Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla In Situ Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati

Summary

Il presente protocollo descrive l'utilità dell'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH) e del cariotipo spettrale (SKY) nell'identificare aberrazioni stabili intercromosomiche nelle cellule del midollo osseo dei topi dopo l'esposizione all'irradiazione corporea totale.

Abstract

Le radiazioni ionizzanti (IR) inducono numerose aberrazioni cromosomiche stabili e instabili. Le aberrazioni instabili, in cui la morfologia cromosomica è sostanzialmente compromessa, possono essere facilmente identificate con le tecniche convenzionali di colorazione cromosomica. Tuttavia, il rilevamento di aberrazioni stabili, che comportano lo scambio o la traslocazione di materiale genetico senza modifiche considerevoli nella morfologia cromosomica, richiede sofisticate tecniche di pittura cromosomica che si basano sull'ibridazione in situ di sonde di DNA marcate in fluorescenza, una tecnica di pittura cromosomica popolarmente nota come fluorescenza in situ ibridazione (FISH). Le sonde FISH possono essere specifiche per interi cromosomi o per sottoregioni precise su cromosomi. Il metodo non solo consente la visualizzazione di aberrazioni stabili, ma può anche consentire il rilevamento del/i cromosoma/i o della/e sequenza/e di DNA specifica coinvolta in una particolare formazione di aberrazione. Una varietà di tecniche di pittura cromosomica sono disponibili in citogenetica; qui vengono discussi due metodi altamente sensibili, l'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH) e il cariotipo spettrale (SKY), per identificare le aberrazioni stabili intercromosomiche che si formano nelle cellule del midollo osseo dei topi dopo l'esposizione all'irradiazione corporea totale. Sebbene entrambe le tecniche si basino su sonde di DNA marcate con fluorescenza, il metodo di rilevamento e il processo di acquisizione delle immagini dei segnali fluorescenti sono diversi. Queste due tecniche sono state utilizzate in varie aree di ricerca, come la biologia delle radiazioni, la citogenetica del cancro, la biodosimetria retrospettiva delle radiazioni, la citogenetica clinica, la citogenetica evolutiva e la citogenetica comparativa.

Introduction

I due metodi più affidabili per identificare le aberrazioni stabili intercromosomiche indotte dalle radiazioni sono l'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH), che consente la verniciatura di due o più cromosomi contemporaneamente, e il cariotipo spettrale (SKY), che conferisce un colore distinto a ciascuna coppia di cromosomi omologhi nel genoma. A differenza delle aberrazioni instabili, le aberrazioni stabili sono di natura persistente e possono essere propagate per diverse generazioni nelle popolazioni irradiate¹, e sono considerate come "firme" molecolari critiche delle lesioni citogenetiche indotte da radiazioni². Studi condotti da vari gruppi hanno dimostrato che le aberrazioni stabili sono associate alla patogenesi e allo sviluppo di una serie di malattie, tra cui il cancro³. Prima dell'era della pittura cromosomica (nota anche come citogenetica molecolare), la tecnica convenzionale del G-banding era l'unico metodo per rilevare aberrazioni cromosomiche stabili. Tuttavia, il banding cromosomico è una sfida per i citogenetisti perché la risoluzione è limitata, la riproducibilità è incerta, è una procedura laboriosa e richiede citogenetisti altamente qualificati ed esperti per un'interpretazione affidabile dei dati⁴. Inoltre, la tecnica classica del banding non consente di rilevare riarrangiamenti cromosomici complessi, che comportano l'interazione di tre o più rotture distribuite tra due o più cromosomi, esito comune del danno da radiazioni. Le aberrazioni complesse possono persistere negli individui molti anni dopo l'esposizione alle radiazioni, rendendole utili per la biodosimetria retrospettiva⁵. Pertanto, era necessario un approccio alternativo per superare i limiti delle tecniche convenzionali di banding per rilevare riarrangiamenti cromosomici stabili.

