Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Sommario

Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.

Abstract

protocolli isolotto-isolamento di perfusione a base di grandi dimensioni pancreas dei mammiferi sono ben stabiliti. Tali protocolli sono facilmente effettuate in molti laboratori causa delle grandi dimensioni del dotto pancreatico che permette iniettabile collagenasi pronta e successiva perfusione tissutale. Al contrario, isolamento delle isole dal pancreas piccolo, come quello dei topi neonatali, è impegnativo, perché la perfusione non è facilmente realizzabile nel piccolo pancreas. Qui si descrive una semplice procedura dettagliata che recupera un numero considerevole di isolotti da topi appena nati con assistenza visiva. Appena sezionato intero pancreas sono stati digeriti con 0,5 mg / ml di collagenasi IV disciolto in soluzione salina bilanciata Hanks '(HBSS) a 37 ° C, in tubi da microcentrifuga. I tubi sono stati sfruttato regolarmente per aiutare la dispersione dei tessuti. Quando la maggior parte del tessuto è stata dispersa per piccoli gruppi circa 1 mm lisati sono stati lavati tre a quattro volte con mezzo di coltura con siero fetale bovino 10% (FBS). cluster Islet,privo di tessuti acinar riconoscibili, possono poi essere recuperati sotto dissezione stereoscope. Questo metodo recupera 20 - 80 piccole e grandi dimensioni isolotti per pancreas di topo appena nato. Questi isolotti sono adatti per saggi a valle più immaginabili, tra cui la secrezione di insulina, l'espressione genica, e la cultura. Un esempio di saggio secrezione di insulina è presentato per convalidare il processo di isolamento. Il background genetico e il grado di digestione sono i maggiori fattori che determinano il rendimento. soluzione di collagenasi Appena fatto con alta attività è preferito, in quanto aiuta in isolamento endocrino-esocrina. La presenza di cationi [calcio (Ca ²⁺⁾ e magnesio (Mg ^2+)] in tutte le soluzioni e siero bovino fetale al lavaggio / sono necessari per una buona resa di isolotti con integrità supporto corretto prelievo. Un ambito dissezione con un buon contrasto e l'ingrandimento aiuterà anche.

Introduzione

L'isolamento delle isole pancreatiche pure è essenziale per il dosaggio della secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) delle cellule beta e per il trapianto di isole da donatori cadaverici ^1-3. È inoltre necessario stabilire l'espressione genica endocrina nelle cellule insulari ^{4, 5}. A tal fine, sono stati stabiliti protocolli dettagliati per consentire l'isolamento delle isole pancreatiche da grandi pancreate (⁶ e riferimenti ivi contenuti). Questi metodi si basano sulla perfusione enzimatica per dissociare l'acinare dai tessuti insulari, insieme alla separazione in gradiente e al picking manuale. Pertanto, l'isolamento delle isole dal grande pancreas può essere eseguito facilmente nella maggior parte dei laboratori. D'altra parte, non esiste un protocollo dettagliato passo dopo passo per consentire l'isolamento delle isole dalla pancreata che sono troppo piccole per essere perfuse.

Studiare l'espressione genica e la funzione delle isole neonatali è importante. Le isole neonate hanno proprietà diverse da quelle degli adulti in termini di secrezione di insulina e capacità di proliferazione ^{7, 8}. Tuttavia, isolare le isole dagli animali appena nati, in particolare dai topi, è difficile a causa delle piccole dimensioni del pancreas appena nato. La dimensione impedisce il consueto processo di perfusione quando la collagenasi viene iniettata attraverso il dotto pancreatico. In effetti, diversi articoli hanno presentato studi in questo senso, con procedure di isolamento assistite da enzimi o non enzimi ^{7, 9, 10}. Tuttavia, manca una descrizione dettagliata del processo di isolamento delle isole con l'ausilio visivo ^{7, 9}, il che rende difficile per la maggior parte dei ricercatori eseguire studi simili.

Abbiamo esplorato diverse condizioni che producono isole di alta qualità da topi neonatali. Qui presentiamo un protocollo che dovrebbe aiutare i ricercatori ad apprendere i dettagli chiave nel processo di isolamento delle isole. Questo protocollo è applicabile al pancreas di topo fino a due settimane di età, dopodiché è possibile eseguire la perfusione per l'isolamento di routine delle isole avarie. Le isole possono essere utilizzate direttamente per la secrezione di insulina e per i saggi di espressione genica.

Protocollo

l'utilizzo di animali segue le procedure di cui al protocollo M / 11/181 approvato dalla Vanderbilt Institutional Animal Care e del Comitato Usa per Gu. topi CD1 o CBA / BL6 sono stati acquistati da fornitori commerciali e attraversato nella struttura animale Vanderbilt per ottenere topi neonatali.

