scura del mezzo.
  6. Incubare la cultura rimanente lievito in un appropriately dimensioni matraccio agitatore (800 mL in un matraccio agitatore 2 L o dividere 2 x 400 mL in due beute 1 L shaker) e incubare a 30 ° C 120 - 150 rpm. Misurare il diametro esterno 600 circa ogni 1,5 ore fino a quando un OD 600 di 0,6 viene raggiunta (prende 4 - 6 h). Nel frattempo preparare le soluzioni descritte nel passaggio successivo.
  7. Litio trasformazione acetato-mediata
    1. Sciogliere 2% w / v DNA di sperma di salmone in acqua e far bollire 500 microlitri per 5 minuti in un bagno d'acqua a 100 ° C. Posizionare la provetta in ghiaccio per 2 minuti e ripetere la fase di riscaldamento. Mantenere il DNA in ghiaccio fino a nuovo uso.
    2. Preparare le seguenti mescole:
      1. TE / LiOAC mix: Mescolare 3.08 ml di 1 M LiOAC, 3,08 ml di 100 mM Tris / 10 mM EDTA (pH: 7,5), e 21,84 ml di acqua bidistillata sterile.
      2. PEG / LiOAc mix: Combinare 4,2 mL di 1 M LiOAc, 4.2 mL di mM Tris / EDTA 10 mM (pH: 7,5), e 33,6 ml di 50% (w / v) di PEG 4000.
    3. Centrifuga la cultura di lievito 800 ml (OD 600 = 0,6)a 700 xg per 5 minuti per agglomerare le cellule. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml di acqua bidistillata sterile. Agglomerare le cellule di nuovo a 700 g per 5 minuti e scartare il surnatante. Nota: se necessario dividere la sospensione in diverse fiale per centrifugazione. I volumi liquidi in 7.7.3. e 7.7.4. riferirsi a tutta pellet derivato da 800 ml di sospensione.
    4. Risospendere il pellet in 16 ml di TE / LiOAc mix (vedi punto 7.7.1.1); spin down a 700 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 9,6 ml di TE / LiOAC mix.
    5. Preparare la seguente reazione si mescola in modo appropriato dimensioni vasi reazione polipropilene: 12 fiale con 7 mg di PGAD-HA-cDNA vettore biblioteca, 100 ml di 2% del DNA dello sperma di salmone (vedi punto 7.7) e 2,5 ml di PEG / LiOAc mix. Aggiungere 600 microlitri di sospensione cellulare di lievito dal passo 7.10 a ciascuno dei 12 fiale e mescolare vigorosamente per 1 min.
    6. Incubare la miscela di reazione per 45 minuti a 30 ° C in un bagno d'acquad mescolare energicamente ogni 15 min. Aggiungere 160 ml di DMSO ad ogni fiala e mescolare energicamente. Incubare la miscela per altri 20 minuti a 42 ° C.
    7. Agglomerare le cellule a 700 xg per 5 minuti, scartare il surnatante, e risospendere ogni pellet in 3 mL di 2x YPAD. Pool tutte le cellule (per un totale di 36 mL da 12 fiale) in un matraccio da 100 mL shaker e incubare il lievito per 90 min a 30 ° C e 120 rpm.
    8. Agglomerare le cellule per 5 minuti a 700 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 4,5 mL di soluzione sterile 0,9% (w / v) di NaCl e mescolare bene accuratamente pipettando su e giù con una pipetta sierologica 10 mL. Prelevare 50 ml e preparare diluizioni di dieci volte in NaCl allo 0,9% da 1:10 fino a 1: 1.000. Piatto 100 ml di ogni diluizione su piastre di Petri di 90 mm contenenti SD-TRP-leu agar.
    9. Stendere il resto della risospensione di lievito diluito in 16 x 150 mm di diametro piatti di Petri con SD-TRP-Leu-la-ade agar. Aggiungere 3-AT al mezzo per ridurre auto-attivazione. Incubare la SD-TRP-leupiastre per tre giorni e piatti della SD-TRP-Leu-suoi-Ade per quattro giorni a 30 ° C.
      NOTA: I cloni che compaiono sulle piastre selettive sono (potenziali) coppie che interagiscono e portano la codifica plasmide PGAD-HA per l'esca interagire partner.
    10. Determinare l'efficienza di trasfezione contando le colonie delle diverse diluizioni seriali sulle piastre di selezione SD-TRP-Leu. Trasferire ogni clone con la scelta e striature la colonia con una punta pipetta sterile su piastre fresche SD-TRP-Leu-la-ade-selettivo. Incubare le piastre per 24 ore a 30 ° C. Ripetere questa operazione ogni giorno fino a raggiungere un totale di cinque passaggi.

