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Articolo metodologico

Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico

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DOI:

10.3791/55153

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24 gennaio 2017

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1Faculty of Pharmacy, University of Sydney

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la produzione di un anticorpo terapeutico in un sistema di espressione di mammifero. I metodi descritti includono la preparazione del DNA vettore, trasfezione stabile e libero adattamento di siero di una linea di cellule embrionali renali 293 umana, messa a punto di culture su larga scala e la purificazione mediante cromatografia di affinità.

Abstract

Garantire il successo della produzione di un anticorpo terapeutico inizia all'inizio del processo di sviluppo. La prima fase è l'espressione vettoriale dei geni anticorpali seguita dalla trasfezione stabile in una linea cellulare adatta. I cloni stabili vengono sottoposti a screening al fine di selezionare quei cloni con le caratteristiche di produzione e crescita desiderate. Si tratta di una fase fondamentale, anche se dispendiosa in termini di tempo. Questo protocollo considera la selezione del vettore e l'approvvigionamento di sequenze anticorpali per l'espressione di un anticorpo terapeutico. I metodi descrivono la preparazione del DNA vettore per la trasfezione stabile di una variante in sospensione della linea cellulare di rene embrionale umano 293 (HEK-293), utilizzando polietilenimmina (PEI). Le cellule vengono trasfettate come cellule aderenti in terreni contenenti siero per massimizzare l'efficienza della trasfezione e successivamente adattate a condizioni prive di siero. La produzione su larga scala, configurata come colture batch overgrow, viene utilizzata per produrre proteine anticorpali che vengono purificate mediante cromatografia di affinità utilizzando uno strumento automatizzato di cromatografia liquida proteica veloce (FPLC). Le rese di anticorpi prodotte con questo metodo possono fornire proteine sufficienti per iniziare la caratterizzazione iniziale dell'anticorpo. Ciò può includere lo sviluppo di saggi in vitro o la caratterizzazione fisico-chimica per aiutare nel lungo compito di screening clonale per i candidati principali. Questo metodo può essere trasferito allo sviluppo di un sistema di espressione per la produzione di anticorpi biosimilari.

Introduzione

Il successo di anticorpi terapeutici continua a guidare notevoli investimenti nello sviluppo di anticorpi come un'onda di terapie di nuova generazione ha inizio. Il mercato degli anticorpi dovrebbe essere rimodellato da frammenti di anticorpi 1, anticorpo-farmaco coniugati 2, anticorpi bispecifici 3 e anticorpi ingegnerizzati con proprietà favorevoli 4. Un'altra classe guadagnando interesse farmaceutico sono biosimilari. Gli anticorpi biosimilari sono 'molto simile' replicare i prodotti di un anticorpo terapeutico che ha già ricevuto l'approvazione normativa. Un biosimilare proposto deve essere comparabile con l'anticorpo creatore rispetto alla sua struttura, la funzione, la tossicità animale, la sicurezza e l'efficacia clinica, la farmacocinetica umani (PK), farmacodinamica (PD) e l'immunogenicità 5, 6.

L'approvazione RAtes di anticorpi biosimilari sono stati lenti a causa dei rigidi vincoli sulla qualità finale del prodotto. I processi di produzione esatte, come linee cellulari e condizioni di coltura specifici attraverso le fasi di lavorazione finali possono rimanere proprietaria. Inoltre, la produzione di anticorpi comporta intrinsecamente una certa variabilità che può aggiungere alla sfida di produrre un prodotto altamente simile. Una caratterizzazione fisico-chimiche e biofisica completa e il confronto è abbastanza difficile, ma una serie di studi che dimostrano le caratteristiche di anticorpi biosimilari stanno emergendo nella letteratura 7, 8, 9.

Generazione di un anticorpo terapeutico inizia con la trasfezione di cellule ospiti di mammifero con un vettore che trasporta i geni per il rispettivo anticorpo. disegno vettoriale, condizioni della linea e di coltura cellulare sono considerazioni chiave per la creazione di exsistema di pressione.