1. Preparazione di topi, soluzioni di riserva, e attrezzature

1. Per la croce del mouse: impostare una croce del mouse e registrare le date di tamponamento per aiutare la pianificazione sperimentale. topi CD1 di solito partoriscono intorno al giorno 19 dopo l'accoppiamento. Utilizzare CD1 o CBA / BL6 croci per ottenere CD1 o CBA / BL6 neonati, rispettivamente. Incrociati tra le due linee utilizzano femmine e maschi CD1 CBA / BL6.
2. Per la collagenasi magazzino: pesare 200 mg di collagenasi di tipo IV con un saldo di alta precisione. Trasferire in un tubo da 50 ml centrifuga. Sciogliere in 40 mL HBSS con Ca ²⁺ / Mg ²⁺ (1,26 e 0,5 mm rispettivamente) per fare un / magazzino soluzione 5 mg ml.
   1. Consentire a collagenasisciogliere per ~ 30 minuti agitando delicatamente. Aliquotare e conservare la soluzione congelata nel -20 ° C come magazzino, che rimane attivo per almeno un anno.
3. Autoclave per la sterilizzazione diverse paia di pinzette, forbici, e suggerimenti P20 per la dissezione e isolotto raccolta.
4. Per il glucosio magazzino 1 M: pesare 9 g di glucosio in un tubo da 50 ml centrifuga, aggiungere 50 ml di RPMI 1640 media per sciogliere il glucosio. Tenere a 4 ° C fino al momento dell'uso, ma non più di 6 mesi.

2. Soluzioni di lavoro

NOTA: Il giorno di isolamento delle isole, preparare i seguenti reagenti.

1. Per la soluzione IV di lavoro tipo collagenasi: disgelo e diluire collagenasi magazzino dal ghiaccio. Dispensare 0,15 mL magazzino in ciascuna 1,7 ml provetta per microcentrifuga. Aggiungere 1,35 ml HBSS con Ca ²⁺ / Mg ^2+. Invertire la provetta per 5 volte. Lasciare in ghiaccio per 15 min.
   1. Girano ad alta velocità per 3 minuti in una microcentrifuga. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Lasciare in ghiaccio fino al momento dell'uso. Eliminare il tubo con residui insolubili.
2. Per un completo RPMI 1640 supporti: aggiungere 2,5 ml 1 M di glucosio, 50 mL di calore inattivato FBS, e 5 ml 100x Pen-strep magazzino in 500 ml RPMI 1640 mezzi. Lasciare in ghiaccio fino al momento dell'uso.

3. Isolamento e Pancreas Digestione

1. Euthanize neonati con isoflurano, seguita da decapitazione secondo protocolli approvati.
2. Posare il mouse con la pancia rivolta verso l'alto. Spruzzare con il 70% di etanolo per la sterilizzazione.
3. Sollevare la pelle pancia in su con una pinzetta e tagliare gli strati di pelle e muscoli longitudinalmente lungo la linea mediana, con un paio di forbici, dalla zona genitale alla gabbia toracica. Questo apre la cavità addominale per esporre tutti gli organi interni.
4. Trasferire tutti gli organi interni di un piatto 100 centimetri con un paio di pinzette. Individuare il pancreas, che è un organo sparso con una porzione dorsale che si aggrappa allo stomaco e la milza e una parte ventrale, che si aggrappa al duodeno ^11.
5. Aggiungere HBSS nel piatto di sommergere gli organi. In soluzione, tessuti pancreatici aggrappano più al duodeno, stomaco, milza. E 'facilmente riconoscibile in un ambito dissezione causa del suo colore bianco tipico. Utilizzare un paio di pinzette per sbucciare i tessuti pancreatici di distanza dal tessuto circostante e trasferimento in un nuovo piatto 60 millimetri con HBSS.
6. Tagliare ogni pancreas con una forbice in pezzi più piccoli di 5 mm di diametro qualsiasi dimensione. Trasferimento in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Fino a cinque pancreas (più giovane di P7) possono essere digeriti in un tubo. Per i topi P8-P16, utilizzare un tubo per il pancreas.
7. Aggiungere 0.5 - soluzione di lavoro 1 ml di collagenasi ad ogni provetta (0,2 ml per ogni pancreas P1-P7 Utilizzare 0,5 ml per ogni pancreas P8-P16.). Lasciare la provetta in un incubatore a 37 ° fino a 15 min. Invertire il tubo due volte ogni min.
8. Dopo circa 5 minuti, toccare il tubo per monitorare lo stato di digestione del tessuto pancreatico. Continuare il processo di digestione finché la maggior parte del pancreastessuto appare come gruppi di cellule frammentati, con diametro <2 mm. Il lisato apparirà nuvoloso, che è dovuto alla normale autolisi delle cellule acinose.