8. Analisi dei cloni dalle piastre selettivi

  1. Preparare una sterile tubo di reazione da 2 ml con 1 ml di SD-TRP-Leu-la-Ade per ogni clone sotto una cappa sterile. Effettuare un foro in ogni provetta con un ago caldo e coprire il foro con un pezzo di isolante permeabile ai gas. Seminare ciascun flacone con compagno di colonia fresca rial da un clone (passo 7,17; utilizzare cloni dopo il 5 ° passaggio) e incubare per 24 ore a 30 ° C, agitando a 150 rpm.
    NOTA: È importante prendere cloni da una piastra fresca, perché lievito preso dalle lastre memorizzati per diversi giorni a 4 ° C non crescono sufficientemente entro 24 h nel mezzo liquido.
  2. Pellet il lievito per 5 minuti a 4000 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet nel tampone di risospensione appropriata (dal rispettivo kit miniprep plasmide DNA) e trasferirlo ad un tubo di reazione da 2,0 mL fresco. Aggiungere 100 ml di perline di vetro lavata con acido (425- 600 micron di diametro) e mescolare energicamente per 5 min.
  3. Aggiungere il rispettivo tampone di lisi e procedere con la purificazione plasmide utilizzando un mini kit di preparazione plasmide seguendo le istruzioni del produttore. Eluire il DNA plasmide con 50 ml di acqua.
  4. Utilizzare il DNA dal punto 8.3 per una reazione di sequenziamento con la preda primer specifico-plasmide, GAL4ADseqref "> 41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3 '.
  5. Verificare l'interazione da parte de novo co-trasformazione 43, 44 l'esca e il vettore preda. Selezionare il lievito trasformato su piastre di selezione SD-TRP-Leu-la-Ade.

Risultati

Prima che lo schermo Y2H reale può essere eseguita l'esca deve essere testato per l'auto-attivazione. Questo risultato è ottenuto trasformando il vettore di espressione esca insieme con il vettore libreria preda vuoto e di controllo della crescita su piastre selettive.

Per analizzare se la proteina ATP_00189 phytoplasmal è auto-attivazione, il test di auto-attivazione è stata eseguita come descritto nel paragrafo 5. Il plasmide esca è complementare il trp e la preda plasmide il auxotrofia leu di S. cerevisiae NMY51 40. Un successo di co-trasformazione è quindi caratterizzato da una crescita su piastre selettive prive trp e leu. L'interazione dell'esca e una proteina preda porta ad una complementazione del suo e ade auxotrofia di NMY51. Se appare autoattivazione dall'esca in assenza di una interazione, il lievito cresce su piastre selettive prive sua e ade. Forte e debole autoattivazione può verificarsi. Strong autoattivazione dell'esca è caratterizzata da una crescita del lievito co-trasformato on trp-leu-his-ade impoverito piastre di selezione. Debole auto-attivazione porta alla crescita su trp-Leu-la, ma non su TRP-Leu-la-Ade impoverito piastre di selezione. controlli adeguati positivi sono indispensabili per interpretare i risultati del test di auto-attivazione. Una sintesi dei risultati attesi del test di auto-attivazione e la loro interpretazione è fornito nella tabella 1 e visualizzati nella figura 1.