Alla fine degli anni '60, il lavoro pionieristico di Gall e Pardue (1969) sull'ibridazione molecolare utilizzando sonde di acido nucleico marcate con materiale radioattivo ha dato inizio a una nuova era nel campo della citogenetica, che ha permesso il rilevamento di una specifica sequenza di DNA sui cromosomi⁶. Tuttavia, l'uso di sonde radioattive per l'ibridazione molecolare presentava diversi inconvenienti: le sonde radioattive sono relativamente instabili, l'attività della sonda dipende dal decadimento radioattivo dell'isotopo utilizzato, l'ibridazione richiede un tempo più lungo, la risoluzione è limitata, le sonde sono relativamente costose e i materiali radioattivi sono pericolosi per la salute. Pertanto, si rese necessario sviluppare e progettare sonde non radioattive. L'introduzione di sonde di acido nucleico marcate in fluorescenza negli anni '80 e '90 ha superato i limiti delle sonde radioattive e ha notevolmente migliorato la sicurezza, la sensibilità e la specificità della tecnica di ibridazione^7-10. Le sonde fluorescenti danno origine a segnali estremamente luminosi quando osservate al microscopio a fluorescenza dotato di appropriati filtri di eccitazione ed emissione. Qualsiasi perdita, guadagno o riarrangiamento di cromosomi marcati fluorescenti o di una parte del cromosoma è facilmente identificabile con questa tecnica FISH.

L'analisi delle aberrazioni cromosomiche mediante pittura FISH ha portato a notevoli progressi nella ricerca citogenetica nel corso degli anni. La progettazione di sonde marcate con fluorescenza per applicazioni specifiche che vanno dalle sonde locus-specific alle sonde di verniciatura dell'intero cromosoma ha fatto progredire il campo in modo significativo; Ciò ha anche facilitato l'individuazione di un riarrangiamento submicroscopico ("criptico"), che non era possibile con il banding cromosomico convenzionale. La pittura cromosomica di mFISH e SKY si è dimostrata uno strumento prezioso per l'identificazione di riarrangiamenti intercromosomici semplici e complessi. I principi di base per entrambe le tecniche sono simili, ma il metodo di rilevamento e discriminazione del segnale fluorescente dopo l'ibridazione in situ e il processo di acquisizione dell'immagine sono diversi. Nella mFISH, vengono catturate immagini separate di ciascuno dei quattro fluorocromi utilizzando filtri per microscopio passa-banda stretta; Viene poi utilizzato un software dedicato per combinare le immagini. Mentre in SKY, l'acquisizione delle immagini si basa su una combinazione di microscopia a epifluorescenza, imaging con dispositivo ad accoppiamento di carica e spettroscopia di Fourier, che consente la misurazione dell'intero spettro di emissione con una singola esposizione in tutti i punti dell'immagine. Sia in mFISH che in SKY, le immagini monocromatiche vengono catturate in modo indipendente, quindi unite e, infine, pseudo-colori unici vengono assegnati ai cromosomi in immagini monocromatiche in base al colorante specifico attaccato a ciascuna sonda fluorocromatica.

Il contributo dell'analisi mFISH e SKY nel campo della biologia delle radiazioni è notevole, in particolare per la stima retrospettiva della dose dell'esposizione umana a IR (biodosimetria da radiazioni)^11-14, la valutazione del rischio di carcinogenesi da radiazioni¹⁵, nonché il rilevamento e la stima del rischio di cancro secondario correlato alla radioterapia¹⁶. Un recente studio sui topi ha dimostrato che una tecnica di pittura cromosomica basata su FISH è anche uno strumento importante per valutare l'efficacia della contromisura delle radiazioni¹⁷. Nel presente studio, l'effetto dell'esposizione totale alle radiazioni del corpo sull'induzione di aberrazioni cromosomiche stabili nelle cellule del midollo osseo dei topi è stato dimostrato utilizzando tecniche mFISH e SKY.

Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono state eseguite in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo animale è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso degli animali della University of Arkansas per le scienze mediche. Tutti gli animali sono stati alloggiati sotto stabulario di aria condizionata di serie a 20 ± 2 ° C con 10 - 15 cicli orarie di aria fresca e di libero accesso al cibo roditori standard ed acqua. All'arrivo, i topi sono stati tenuti in quarantena per 1 settimana e fornito certificato Chow roditore.

1.Radiation esposizione e in vivo Arresto di cellule in metafase

1. Esporre i topi non-anestetizzato a 2 Gy di radiazione di tutto il corpo in una camera di irradiazione. Durante l'irradiazione, luogo topi in una camera di contenimento ben ventilata per assicurarsi che essi non si muovono liberamente e ricevono una dose uniforme.
2. Iniettare 100 ml di soluzione di colchicina 0,05% (cPolvere olchicine sciolto in calcio e magnesio libero PBS) per via intraperitoneale con un ago da 25 G allegato con 1 ml siringa monouso. Evitare l'iniezione direttamente in qualsiasi organo.
3. Lasciare l'animale nella gabbia per 2 h prima della raccolta di cellule di midollo osseo. Osservare l'animale per eventuali segni di dolore o disagio.