Le sequenze di DNA di anticorpi possono essere di provenienza da Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) o pubblicazioni di ricerca, tra cui brevetti. Ad esempio, la sequenza di trastuzumab è disponibile attraverso Drug Bank (DB ID: DB00072). La sequenza aminoacidica delle regioni variabili può subire Gene design e di ottimizzazione per la sintesi nella specie ospite desiderati. E 'importante per un anticorpo biosimilare che nessuna modifica è finalizzata sequenza amminoacidica. Una volta sintetizzato, geni anticorpali possono essere subclonate nel caso vettore di scelta.

anticorpi IgG umane sono costituite da due catene pesanti identiche e due catene leggere identici. Espressione strettamente regolata entrambe le catene è essenziale per la produzione ottimale di proteine IgG eterologa in cellule di mammifero 10. Intra nonché legami disolfuro inter-catena deve essere formato e una serie di modificazioni post-traduzionali devono essere introdotti durante biosintesi delle proteine. Un certo numero di vettori sono disponibili che sono stati progettati specificamente per esprimere geni anticorpali (fare riferimento alla tabella dei materiali). Questi vettori specifici anticorpi di solito esprimono le regioni costanti per catene sia pesanti e leggere in modo che solo le regioni variabili di ogni catena richiedono clonazione.

Trasfezione delle cellule con due costrutti indipendenti (co-trasfezione) è l'approccio più comune per la distribuzione di geni pesanti e leggeri a catena-codifica. Cioè, ogni gene è azionato da un proprio promotore e trascritto come catene anticorpali separati prima di essere assemblato nel reticolo endoplasmatico. D'altra parte, vettori multi-cistronic hanno elementi interni voce sito ribosoma (IRES) incorporate che consentono l'espressione di geni multipli come un singolo mRNA trascritto con traduzione consentita dalle regioni interne del mRNA 11. In questo esempio, i geni pesanti e leggere catena codificanti sono accoppiati in un arrangement per ottenere co-espressione di entrambe le catene di anticorpi 10, 12.

Mentre le cellule trasfettate producono proteine ​​sufficiente per eseguire un numero limitato di esperimenti, linee cellulari stabilmente transfettate che sono sottoposti a selezione per l'integrazione del genoma possono fornire rese più elevate. Importi proteico superiore consentono sviluppo di saggi relativi alla caratterizzazione in vitro e possono fornire un'indicazione della qualità anticorpi in considerazione per applicazioni a valle come linea cellulare clonale e selezione dei candidati piombo.

L'obiettivo di questo articolo è descrivere l'espressione stabile e purificazione di un anticorpo terapeutico prodotta in un sistema di espressione di mammifero. Infatti, questo metodo può essere applicato per l'espressione di un anticorpo biosimilare. Il metodo può essere utilizzato per la caratterizzazione iniziale di anticorpi prima di procedere alla critica, seppur ste tempops di identificare un clone auspicabile per ingrandire fabbricazione scala. Inoltre, questo metodo può essere usato per esprimere altre proteine ​​e non solo anticorpi.

Il seguente protocollo dettagliato descrive l'espressione di terapeutica trastuzumab anticorpi. Questa consiste nella preparazione del DNA vettoriale seguita da trasfezione stabile in cellule HEK-293 e purificazione di proteine ​​anticorpi con un metodo cromatografico automatizzato.

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Protocollo

Nota: un adeguato mammiferi vettore di espressione deve essere utilizzato per questo protocollo. Qui, viene utilizzato un singolo costrutto contenente due cassette di espressione (cioè espressione catena pesante e leggera è guidato dai promotori separate). Trastuzumab catene pesanti e leggere sono stati precedentemente clonati nel vettore. Questo vettore è stato un regalo da Andrew Beavil, ottenuta attraverso un repository plasmide profitto non-per-13.