figure-results-1
Figura 1: Esempio di Bait test auto-attivazione di un esca prima di eseguire una schermata Y2H. S. cerevisiae NMY51 è stato co-trasformato con l'interazione esca (PLEX-p53) e prede (PACT-larget) come controllo positivo (pannello di sinistra: ac), una debole auto-attivazione più una preda vuoto library vettore (pannello centrale: df) e un esca non auto-attivazione più un vettore libreria preda vuoto (pannello di destra: gi). Il lievito co-trasformato sono state coltivate su piastre SD prive trp e leu (pannello superiore: a, d, g), trp, leu e il suo (pannello centrale: B, E, H) e trp, leu, la sua e la facciata (in basso pannello: C, F, I). Selezione sul mezzo privo di trp e leu è un controllo positivo per il successo di co-trasformazione, come il vettore esca completa il auxotrofia trp e il vettore preda leu auxotrofia di NMY51 (crescita su SD-TRP-leu). Nel caso di una interazione tra esca e la preda o di un auto-attivazione della esca, l'espressione giornalista di NMY51 sia acceso e completa il suo e ade auxotrofia (crescita su SD-TRP-Leu-la-Ade). Un debole auto-attivazione è caratterizzato da una crescita su SD-TRP-Leu-suoi piatti (pannello centrale, df). Debole autoattivazione di un'esca deve essere diminuito preventiva per analizzare l'escain una schermata Y2H, ad esempio aggiungendo 3-AT ai mezzi selettivi. esaurimento aminoacidi sono indicate con "-" nel rispettivo nome del supporto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

PLEXA-N-atp00189 nessuna colonie nessuna crescita nessuna crescita nessuna crescita nessuna crescita
nessuna PGAD-HA nessuna crescita colonie nessuna crescita nessuna crescita nessuna crescita
PLEXA-N nessuna colonie nessuna crescita nessuna crescita nessuna crescita nessuna crescita
PLEXA-N PGAD-HA colonie colonie colonie nessuna crescita nessuna crescita
PLEXA-p53 PACT-larget colonie colonie colonie colonie colonie
PLEXA-N-atp00189 PGAD-HA colonie colonie colonie nessuna crescita nessuna crescita

Tabella 1: Risultati attesi in un saggio Self-attivazione esca. La trasformazione di S. cerevisiae NMY51 produce in crescita differenziale su terreni selettivi in base alle caratteristiche di esche co-trasformato e prede. La crescita su piastre selettive stata valutata misurando la trasformazione di diverse combinazioni vettoriali (af) dopo 72 ore di incubazione a 30 ° C. Debole auto-attivazione è caratterizzato da una crescita del lievito su SD-TRP-Leu-la e forte auto-attivazione crescita su SD-TRP-Leu-la-Ade selezione plates in assenza di un partner di interazione. Il PLEXA-N phytoplasmal codificato effettrici ATP_00189 non presenta auto-attivazione, che si caratterizza per l'incapacità del vettore esca trasformato NMY51 di crescere in assenza del suo e ade.

A seconda l'esca, uno schermo Y2H può guadagnare numerosi cloni di lievito che cresce su piastre selettive. Tutti i cloni devono essere analizzati e controllati per eventuali esuberi. Anche se è stata utilizzata una libreria di cDNA normalizzata, è molto probabile che un interactor è rappresentata in molti cloni differenti. A seconda della tecnica di clonazione biblioteca, è anche possibile che solo frammenti del gene completo sono inseriti alcuni vettori preda. È pertanto consigliabile de novo amplificare (da cDNA) e subclone il gene lunghezza della interattore e testare l'interazione in un'analisi Y2H uno-a-uno (Figura 2).

figure-results-2
Figura 2: Esempio di una interazione tra Bait and Prey in un esperimento Y2H. Uno schermo lievito doppio ibrido (Y2H) è stata eseguita e plasmidi da cloni Interactiano positivi sono stati purificati. Il vettore preda è stato sequenziato e le Malus domestica x partner di interazione ospite MdTCP24 e MdTCP25 sono stati identificati. Come MdTCP34 controllo negativo (per i quali non è stato identificato interattore nella schermata della libreria Y2H) è stato subclonato in parallelo. I geni di lunghezza completa sono stati amplificati dal cDNA mela, subclonato nel vettore preda (che esprime co-cistronically l'attivazione dominio AD) e de novo co-trasformato con il vettore esca che esprime la ATP_00189 effettori batterica accoppiato al dominio di legame al DNA (BD). Questa figura è presa da 28. Clicca qui per visualizzare un più grandeversione di questa figura.