4. lisato di lavaggio

1. Spin il lisato a 500 g per 10 s in una microcentrifuga. Rimuovere lo strato di surnatante con una Pipetman P 1.000. Il surnatante deve apparire torbida, ma privo di gruppi di cellule. Non usare l'aspirazione, che può rapidamente aspirare via i frammenti di tessuto in basso a causa della presenza di alcuni DNA appiccicoso.
2. Aggiungere 1 ml di RPMI 1640 completo dei media. Toccare il tubo delicatamente per risospendere il lisato frammentato. Invertire su e giù per 10 volte. Ripetere il punto 4.1.
3. Ripetere il punto 4.2 altre due volte o fino a quando il surnatante appare evidente. Risospendere frammenti pancreatiche lavati in 1 ml completo RPMI 1640 multimediali.

5. L'isolamento Islet

NOTA: per un piccolo numero di pancreas, diretta a mano raccogliendo, come di seguito (5.1) può essere utilizzato per isolotto ISOLzione. Per grandi numeri di pancreas (> 6), il metodo descritto in 5.2 è preferito.

1. Diretto raccolta manuale:
   1. Trasferire lisato dal punto 4.3 a un piatto di 60 millimetri. Aggiungere 5 ml completi RPMI 1640 mezzi. Portare sotto un microscopio da dissezione.
   2. Impostare l'illuminazione in campo chiaro sul microscopio. Regolare l'intensità della luce a ~ 50% della potenza massima. In questa condizione, isolotti appaiono come un po 'grappoli di colore rosa, mentre le cellule acinari scuri cluster di forma irregolare (Figura 1A). Si raccomanda un ingrandimento di 50X ~ (combinando la potenza dell'obiettivo e il pezzo occhio) per offrire il miglior modo di isolotti visualizzazione e l'apertura punta della pipetta simultaneamente per il prelievo.
   3. Pick up isolotti con un puntale P20 evitando cluster acinar. Frazioni dispensare isolotti arricchita di un nuovo piatto 60 millimetri con RPMI completo supporto (Figura 1B).
   4. Ripetere il processo di raccolta manuale altre due volte. Lasciare isolotti pure in una nuova 60mm piatto con 4 ml di mezzi RPMI completi (Figura 1C).
2. centrifugazione in gradiente:
   1. Preparare una provetta da centrifuga 15 che viene precaricato con 2 mL polysucrose e sodio diatrizoato ad una densità di 1.077 g / mL. Lasciare la provetta in ghiaccio fino al momento dell'uso.
   2. Trasferire la sospensione dal punto 4.3 sulla parte superiore della soluzione diatrizoato polysucrose e sodio con una pipetta Pasteur. Non disturbare il livello inferiore. I tessuti di fino a 10 appena nato o 2 P17 pancreas possono essere caricati in ciascuna provetta 15 ml.
   3. Spin la provetta a ~ 600 xg in un rotore oscillante per 15 min a 4 ° C. Utilizzare le impostazioni dei freni-off.
   4. Dopo la centrifugazione, trasferire i mezzi di comunicazione e strati interfase (si noti che in condizioni di esercizio ottimali, le isole saranno situati nella interfase tra i media e la cultura polysucrose dopo la centrifugazione) in un nuovo tubo 15 ml. Aggiungere 10 ml di mezzi, Mescolare con cura.
   5. Spin giù la frazione isolotto arricchitaa 300 xg per 5 min. Rimuovere il supporto di lavaggio. Ripetere il lavaggio ancora una volta con i media RPMI completo. Pellet Risospendere in a 4 ml media, che contiene per lo più isolotti e condotti (Figura 1D).
   6. Selezionare manualmente le isole come descritto nel paragrafo 5.1.