2. midollo osseo cellule Raccolta e Isolamento di cellule del midollo osseo mononucleate dal gradiente di densità centrifugazione

1. Eutanasia il mouse da CO ₂ asfissia.
2. Spray etanolo al 70% sul dorsale e lato ventrale.
3. Effettuare una incisione 2 centimetri sulla cute addominale con forbici affilate. Afferrare la pelle su entrambi i lati dell'incisione con pinzetta smussata e tirare delicatamente aprire i muscoli addominali.
4. Tagliare entrambe le zampe posteriori con le forbici e subito metterli in pre-refrigerata PBS con il 4% FBS.
5. Pulire accuratamente tutti i muscoli collegati al arto posteriore con un forte lametta e garza di cotone benda.
6. Separare la tibia dal femore. Tagliare entrambe le punte di ogni osso con una lametta.
7. Lavare il contenuto del midollo osseo con 3 ml di PBS (con 4% FBS) usando un ago 23 G attaccato ad una siringa da 3 mL e raccogliere il contenuto in una provetta da centrifuga 15. Passare la sospensione cellulare almeno 10 volte attraverso l'ago per fare una sospensione di cellule singole.
8. sovrapporre cautela la sospensione cellulare in un uguale volume di mezzo di separazione dei linfociti (3 mL) senza disturbare l'interfaccia tra la sospensione cellulare e mezzo di separazione dei linfociti. Centrifugare a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente.
9. Raccogliere accuratamente il buffy coat senza disturbare gli altri livelli e il trasferimento in una nuova 15 mL provetta.

3. Preparazione del Metaphase spread cellulari

1. Aggiungere 10 ml di PBS per il tubo contenente il buffy coat.
2. Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente.
3. rimuovere con attenzione il surnatante. Poi rompere tegli cella pellet con lievi colpetti e aggiungere 10 ml di PBS.
4. Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente.
5. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare, rompere il pellet, e aggiungere 4 ml di soluzione di cloruro di potassio 0,075 M ipotonici pre-riscaldato. Aggiungere ipotonica goccia a goccia soluzione agitando delicatamente costante.
6. Incubare le cellule per 20 minuti a 37 ° C in un bagno d'acqua.
7. Dopo il trattamento ipotonico, aggiungere un volume uguale (4 mL) di fissativo (metanolo: acido acetico glaciale, 3: 1 v / v) nel tubo 15 mL e mescolare delicatamente per inversione.
8. Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
9. Suddividere il pellet cellulare con intercettazioni seguito da dolce vortex per alcuni secondi e aggiungere 3 ml di fissativo goccia a goccia soluzione con costante agitazione.
10. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga a 400 xg per 5 min.
11. Rimuovere il surnatante, rompere il pellet cellulare con gentLe intercettazioni, e aggiungere 3 ml di fissativo fresco.
12. Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente, e rimuovere il surnatante. Suddividere il pellet cellulare con dolce intercettazioni, e aggiungere fresco 3 ml di fissativo.
13. Ripetere il punto 3.12 altre due volte.
14. Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente, e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Quindi aggiungere 400 a 600 microlitri fissativo e miscelare bene con pipettaggio.
15. Calo del 30 microlitri cellule fissate su vetrini pre-puliti e bagnati inclinato ad un angolo di 45 ° e consentire le diapositive asciugare completamente durante la notte.