Discussione

Nella schermata Y2H, il potenziale di proteine ​​effettrici è co-espresso con diverse proteine ​​che interagiscono ipotetici (passo 7). Ogni crescita del lievito clone contiene l'esca, ma una (potenzialmente) Interactiano diverso. Le proteine ​​che interagiscono sono codificati in una libreria di cDNA che viene clonato in plasmidi preda. L'esca e la preda plasmidi ciascun codice co-cistronically per una parte di un fattore di trascrizione di lievito. In caso di interazione fisica tra l'esca (effettori) e un interattore plasmidica preda, le due parti del fattore di trascrizione (il dominio di legame al DNA e il dominio di attivazione) sono uniti, e l'espressione del gene reporter è indotta. Il lievito è in grado di crescere su piastre di selezione SD histidine- e adenina-impoverito. Il tipo di libreria di cDNA preda dipende dalla effettore schermati e deve essere scelta di conseguenza. La preda ed esca vettore, così come il ceppo di lievito, devono essere compatibili. In questa schermata, un DNA LexA dominio di legame e l'attivazione di GAL4 Domain sono stati utilizzati come unità di fattore di trascrizione del lievito compatibili. La libreria di cDNA può essere costruito individualmente, su misura, o commercialmente ottenuti. La preparazione della libreria cDNA preda non è parte di questo protocollo. In questo protocollo, un auto-costruito, libreria di cDNA normalizzata dalla RNA di Malus x domestica foglie è stato utilizzato e clonato in PGAD-HA 41. Il effettrici (esca) esprimente il ceppo di lievito è stato trasformato con la libreria preda, e cloni sono stati selezionati su piastre di selezione SD histidine- e adenina-impoverito. Per estrarre DNA plasmidico dalle colonie di lievito, un mini kit plasmide DNA basata su colonne per i batteri è raccomandato in combinazione con un passo rottura meccanica con perline di vetro per migliorare lievito lisi (fase 8). In questa purificazione plasmide, l'esca e il vettore preda saranno purificati simultaneamente in concentrazioni relativamente basse. Tuttavia, la quantità di DNA plasmide è sufficiente per identificare il partner di interazione attraverso il sequenziamento ingegnoHout propagazione plasmide prima (fase 8.4). In alternativa, il DNA purificato nel passaggio 8.4 può essere trasformato in competente E. coli e selezionato con la preda resistenza agli antibiotici vettore-mediata (ad esempio, ampicillina l'in caso di PGAD-HA). Il E. coli selezionato colonie portano solo la libreria plasmide PGAD-HA, e ad alto rendimento purificazione plasmide può essere eseguita con questi cloni.

La trasformazione di successo di PLEXA-N e PGAD-HA costrutti completa il triptofano e leucina auxotrofia di NMY51. Un'interazione tra l'effettore e una proteina (codificati sulla PGAD-HA) porta all'attivazione del sistema reporter in NMY51 ceppi. Nel caso di auto-attivazione, NMY51 trasformato con l'effettore esprimere Plexa-N in combinazione con il vettore libreria vuota PGAD-HA cresce su piastre selettive privi trp-leu-his-ade, causa l'attivazione indesiderata del sistema reporter NMY51 40. L'auto-attivazione può essere weak e può verificarsi in assenza di trp-leu-la, o l'attivazione può essere forte e caratterizzato da una crescita su piastre trp-Leu-la-ade 41. Auto-attivazione può causare uno sfondo massiccia di cloni falsi positivi nella schermata Y2H vero e proprio. Per evitare questo, deve essere condotto un test di auto-attivazione con l'esca, in cui il vettore effettore esprimente è co-trasformato con il vettore libreria vuota. In questa impostazione sperimentale, l'espressione genica giornalista non deve essere indotta. Se auto-attivazione (cioè, la crescita su piastre selettive) è visibile nella prova, il mezzo può essere integrata con differenti concentrazioni di 3-ammino-1,2,4-triazolo 45 (3-AT). 3-AT è un inibitore della dehydratase imidazoleglycerol-fosfato (HIS3), un enzima importante durante istidina biosintesi 46. La supplementazione con 3-AT può ridurre gli effetti deboli di auto-attivazione durante schermi Y2H 47,48. Differenti concentrazioni di 3-AT devono essere testati. In questo protocollo, 1 - 40 mm 3-AT sono stati utilizzati. La concentrazione più bassa che porta alla repressione di auto-attivazione dovrebbe successivamente essere utilizzato nella schermata Y2H. Le piastre selettive del saggio autoattivazione possono essere valutati solo se le piastre SD-trp-leu del co-trasformazione contengono un numero sufficiente di cloni. Come ≥ un'indicazione 500 colonie per 90 mm (diametro) Petri sono sufficienti. Per determinare l'esatto efficienza di trasfezione, si consiglia di preparare diluizioni seriali del lievito co-trasformato e di diffonderli su piastre SD-TRP-Leu.