6. GSIS saggi in isole isolate

1. Incubare le isolette dal punto 5.1.4 nei media RPMI completo per 2 ore in un C coltura tissutale incubatore a 37 °.
2. Usare una pipetta per rimuovere RPMI sotto un microscopio da dissezione. Aggiungere 3 mL di soluzione KRB con 2,8 mm di glucosio alla piastra ^3. Agitare 10 volte per lavare gli isolotti. Rimuovere soluzioni KRB.
   1. Ripetere il processo di lavaggio una volta. Incubare le isolette con 3 mL di soluzione KRB a 37 ° C per 1 ora in un incubatore.
3. Aliquotare 1 mL KRB in ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti. Pre-riscaldare il brodo KRB e la piastra a 37 ° C in un incubatore.
4. Lavare gli isolotti due volte con KRB preriscaldata come in 6.2. Transfer 10 isolette a ciascun pozzetto delle piastre preriscaldate. Incubare in un incubatore a 37 °.
5. Dopo 45 minuti, ritirare 50 ml di surnatante. Questo contiene la soluzione di insulina secreta sotto glucosio basale.
6. Aggiungere 32 ml 500 mm di glucosio. Agitare la piastra 20 volte per miscelare la soluzione. Incubare in un incubatore a 37 °. Agitare la piastra 5 volte una volta ogni 5 min.
7. Dopo 45 minuti, ritirare 50 microlitri surnatante. Questo è l'insulina secreta sotto alta glucosio.
8. Trasferire tutte le isolette in una provetta da 1,5 ml. Congelare in -20 ° C per 30 min. Scongelare a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere il processo di congelamento e scongelamento.
9. Aggiungere 0,5 ml di etanolo al 70% con 20 mM HCl. Lasciar riposare. Questo è l'insulina nella isolotti.
10. Utilizzare ELISA convenzionale per saggiare i livelli di insulina, descritto in precedenza ^3.

Risultati

In condizioni ottimali, il metodo presentato può produrre 20 - 80 isolotti da ogni piccolo pancreas mouse. Questo numero dipende dal background genetico, età dei topi, e la dimensione di isolotti da recuperare. Tra il comunemente usato, CD1 out-allevato e C57BL / 6J pura producono meno isolotti con dimensioni inferiori a ibridi tra CD1 e C57BL / 6 o B6CBAF1 commerciale / topi J fanno. Mano diretto raccogliendo in generale ha dato un numero minore di isolotti, probabilmente a causa della ...

Discussione

Qui, forniamo un protocollo step-by-step su isolamento delle isole dal pancreas che sono troppo piccoli per la perfusione convenzionale. Si prevede di produrre isolotti pronti per tutti gli studi isolotto-based come la purificazione delle cellule beta, analisi di espressione genica, isolotto la maturazione delle cellule beta, la proliferazione, risposte allo stress cellulare, la sopravvivenza delle cellule, il metabolismo, e funzionale manutenzione GSIS, ecc. Questo sarà, al meglio delle nostre conoscenze, il p...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Collagenasi Tipo IV	Sigma Aldrich, St Louis, MO	C5138
1x HBSS con Ca2+/Mg2+	Mediatech/Cellgro, Manassas, VA	MT21020CV	Se si ottiene HBSS senza Ca2+/Mg2+, è possibile aggiungere CaCl2 e MgSO4 1,26 e 0,5 mM, rispettivamente.
RPMI 1640 senza glucosio	Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA	11879-020	Il glucosio deve essere aggiunto a livelli specifici per non interferire con il successivo utilizzo delle isole.
Glucosio	Sigma Aldrich, St Louis, MO	G-7021
soluzione di polisaccarosio e diatrizoato di sodio	Sigma Aldrich, St Louis, MO	Histopaque-10771
Stereoscopio	Carl-Zeiss, Oberkochen, Germania	Stemi2000
Stereoscopio	Leica, Wetzlar, Germania	M165
Microcentrifuga	Eppendorf, Hauppauge, NY	Centrifuga 5417C
Centrifuga	Eppendorf, Hauppauge, NY	Centrifuge 5810R
15-mL provette centrfughe	VWR, Radnor, PA	89039-666
50-mL provette centrfughe	VWR, Radnor, PA	89039-658
Bilancia di precisione	VWR, Radnor, PA	VWR-225AC
Provette microfughe	VWR, Radnor, PA	87003-294
Pipetman P1000	Fisher Scientific,  Waltham, MA	F123602
Pipetman P20	Fisher Scientific,  Waltham, MA	F123600
Piatto 100 x 15 mm	VWR, Radnor, PA	25384-088
Piatto 60 x 15 mm	VWR, Radnor, PA	25384-168
Piastre a 12 pozzetti	VWR, Radnor, PA	665-180
Forbice	Fine Scientific Tools, Foster City, CA	14080-11
Pinzette	Fine Scientific Tools, Foster City, CA	5708-5
Topi CD1	Charles River Laboratories, Wilminton, MA	CD-1
C57BL / 6J	Il laboratorio Jackson, Farmington, CT	C57BL/6J
B6CBAF1/J	Il laboratorio Jackson, Farmington, CT	B6CBAF1/J

Leica