1. Il recupero e scale-up di vettore DNA

NOTA: Vector DNA è stato ricevuto come una cultura pugnalata soft agar in Escherichia coli XL-1 Blue ceppo; vettore trasporta resistenza Hygromycin.

  1. Inserire una pugnalata inoculo sterile o ad anello in agar morbido della cultura coltellata poi si depositano su una Luria Bertani (LB) piastra di agar preparata con 75 mg / ml Hygromycin per colonie isolate. Incubare la piastra a 37 ° C per 18-24 ore.
  2. Inoculare una singola colonia in 5 ml di brodo Terrific (TB) contenente 75 mg / ml Hygromycin. Incubate la cultura a 37 ° C per 18-24 ore con 225 giri al minuto agitazione.
  3. Utilizzare la cultura durante la notte per preparare uno stock di glicerolo di DNA vettore mescolando delicatamente 800 ml di cultura con 200 ml 80% glicerolo in una provetta Microbank ™ e congelamento a -80 ° C.
    1. Aggiungere 100 ml di coltura durante la notte a 100 ml TB contenente 75 ug / ml in un pallone Hygromycin agitatore confuso (cioè 1 / 1.000 diluizione). Incubare la coltura a 37 ° C per 18-24 ore con 225 giri al minuto agitazione.
  4. Dopo cultura durante la notte, estrarre e purificare il DNA in base alle istruzioni del kit di preparazione midi / maxi con la seguente eccezione del fabbricante; durante la fase, eluire o risospendere finale del DNA con acqua (pH 7,0-8,5).
  5. Controllare la concentrazione e la purezza di DNA da letture di assorbanza a 260 e 280 nm quindi memorizzare DNA a -20 ° C.
    NOTA: opzionale (altamente consigliato): la sequenza DNA utilizzando primer specifici vettore per confermare l'identità.