Per ridurre autoattivazione, l'effettore può essere clonato in PLEXA-C, un vettore di espressione esca che fonde il tag LexA al C-terminale della proteina. L'orientamento della Lex-Un tag può attenuare auto-attivazione 24. Tuttavia, non è possibile in ogni caso per ridurre o abolire autoattivazione. La formazione dicolonie rosse o rossastre indica una interazione debole o falso-positivo. Il gene reporter ADE2 di NMY51 viene attivato solo quando si tratta di un'interazione proteina-proteina, che a sua volta blocca l'accumulo di un colorante rosso in questo ceppo di lievito 40. In assenza di una interazione, NMY51 sono rossastra, mentre le colonie trasportano interactors forti sono bianchi. L'osservazione del colore delle colonie sulle piastre di selezione prevede quindi un ulteriore importante suggerimento per giudicare se le rispettive colonie sono interattori TrueType o falsi-positivi.

È eventualmente necessario adattare o modificare alcune impostazioni del test rispetto alla natura dell'esca e le caratteristiche di interazione. Ormai, sono stati stabiliti una serie di miglioramenti e di tecniche derivate del Y2H comuni per consentire l'analisi di piuttosto difficili interazioni proteina in diversi sistemi host. Una revisione da Stynen et al. 49 indirizzi di unND descrive i diversi aspetti della Y2H, i suoi miglioramenti e adattamenti, e, quindi, fornisce informazioni utili su come scegliere il saggio di interazione appropriata.

schermi Y2H e tecniche derivate si sono ampiamente utilizzati in diversi campi di ricerca, laddove è richiesta l'identificazione di interazioni proteina binari. Anche se i controlli vengono eseguiti critici, come ad esempio i test di auto-attivazione della esca e one-to-one ri-trasformazione delle proteine che interagiscono identificate, il Y2H è incline a produrre falsi risultati 26, 50, 51. Il lievito come modello non è adatto per tutti gli studi di interazione. Lievito non costituisce necessariamente un ambiente cellulare che supporta la modificazione post-traslazionale appropriato e pieghevole per ogni proteina 24. Inoltre, nel contesto Y2H, le proteine ​​sono sovra-espressi, e la loro espressione non è il controlloguidati dal loro promotore naturale. Il Y2H costringe i partner di interazione proteici al nucleo, che non è necessariamente la loro destinazione naturale subcellulare. Le circostanze nativi cellulari di interazione, quindi, non possono essere riflesse dal lievito e possono portare a risultati falsi negativi o falsi positivi. La maggior parte Y2H si basano sui lieviti auxotrofia complementazione come principio selettivo. Questa selezione nutrizionale è caratterizzato da un'elevata sensibilità, ma a costo di una ridotta selettività rispetto ad altri (ad esempio, cromogenico giornalista) Saggi 49. Se unreducible auto-attivazione (vedi sopra) o altre limitazioni si verificano per un certo effettori, il Y2H non è un test adeguato 25. In Tabella 1 e Figura 1, i risultati attesi del test di auto-attivazione sono dati. L'assenza di interazioni reali (vale a dire, i falsi negativi) può essere causato dalla tossicità della proteina, la proteina traslazionale erratoelaborazione, impedimento sterico dell'interazione, partner di interazione sottorappresentati nella libreria preda, localizzazione di membrana dell'esca, o mancanti componenti necessari per l'interazione 24.

Si raccomanda di de novo amplificare il gene intera lunghezza della proteina interagente identificato dal cDNA, subclone in PGAD-HA, ed eseguire un test interazione uno-a-uno, trasformando l'generata PGAD-HA costrutto nel esca esprimono ceppo NMY51. Ciò è necessario in quanto l'interagente osservata presente nella libreria preda potrebbe essere solo un frammento di una proteina più grande. Tuttavia, le informazioni per il rispettivo gene full-length è accessibile solo se considerevole di dati sequenza genomica e trascrittomica è disponibile. Il protocollo di trasformazione per il saggio autoattivazione qui descritto può essere applicato per un tale test uno-a-uno, e l'interazione tra l'esca e l'interagente deve essere riproducibile.