4. topo cromosoma Dipinto di mFISH

1. cromosoma denaturazione
   1. Posizionare la diapositiva contenente spread cellulari metafase in 2x SSC per 2 minuti a temperatura ambiente.
   2. Disidratare il vetrino mediante lavaggio etanolo seriale per 2 minuti ogni a 70%, 80% e 100%. Incubare per 60 min a 65 ° C.
   3. Preriscaldare 40 ml soluzione di denaturazione (70% formammide / 2x SSC; pH 7,0) a 70 ° C (± 2 ° C) in una vaschetta Coplin di vetro per 30 min. Denaturare cromosomi incubando il vetrino in soluzione denaturazione pre-riscaldato per 1-1,5 min.
   4. Quench scorrere immediatamente ghiacciata etanolo al 70% per 2 minuti per fermare il processo di denaturazione, nonché per prevenire i cromosomi denaturati da re-ricottura. Poi disidratano mediante lavaggio con etanolo 80% per 2 min. Ripetere il lavaggio con etanolo 100% di etanolo per 2 min. Completamente asciugare il vetrino a temperatura ambiente.
2. Denaturazione e ibridazione di sonda Miscela
   1. centrifugare brevemente la miscela di sonda in dotazione dal costruttore, trasferire 10 ml di miscela della sonda in un 500 microlitri scatto provetta tappo, e denaturate mediante incubazione a 80 ° C (± 2 ° C) in un bagno d'acqua per 7 min.
   2. Posizionare il tubo da centrifuga con miscela di sonda in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10 min.
   3. Applicare la miscela sonda denaturata sul vetrino con chromoso denaturatomes.
   4. coprire con cura la zona con una x 18 mm copertura in vetro antiscivolo 18 mm e di eliminare eventuali bolle d'aria visibili premendo molto delicatamente il vetrino a scivolare. Sigillare tutti i quattro lati del vetrino con cemento di gomma e incubare per 12 ore a 16 h al buio a 37 ° C in una camera umidificata per l'ibridazione.
3. Messaggio ibridazione di lavaggio e di rilevamento
   1. Rimuovere con cura il mastice e la polizza di copertura.
   2. Porre il vetrino in pre-riscaldato 0.4x SSC a 74 ° C (± 2 ° C) per 5 min.
   3. Lavare il vetrino in soluzione di lavaggio II (4x SSC / 0.1% Tween-20) per 2 min.
   4. Mettere 20 ml di anti-sbiadimento mezzo di montaggio con DAPI di contrasto (1,5 mg / ml) e coprire con un coprioggetto di vetro. Premere delicatamente sul vetrino con il tessuto di laboratorio per rimuovere le bolle d'aria e soluzione di montaggio in eccesso. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto.
   5. Vedi diapositive utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri appropriati.

5. spettrale cariotipo (SKY) del mouse cromosomi

1. Cromosoma e denaturazione della sonda
   1. Equilibrare diapositiva in 2x SSC a temperatura ambiente per 2 minuti, senza agitare.
   2. Disidratare presentazione in un serie di etanolo (70%, 80% e 100% etanolo) per 2 minuti ciascuna a temperatura ambiente. Far asciugare il vetrino per rimuovere completamente l'etanolo.
   3. Warm 40 mL di soluzione di denaturazione (70% formammide / 2x SSC; pH 7,0) in una vaschetta Coplin di vetro per 30 min.
   4. Incubare il vetrino in soluzione denaturazione pre-riscaldato per 1 a 1,5 min.
   5. immergere immediatamente il vetrino in ghiacciata etanolo al 70% per 2 min per arrestare il processo di denaturazione e per evitare che i cromosomi denaturati da re-ricottura.
   6. Disidratare il vetrino mettendolo in 80% etanolo per 2 minuti e poi in 100% di etanolo per 2 minuti a temperatura ambiente.
   7. Denaturare la sonda SKY (vial # 1 fornito dal produttore) in un bagnomaria regolato a 80 ° C (± 2 ° C)per 7 minuti, e poi immediatamente posto in una diversa bagnomaria a 37 ° C per 10 min.
2. sonda ibridazione
   1. Aggiungere 10 ml di sonda SKY denaturato sui cromosomi denaturati.
   2. Posizionare con cura un vetrino di vetro 18 millimetri x 18 mm sulla sonda SKY in modo che non bolle d'aria intrappolate sotto il vetrino.
   3. Sigillare i bordi del vetrino con mastice.
   4. Posizionare il vetrino in una camera a tenuta di luce umidificata e incubare al buio a 37 ° C per 24 ore a 36 h.
3. Post-ibridazione Lavaggio e rivelazione a fluorescenza
   1. Rimuovere il cemento di gomma con molta attenzione senza disturbare il vetrino.
   2. Posizionare la diapositiva in pre-riscaldato soluzione di lavaggio rapido (0.4x SSC) a 72 ° C (± 2 ° C) per 5 minuti con costante agitazione. Immergere vetrino nella soluzione di lavaggio III (4x SSC / 0.1% Tween 20) e incubare per 1 min agitando.
   3. Opzionale: Aggiungere 80 ml di reagente di bloccaggio(Fiala # 2 fornito dal produttore) sulla zona di ibridazione, posizionare 24 mm coprioggetto plastica x 60 mm, e incubare al buio a 37 ° C per 30 minuti in una camera umidificata.
   4. Rimuovere delicatamente il vetrino di plastica e lavare la slitta con pre-riscaldato (45 ° C) soluzione di lavaggio III per 5 min.
   5. Applicare 80 ml di Cy5 colorazione reagente (vial # 3 fornito dal produttore), posizionare un 24 millimetri coprioggetto in plastica x 60 mm, e incubare a 37 ° C al buio per 40 minuti in una camera umidificata.
   6. Immergere il vetrino in un barattolo di vetro Coplin contenente pre-riscaldato (45 ° C) soluzione di lavaggio III (4x SSC / 0.1% Tween 20) e incubare a 45 ° C in un bagno d'acqua per 2 minuti con agitazione. Ripetere questa operazione di lavaggio per 3 volte.
   7. Applicare 80 ml di Cy5.5 colorazione reagente (vial # 4 fornito dal produttore), posizionare un 24 millimetri coprioggetto in plastica x 60 mm, e incubare a 37 ° C al buio per 40 minuti in una camera umidificata.
   8. Lavare il vetrino 3 volte con pre-riscaldato (45 ºC) soluzione di lavaggio III.
   9. Tenere il vetrino in posizione inclinata contro un tovagliolo di carta per drenare i liquidi in eccesso. Aggiungere 20 ml anti-sbiadimento DAPI reagente (vial # 5 fornito dal produttore) e con attenzione inserire un vetrino di vetro 24 millimetri x 60 mm senza introdurre bolle d'aria. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto e osservare con un microscopio a epifluorescenza dotato per catturare le immagini SKY.