2. Trasfezione stabile di cellule HEK-293

  1. Crescere e mantenere HEK-293 cellule (cellule sospensioni) secondo protocolli standard in mezzi privi di siero integrato con 0,1% di tensioattivi non ionici in beute. Mantenere a 2 x 10 5 cellule / ml e sottocultura ogni quarto giorno. Cellule di coltura a 37 ° C con 5% di CO 2 e 120 di rotazione rpm.
    NOTA: Le cellule avrebbero dovuto essere in coltura per non meno di 4 giorni e non più di 4 settimane prima della trasfezione. HEK-293 cellule cresciute in monostrati in mezzi di siero contenenti possono anche essere utilizzati per questa procedura.
  2. Il giorno prima della trasfezione, seme cellule HEK-293 a 3 x 10 5 cellule / ml in pozzetti di una piastra 12 pozzetti in 2 ml di Dulbecco Modified Eagle media (DMEM) supplementato con siero fetale bovino inattivato al calore 10% ( FBS). Il giorno della trasfezione, controllare che le cellule hanno raggiunto 80-90% di confluenza
  3. Diluire il DNA e polietilenimmina (PEI) separatamente nel supporto di transfezione poi mescolare insieme.
    1. Diluire 1,25 mg vettore DNA per bene (15 mg per 12 pozzi) in 300 ml mezzi trasfezione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    2. Diluire 2,5 ml di 1 mg / ml soluzione PEI (30 microlitri per 12 pozzi, cioè rapporto 1: 2 del DNA a PEI) in 300 ml mezzi trasfezione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    3. Aggiungere DNA diluito al diluito PEI, mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
  4. Aggiungere 50 ml di DNA / PEI miscela goccia a goccia a ciascun pozzetto della piastra. Oscillare delicatamente la piastra per distribuire la miscela di trasfezione quindi posizionare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore.
  5. Aggiungere 50 ug / ml Hygromycin B per pozzetto e riportare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 per 10 giorni.
    NOTA: Giorno 10, le cellule non-trasfettate saranno morte e distaccata dalla superficie della piastra, mentre le cellule stabilmente transfettate saranno vitale e attaccato alla piastra.
  6. Sostituire i supporti in pozzi con1/4 media liberi-siero volume e 3/4 del volume DMEM supplementato con 10% FBS (cioè 0,5 ml mezzi privi di siero + 1,5 ml DMEM = 7,5% concentrazione sierica finale) e incubare per 4 giorni.
  7. Sostituire il supporto in pozzi con 1/2 mezzi privi di siero volume e 1/2 del volume DMEM supplementato con 10% FBS (cioè mezzi privi di siero 1 ml + 1 ml di DMEM = concentrazione sierica finale 5%) e incubare per 4 giorni.
  8. Sostituire il supporto in pozzi con 3/4 mezzi privi di siero volume e 1/4 del volume DMEM supplementato con 10% FBS (cioè 1,5 ml mezzi privi di siero + 0,5 ml DMEM = concentrazione sierica di finale 2,5%) e incubare per 4 giorni.
  9. Sostituire il supporto in pozzi con 2 ml di mezzi privi di siero integrato con 0,1% di tensioattivi non ionici (cioè concentrazione sierica di finale 0%) e incubare per 4 giorni.
    NOTA: Mantenere 50 mg / igromicina B pressione selettiva ml su cellule durante l'adattamento privo di siero. Le cellule adattate ai mezzi privi di siero si staccano dalla superficie dei pozzi e possono raggruppare iSospensione n. Fare riferimento al punto 2.1 per condizioni di coltura con il supplemento aggiuntivo di 50 mg / ml igromicina B.
  10. Usando una pipetta, delicatamente mescolare le colture in sospensione nelle cellule piastra e piscina da 12 pozzetti in un tubo separato.
    1. Utilizzando un emocitometro, enumerare cellule pool e sementi in 30 ml mezzi privo di siero in una beuta a 2 x 10 5 cellule / ml. Cellule di coltura a 37 ° C con 5% di CO 2 e 120 di rotazione rpm. Subculture ed espandere ogni quarto giorno.
  11. Continuare a espandere dimensioni coltura a densità cellulare richiesto per ottenere 10 fiale a 1 x 10 7 cellule / fiale per la crioconservazione in azoto liquido. Congelare le cellule in mezzi privi di siero contenente il 10% dimetilsolfossido (DMSO).
    NOTA: condizionata supporti contenenti anticorpi possono essere raccolte ad ogni sottocultura di confermare la produzione di proteine ​​o utilizzati per ottimizzare le condizioni di purificazione. Per raccogliere i media condizionata e mantenere le cellule di sottocultura, centrifugare la coltura a300 xg per 5 minuti poi filtrare-sterilizzare surnatante attraverso un filtro di 0,22 micron. surnatante filtrato può essere conservato a 4 ° C per 1-2 settimane o -20 ° C per una conservazione a lungo termine.

3. Large Scale produzione di anticorpi da lotto Erbaiuto Cultura

NOTA: La produzione di anticorpi può essere seguita su dal punto 2.11 dove le cellule esistenti vengono espanse per la densità cellulare desiderato in base al volume della cultura overgrow batch per essere messa a punto. Altrimenti, le cellule che sono stati scongelati da crioconservazione iniziano in questa fase, una volta espanso ad una densità cellulare appropriata e volume. Vari supplementi di coltura possono essere utilizzate per ottimizzare la produzione di anticorpi; l'uso di triptone per aumentare la resa degli anticorpi è dimostrato in questo protocollo.