Interazioni identificate in una schermata Y2H deve sempre essere confermata da un'altra tecnica indipendente. Questa tecnica indipendente deve essere più vicino alla natura delle interazioni proteina-proteina reale. Nel caso del ATP_00189 phytoplasmal effettrici, l'interazione con i fattori di trascrizione TCP di Malus x domestica è stata verificata in planta con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) in Nicotiana benthamiana protoplasti 28 (non fa parte di questo protocollo). Il ATP_00189 proteine ​​effettrici è stato derivato dalla pianta patogeno P. mali. In planta BiFC è stato quindi deciso di verificare le interazioni ATP_00189 con i x domestica fattori di trascrizione Malus precedentemente identificati nel Y2H 28. BiFC è un saggio di interazione proteina-proteina che non richiede la traslocazione subcellulare delle proteine ​​interagenti al nucleo per attivare il sistema reporter 52. Inoltre, i in planta di espressione e macchinari modifica imita l'ambiente di interazione naturale tra la effettori batterica impianto nella sua pianta ospite. Tuttavia, uno schermo globale utilizzando BiFC non è fattibile.

Ci sono diversi passaggi del protocollo che deve essere affrontato con attenzione. Quando amplificando il gene di interesse (step 4), è importante escludere che i primer si legano al DNA vegetale. Pertanto, il DNA da piante non infette deve essere incluso come controllo negativo. La sequenza del gene di interesse non deve contenere i siti di restrizione EcoRI e SalI che vengono utilizzati per la clonazione direzionale dell'inserto. Se la sequenza contiene questi siti, diversi enzimi di restrizione per la clonazione devono essere scelti. Lievito trasformazione è un metodo centrale durante questo protocollo. efficienza di trasfezione dipende dalla competenza delle cellule di lievito, la vitalità, lo stato di crescita, e la qualità del REAG trasfezioneent 53, 54. Per il protocollo proposto, si consiglia vivamente di utilizzare il lievito dai piatti freschi, non più di due settimane (conservate a 4 ° C) durante l'esecuzione delle trasformazioni. Spesso, la crescita del lievito trasformato è in ritardo quando colture liquide selettivi vengono inoculate con le colonie da vecchie piastre di agar. E 'anche utile usare una coltura starter liquido come inoculo per gli esperimenti reali e non utilizzare il lievito direttamente dalla piastra. Bassa efficienza quando transfecting la preda nel lievito esca esprimono può portare alla sottorappresentazione di alcune proteine ​​preda (potenziali Interactiani) e può quindi inclinare l'intero schermo. In questo protocollo, una efficienza di trasfezione di lievito di ~ 150.000 ufc / mg di DNA trasfettato in Y2H ha funzionato bene.