Results

Irradiazione corporea totale induce numerose aberrazioni cromosomiche nelle cellule del midollo osseo di topi irradiati. L'attuale protocollo è ottimizzato per l'arresto mitotico in vivo di cellule del midollo osseo dopo l'esposizione alle radiazioni, la raccolta di cellule del midollo osseo dalle zampe posteriori di topi irradiati, isolamento di cellule del midollo osseo mononucleari mediante centrifugazione in gradiente di densità, la preparazione degli spread cellulari metafa...

Discussion

Diversi passaggi critici determinano il successo di mFISH e SKY. Il primo e più importante passo è quello di ottimizzare il trattamento colchicina per l'arresto in vivo mitotico delle cellule mononucleate del midollo osseo. Il tempo di concentrazione di colchicina e il trattamento individualmente o in concerto determinare l'indice mitotico e condensazione cromosomica-due importanti presupposti per un efficace pittura cromosoma. Un tempo di trattamento ad alta concentrazione di colchicina o più porta a c...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formamide	Sigma-Aldrich	221198-100ML
SSC Tampone 20&volte; Concentrato	Sigma-Aldrich	S6639-1L
SKY Reagente da Laboratorio per Imaging	Spettrale Applicato	FPRPR0030/M40
CAD - Kit di Rilevamento Anticorpi Concentrato	Imaging Spettrale Applicato	FPRPR0033
Vernici Singole Personalizzate - 3 Colori; Cromosoma 1 del topo: Rosso, Cromosoma 2 del topo: Verde, Cromosoma 3 del topo: Aqua	Applied Spectral Imaging	FPRPR0182/10
Vetrini coprioggetti	Fisher Scientific	12-545B
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Acido cloridrico, 37%, Acros Organics	Fisher Scientific	AC45055-0025
Piatti per la colorazione del vetro Fisherbrand con tappo a vite	Fisher Scientific	08-816
KaryoMAX Soluzione di cloruro di potassio	Life Technologies	10575-090
Fisherbrand Vetrini per microscopio Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Colcemid in polvere	Fisher Scientific	50-464-757
Histopaque-1083	Sigma-Aldrich	10831
Shepherd Mark I, modello 25 137Cs irradiatore	J. L. Shepherd & Associates	Modello 484B
Siringa 1 mL	BD Biosciences	647911
Alcool etilico, 200 Proof	Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), senza calcio e magnesio	Fisher Scientific	ICN1860454
Siero fetale bovino	Fisher Scientific	10-437-010
Metanolo	Fisher Scientific	A454SK-4
Acido acetico glaciale	Fisher Scientific	AC295320010
Zeiss Microscopio	Zeiss	AXIO Imager.Z2