  1. Cellule Seed a 2 x 10 5 cellule / ml in 100 ml di mezzi senza siero in due beute (per confrontare i rendimenti di anticorpi provenienti da culture non-integrato e nutrienti integrazioni). Culture a 37 ° C, 5% CO 2 e 120 giri al minuto.
  2. Dopo 24 ore, aggiungere triptone ad una concentrazione finale di 0,5% alla cultura nutrienti integrato. Pareggiare il volume della cultura non-integrato con mezzi senza siero.
  3. Dal giorno 8, eseguire la conta delle cellule delle culture quotidiane utilizzando un emocitometro per monitorare la vitalità cellulare. Raccogliere le sovranatanti una volta la vitalità cellulare è inferiore al 80%.
    1. Harvest surnatante mediante centrifugazione delle colture a 3.000 xg per 15 min quindi filtrata-sterilizzare il surnatante (contenente anticorpi) attraverso un filtro di 0,22 micron. Conservare il surnatante a 4 ° C (a breve termine) o congelare a -20 ° C (a lungo termine).

4. Anticorpo Purificazione per affinità e cromatografia utilizzo di un cromatografia liquida automatica veloce Protein (FPLC) Sistema

NOTA: La seguente procedura può essere generalmente applicata a sistemi più automatizzati. La purificazione può essere eseguita a temperatura ambiente oa 4 ° C (se il sistema FPLC è conservato in una camera fredda).Una serie di test di scouting può essere eseguita per individuare le condizioni ottimali di depurazione tra cui matrice colonna appropriata, tampone, tampone di eluizione e pH vincolante per garantire il massimo recupero di anticorpo purificato dai media condizionati (fare riferimento alla sezione Risultati). Le condizioni ottimali dipendono anticorpi o proteine ​​di essere purificati. Purificazioni sono stati eseguiti su un sistema FPLC automatizzato. Purificazioni state eseguite a temperatura ambiente usando una proteina 5 ml Una colonna.