Conoscere i difetti e gli svantaggi della tecnica Y2H e interpretare i risultati in modo critico e adeguato è indispensabile per disegnare la correct conclusioni. saggi Y2H ei derivati ​​sono stati utilizzati per molti anni e hanno subito molti miglioramenti e adattamenti in relazione alle differenti caratteristiche esca, la localizzazione subcellulare dell'interazione, i partner di legame attesi, e altri fattori che possono essere richiesti per l'interazione (vedi Y3H 55, 56, 57). Recentemente, sono stati sviluppati schermi Y2H basate su array che consentono l'analisi automatizzata, ad alta produttività di numerose esche contro milioni di prede 58. Il futuro più probabile sta nella automazione e high throughput approcci per questo test per consentire la delucidazione delle vie di segnalazione complessi e interactomi in diversi campi di ricerca.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, e Florian Senoner dal Centro Ricerche Laimburg e Mirelle Borges Dias Schnetzer da Dualsystems Biotech AG per il supporto tecnico e Julia Strobl per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è stato svolto come parte del progetto APPL2.0 ed è stato parzialmente finanziato dalla Provincia Autonoma di Bolzano / Bolzano, l'Italia e il Consorzio Mela Alto Adige.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB)ApplichemA6284per preparazione di DNA
Trisidrossimetilamminometano (Tris)ApplichemA2264per terreni e tampone
Cloruro di sodio (NaCl)ApplichemA2942per terreni e tampone
Acido etilendiamminotetraacetico Sale disodico (NaEDTA)ApplichemA2937per terreni e tampone
N-Lauroilsarcosina sale sodicoApplichemA7402per la preparazione del DNA
acetato di ammonio.Sigma-Aldrich (Fluka)9688per la preparazione del DNA
2-mercaptoetanoloApplichemA1108per la preparazione del DNA
Isopropanolo (2-Propanolo)ApplichemA3928per la preparazione del DNA
EtanoloSigma-Aldrich (Fluka)51976per la preparazione del DNA
RNAsiApplichemA2760per la preparazione
del DNACloroformio: Isoamyl 24:1ApplichemA1935per la preparazione del DNA
Correzione di bozze Polimerasi (es. iProof)Bio-Rad203433per PCR
EcoRIThermo ScientificER0271per la clonazione
SalIThermo ScientificER0641per la clonazione
Kit di purificazione del DNA basato su colonna (es. QIAquick)Qiagen28104per la clonazione
Kanamicina SolfatoApplichemA1493per la selezione microbiologica
3-Ammino-1,2,4-Triazolo (3-AT)Sigma-AldrichA8056per il saggio di autoattivazione
L-Arginina Monocloridrato ApplichemA3680per coltura di lieviti
L-Isoleucina ApplichemA3642per coltura di lievito
L-lisina monoidratoApplichemA3448per coltura di lievito
L-Metionina ApplichemA3897per coltura di lievito
L-FenilalaninaApplichemA3464per coltura di lievito
L-treonina ApplichemA3946per coltura di lievito
L-Tirosina ApplichemA3401per coltura di lievito
L-UracileApplichemA0667per coltura di lievito
L-valina ApplichemA3406per coltura di lievito
L-adenina emisulfato sale ApplichemA1596per coltura di lieviti
0,22 µ m Filtro poroSartorius16541per filtrazione sterile
L-istidina monocloridratoApplichemA3719per coltura di lievito
L-Leucina ApplichemA3496per coltura di lievito
L-Triptofano ApplichemA3410per coltura di lievito
Base di azoto per lieviti Sigma-Aldrich51483per coltura di lievito
D-glucosio monoidratoApplichemA1349per coltura di lieviti
AgarFisher ScientificBP2641-1per colture di lieviti e batteri
PeptoneApplichemA2208per coltura di lieviti
Polietilenglicole 4000 (PEG)ApplichemA1249per la trasformazione dei lieviti
Acetato di litio diidrato (LiOAc)ApplichemA3478per la trasformazione dei lieviti
DNA sperma di salmone ApplichemA2159per la trasformazione del lievito
Anticorpo contro il tag Lex-A (es. regione di legame del DNA anti-LexA)Millipore06-719per Western blot
Plasmid Miniprep kit (es. GenElute Plasmid Miniprep Kit)Sigma-AldrichPLN350per la purificazione dei plasmidi da lieviti e batteri
Perle di vetro lavate con acidoSigma-AldrichG8772per la purificazione di plasmidi dal lievito
Ampicillina Sale sodicoApplichemA0839per la selezione microbiologica
Estratto di lievitoApplichemA1552per coltura di lieviti
Centrifuga concentratore sottovuoto (es. Concentratore 5301)EppendorfZ368245 (Sigma)per preparazione DNA