  1. Preparare i seguenti tamponi con acqua ultrapura e regolare il pH consigliato poi filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron.
    1. Preparare 1 L di tampone fosfato salino (PBS) a pH 7,4 (tampone di legame) mescolando il seguente: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na 2 HPO 4 e 0,001 M KH 2 PO 4. Aggiustare il pH se necessario prima di filtrare il buffer.
    2. Preparare 500 ml di 0,1 M glicina-HCl pH 2.7 (tampone di eluizione). Regolare il pH prima di filtrare il buffER.
    3. Preparare 50 ml di 1 M Tris pH (tampone di neutralizzazione) 9.0.
  2. Assicurarsi che tutti i collegamenti di alimentazione e di comunicazione del sistema con il computer sono fatti. I dispositivi devono essere visibili nel modulo 'di controllo del sistema' software. Assicurarsi cella UV è impostata a 280 nm di lunghezza d'onda. Opzionale: Calibrare pH-metro se collegato e da utilizzare.
  3. Immergere tubi di ingresso di A, B e pompa di campionamento in acqua ultrapura per lavare il sistema. Spurgare le pompe con una siringa se c'è aria nella tubazione o sospetto di aria nel sistema. Lavare il sistema con acqua mediante operazione manuale tramite il controllore di sistema o tramite un metodo automatizzato. Si osservi che la pressione, conducibilità, tracciamento UV280 e pH rimane costante e che il limite di pressione per la colonna non sia superato secondo le specifiche del produttore.
    NOTA: Le anomalie possono indicare l'aria o il blocco del sistema che dovrebbe essere affrontato prima di procedere.
  4. Nel modulo di controllo del sistema, avviare la portata a 1ml / min manualmente tramite pompa A sia carico (bypassando loop del campione) o iniezione (attraverso il campione loop) grado di iniziare a collegare la colonna. tubing sistema Disconnect all'ingresso posizione di colonna e rimuovere il tappo collegato all'ingresso colonna.
    1. Permettere all'acqua di fluire dal tubo a gocce sistema superiore della colonna quindi fissare il tubo di sistema alla colonna. Avendo l'ingresso della colonna e raccordo di ingresso traboccante di gocce d'acqua garantisce un collegamento privo di bolle d'aria.
  5. Collegare l'uscita della colonna in uscita a valle e verificare tutti i raccordi siano ben fissati. Con la colonna ora collegata al sistema, non superare i limiti di massima pressione e portata come descritto nelle specifiche di colonna.
  6. Lavare colonna con 5 volumi di colonna (CV) di acqua. Se necessario, continuare a lavare colonna fino a UV280 tracciato si è stabilizzata.
  7. Immergere tubi di ingresso di A in Binding Buffer, B in tampone di eluizione e pompa di campionamento in Binding Buffer to riequilibrare il sistema nei buffer corrette. Riempire i tubi di ingresso con il tampone usando PumpWash per il funzionamento manuale.
  8. Nel modulo del software 'Method Editor', utilizzare il metodo guidata per impostare un metodo di cromatografia di affinità per la colonna che è destinato ad essere utilizzato.
    NOTA: e sistemi automatizzati di FPLC sono dotati di metodi di pre-riempita con le impostazioni consigliate (cioè della portata e della pressione limite) ed eseguire operazioni in base alla colonna (produttore, matrice e dimensione) selezionati per la purificazione.
    1. Utilizzare i seguenti passi di esecuzione per proteina A cromatografia di affinità:
      1. Equilibrare sistema con 5 CV di tampone di legame e raccogliere eluato nel contenitore dei rifiuti.
      2. campione di carico nella colonna (volume da caricare viene specificato manualmente nel metodo) e raccogliere eluato in un contenitore separato.
      3. Sistema di lavaggio con 5 CV di tampone Binding raccogli eluato in un contenitore separato.
      4. colonna eluire con 5 CV isocratic frazionamento con tampone di eluizione e raccogliere campioni anticorpo purificato come frazioni di raccoglitore di frazioni.
      5. Equilibrare sistema con 5 CV di tampone di legame e raccogliere eluato nel contenitore dei rifiuti.
  9. Una volta che il metodo è stato impostato, specificare il volume di mezzi condizionati da applicare alla colonna e salvare il metodo.
    NOTA: Il volume specificato nel metodo dovrebbe essere 5-10 ml inferiore al volume reale per evitare l'introduzione di aria durante la corsa del campione. Il volume specificato utilizzato in questo protocollo è 90-120 ml.
  10. Immergere il tubo della pompa campione nel recipiente contenente il supporto condizionata.
  11. Preparare un contenitore separato per raccogliere eluato campione attraverso il tubo di uscita specificato.
    NOTA: E 'importante raccogliere l'eluato, nel caso si verifichi un errore durante la corsa o la capacità di legame della colonna viene superata richiede l'eluato per essere riapplicata alla colonna o la purificazione repeated.
  12. Preparare tubi di raccolta nel raccoglitore di frazioni. Aggiungere 100 ml di tampone di neutralizzazione per 1 ml volume della frazione. Il sistema FPLC si eluire automaticamente le frazioni nei tubi di raccolta.
  13. Nel modulo 'Sistema di Controllo' del software, aprire il metodo da eseguire.
    NOTA: Il metodo run è iniziata in una serie di pagine che comprende il controllo delle variabili del metodo, impostazione raccoglitore di frazioni e che definiscono il nome del file risultato e posizione di memorizzazione.
  14. Fare clic su Start per avviare la corsa. La corsa può essere monitorata nel modulo 'Sistema di Controllo'.
  15. Al completamento della corsa di purificazione, controlla il cromatogramma risultante nel modulo 'Evaluation' nel software di sistema.
  16. Unire tutte le frazioni contenenti proteine ​​in un tubo, lo scambio buffer separato e concentrarsi in PBS utilizzando un dispositivo di filtro centrifugo con 30 kDa peso molecolare tagliare. Eseguire le fasi di centrifugazione secondo il fornitore diistruzioni.
  17. Misurare la concentrazione di anticorpi con test di acido bicinconinico (BCA) secondo le istruzioni del produttore.
  18. Se un'altra corsa di purificazione deve essere eseguito, il primo il tubo della pompa di campionamento a tampone di legame e ripetere i passaggi 4,9-4,14.
  19. Al completamento di piste di depurazione, immergere tubi di ingresso di A, B e pompa di campionamento in acqua ultrapura e lavare il sistema e la colonna interpretato nel passaggio 3.
  20. Immergere A, B e tubo della pompa campione in etanolo e ripetere la procedura di lavaggio 20% per la memorizzazione del sistema e colonna.
  21. Scollegare la colonna dalla presa a valle e sostituire colonna tappo, quindi scollegare colonna in ingresso e sostituire tappo, ricollegare tubo al sistema. Conservare la colonna a 4 ° C.