Vettore esca (es. pLexA-N)DualsystemsP01004per Y2H
Prey vector (es. pGAD-HA)DualsystemsP01004per Y2H
Control prey vector (es. pLexA-p53)DualsystemsP01004per Y2H
Control bait vector (es. pACT-largeT)DualsystemsP01004per Y2H
Elettrocompetente E. coli (es. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)InvitrogenC640003per la clonazione
Ceppo reporter di lievito (NMY51:MATahis3Δ 200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, es. NMY51)DualsystemsP01004per
film plastico di paraffina Y2H (es. Parafilm M)Sigma-AldrichP7793-1EAper coltura di lieviti e batteri
Sigillante permeabile ai gas (es.g. BREATHseal)Greiner676 051per coltura di lieviti
PCR Cycler (es. T100 Thermal Cycler)Bio-Rad1861096per PCR
quantitativa PCR Cycler (es.es. CFX96 Touch Real-Time Detection System)Bio-Rad1855195PCR quantitativa
(es. Centrifuga 5417 R)Eppendorf5417 Rattrezzatura
generale da laboratorioCentrifuga (es. Centrifuga 5804 R)Eppendorf5804 Rattrezzatura generale di laboratorio
Acqua priva di nucleasi (priva di DNAsi, RNAsi, proteasi)5Prime2500010per lavori di PCR e DNA
ScalpellSwann-Morton0301per la preparazione del DNA
Filtro sterile (0,22 &; m; Polietersulfone)VWR-International514-0073 (numero di catalogo europeo)per coltura di lieviti e batteri
Piastre di Petri Ø 90 mm Greiner Bio-One633180per lieviti e colture batteriche
piastre di Petri Ø 150 mm Greiner Bio-One639161per coltura di lievito
Fotometro (es. Biofotometro)Eppendorf550507804per coltura di lievito
Fotometro Cuvettedi marca759015per coltura di lievito
Bagno d'acqua (es. Bagno d'acqua Memmert WB7MemmertWB7per la trasformazione del lievito
Western Blot EquipmentBio-Raddiverseper la rilevazione
di proteine dNTP5Prime2201210per la clonazione
di palloni shaker (Erlenmeyer) (100 mL; 1.000 mL; 2.000 mL) e tappi in cotone traspirante (es. Duran Erlenmeyer a collo stretto)Sigma AldrichZ232793, Z232858, Z232866per colture di lieviti e batteri
Incubatore a scuotimento (es GFL 3031)GFL3031per coltura di lieviti e batteri
Legante per incubatoriKB 53 (E3.1)per coltura di lieviti e batteri
Fabbricatore di ghiaccio (es. Ice Maker IF 825)OmniwashIF 825attrezzature generali da laboratorio
0,2 mL, 1,5 mL e 2,0 mL Fiale di reazione (polipropilene)Eppendorf0030.124.332 (0,2 ml); 0030.123.328 (1,5 ml); 0030.123.344 (2,0 ml)attrezzature generali da laboratorio
Pipette e puntali per pipette monouso (diverse volumine: 10 - 1.000 &; L)Eppendorfdiverseattrezzature generali da laboratorio
SpandiconcimeSigma-AldrichSPR-L-S01per la coltura di lieviti e batteri
Agitatore a vortice (ad es. MS 3 Minishaker)IKA3617000attrezzatura generale da laboratorio
T4-LigasiThermo FisherEL0011per clonazione
Frigorifero (4 ° C) (es. Liebherr Medline FKEX 5000)Liebherr81.767.580.4attrezzature generali da laboratorio
Congelatore (-20 ° C) (es. Liebherr Comfort Professional G5216)LiebherrG5216attrezzatura generale da laboratorio
Cilindro graduato (es. Marca)Sigma AldrichZ327352; Z327417; Z327441   Attrezzature generali di laboratorio
Pipette sierologiche (es. Fisherbrand)Thermo FisherS55701per la coltura di lieviti e batteri
Pipettatore meccanico (es.es. Pipetboy acu 2)Integra-Biosciences155000attrezzature da laboratorio
generiche Cuvette per elettroporazione (1 mm)Molecular Bio Products5510-11per la trasformazione
dei batteriElectroporator (es. Eporator)Eppendorf4309000019per la trasformazione dei batteri
Sistema di imaging Gel e Blot (es. ChemiDoc MP System)Bio-Rad1708280attrezzature generali
da laboratorio Provette da centrifuga coniche (polipropilene) (50 mL)VWR-International 525-0403 (numero di catalogo europeo)generali
da laboratorio Provette da centrifuga coniche (polipropilene) (13 mL)BD Falcon352096apparecchiature generali da laboratorio
Ditiotreitolo (DTT; 1 M)Thermo ScientificP2325per legatura
adenosina trifosfato (ATP, ad es. Soluzione ATP (10 mM))Ambion AM8110G (distribuito da Thermo Scientific)per la legatura
Mix di dropout senza istidina, leucina, triptofano e adenina (DO, es. Integratori di terreni sintetici per drop-out di lievito)Sigma-AldrichY2021 Sigma per coltura di lieviti (miscela pronta)
di per microcentrifuga )apparecchiature

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