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Risultati

Produzione stabile di trastuzumab per trasfettate cellule HEK-293 è stata confermata mediante interferometria bio-layer (BLI), come illustrato nella figura 1. Una curva standard IgG è stato generato misurando il tasso di legame tra un anticorpo standard di IgG e proteina A biosensore (Figura 1A). Il campione supernatante grezzo viene misurata analogamente, quindi la sua concentrazione interpolati dalla curva standard (Figura 1B). La conc...

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Discussione

Dettagli Questo protocollo transfezione, espressione stabile e la purificazione di un anticorpo terapeutico in cellule HEK-293. espressione stabile di geni anticorpali è il primo passo nel generare una linea cellulare anticorpo-producendo per lo sviluppo e la fabbricazione di un anticorpo terapeutico. Mentre ovariche di criceto cinese (CHO) cellule rimangono la piattaforma espressione di scelta per le proteine ​​terapeutiche, la linea di cellule HEK-293 sta guadagnando importanza con la consapevolezza che le proteine ​​...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

La ricerca è stata supportata dall'Università di Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ è stato un dono di Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). Ringraziamo Tihomir S. Dodev per le utili discussioni riguardanti pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Serie di vettori pFUSEInvivoGenN/AGeni di anticorpi pesanti e leggeri espressi in vettori separati che richiedono la co-trasfezione.
serie vettoriale mAbXpressACYTE Biotech Pty Ltd.Geni anticorpali pesanti e leggeri espressi in vettori separati che richiedono la co-trasfezione. Fare riferimento a: Jones, M. L. et al. Un metodo per la riformattazione rapida e indipendente dalla legatura di anticorpi monoclonali ricombinanti. J Metodi immunol. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
Vettore pVITRO1N/AN/A Igeni degli anticorpi pesanti e leggeri sono guidati ciascuno da un promotore separato in un singolo vettore. Fare riferimento a: Dodev, T. S. et al. Un kit di strumenti per la clonazione rapida e l'espressione di anticorpi ricombinanti. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
Serie di vettori GSLonzaVettore multi-cistronico con geni anticorpali pesanti e leggeri co-espressi e tradotti come singolo trascritto.
Serie di vettori multi-cistronici 1N/AN/A Vettoremulti-cistronico con geni anticorpali pesanti e leggeri co-espressi e tradotti come singolo trascritto. Fare riferimento a: Li, J. et al. Uno studio comparativo di diversi disegni di vettori per l'espressione nei mammiferi di anticorpi IgG ricombinanti. J Metodi immunol. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Serie di vettori multi-cistronici 2N/AN/A Vettoremulti-cistronico con geni anticorpali pesanti e leggeri co-espressi e tradotti come singolo trascritto. Fare riferimento a: Ho, S. C. et al. Vettori tricistronici mediati da IRES per migliorare la generazione di linee cellulari CHO ad alto contenuto di anticorpi monoclonali. J Biotecnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κAddgene61883Vettore di espressione dei mammiferi contenente geni anticorpali trastuzumab con gene di resistenza all'igromicina; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ è stato un dono di Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro AgarJomar Life Researchfas-hg-sUtilizzato per preparare agar LB a basso contenuto di sale contenente 75 µ g/ml di igromicina.
Fast-Media Hygro TBJomar Life Researchfas-hg-lUtilizzato per preparare brodo TB a basso contenuto di sale contenente 75 µ g/ml di igromicina.
Glicerolo, BioXtra, ≥ 99%Sigma-AldrichG6279Preparare all'80% con acqua e autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi KitAstral ScientificG221020Plasmid Maxi Prep; eluire o risospendere il DNA in acqua (pH 7,0-8,5).
Linea cellulare FreeStyle 293-F CellsLife TechnologiesR790-07HEK-293 adattata alla coltura in sospensione in terreni privi di siero.
FreeStyle 293 Expression MediumLife Technologies12338-018Terreni privi di siero appositamente formulati per il mantenimento della linea cellulare 293-F e un'elevata espressione proteica.
Kolliphor P188Sigma-AldrichK4894Tensioattivo non ionico; pluronico F-68; preparare al 10% in acqua e filtrare-sterilizzare utilizzando 0,22 μ m filtro. Conservare a 4 °C.
DMEM, glicemia altaLife Technologies11995-065
Siero bovino fetale inattivato termicamenteLife Technologies10082-147
Polietilenimmina, lineare, MW 25.000 Poliscienze, Inc.23966Preparare a 1 mg/ml in acqua. Regolare a pH 7,0 con 1 M di HCl (la soluzione diventa limpida) e sterilizzare con filtro a 0,22 μ m filtro. Conservare a -80 C fino all'uso.
OptiPro SFMLife Technologies12309-050Terreno di comunicazione formulato per trasfezione senza siero
Soluzione di igromicina BJomar Life Researchant-hg-1
Dimetilsolfossido (DMSO)Thermo Fisher ScientificAJA2225
Triptone (peptone di caseina)Thermo Fisher ScientificLP0042BPreparare al 20% in PBS e sterilizzare con filtro utilizzando 0,22 μ m filtro. Negozio a 4 °C. 
Compresse di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4, 100 mlAstral Scientific09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 colonna da 5 mlSigma-AldrichGE17-0403-01
AKTApurifier 100GE Healthcare28406266Sistema FPLC automatizzato, che può includere una pompa di campionamento P-960 e un collettore di frazioni Frac-920.
Glicina-HClSigma-AldrichG2879
Acido citrico, monoidratoAstral ScientificBIOC2123
Citrato di sodio, sale trisodico diidratoAstral ScientificBIOCB0035
1 M Soluzione di Tris-HCl pH 9.0Astral ScientificBIOSD8146
Filtri Ultra Centrifughi Amicon (30 MWCO)Merck MilliporeUFC803008/UFC903008Utilizzato per tamponare, scambiare e concentrare proteine purificate.
Kit per il dosaggio dell'acido bicinconninico (BCA) PierceThermo Fisher Scientific23227
Sistema BLItzforté BIO45-5000Strumento utilizzato per misure di interferometria a biostrato (BLI).
Biosensori di proteina Aforté BIO18-5010
Acrilammide/Bisacrilammide (37,5:1), soluzione al 40%Astral Scientific786-502
Persolfato di ammonio (APS)Astral ScientificAM0486
TEMEDAstral ScientificAM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250Astral Scientific786-498
Precision Plus Proteina a doppio colore Bio-Radstandard 1610374

Riferimenti

  1. Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
  2. Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
  3. Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
  4. Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
  5. Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).
  6. European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).
  7. Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235(2015).
  8. Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
  9. Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
  10. Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
  11. Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
  12. Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
  13. Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885(2014).
  14. Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
  15. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96(2008).
  16. Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
  17. Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
  18. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  19. Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
  20. Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
  21. Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
  22. Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
  23. Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
  24. Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).

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