Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla In Situ Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati

Summary

Il presente protocollo descrive l'utilità dell'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH) e del cariotipo spettrale (SKY) nell'identificare aberrazioni stabili intercromosomiche nelle cellule del midollo osseo dei topi dopo l'esposizione all'irradiazione corporea totale.

Abstract

Le radiazioni ionizzanti (IR) inducono numerose aberrazioni cromosomiche stabili e instabili. Le aberrazioni instabili, in cui la morfologia cromosomica è sostanzialmente compromessa, possono essere facilmente identificate con le tecniche convenzionali di colorazione cromosomica. Tuttavia, il rilevamento di aberrazioni stabili, che comportano lo scambio o la traslocazione di materiale genetico senza modifiche considerevoli nella morfologia cromosomica, richiede sofisticate tecniche di pittura cromosomica che si basano sull'ibridazione in situ di sonde di DNA marcate in fluorescenza, una tecnica di pittura cromosomica popolarmente nota come fluorescenza in situ ibridazione (FISH). Le sonde FISH possono essere specifiche per interi cromosomi o per sottoregioni precise su cromosomi. Il metodo non solo consente la visualizzazione di aberrazioni stabili, ma può anche consentire il rilevamento del/i cromosoma/i o della/e sequenza/e di DNA specifica coinvolta in una particolare formazione di aberrazione. Una varietà di tecniche di pittura cromosomica sono disponibili in citogenetica; qui vengono discussi due metodi altamente sensibili, l'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH) e il cariotipo spettrale (SKY), per identificare le aberrazioni stabili intercromosomiche che si formano nelle cellule del midollo osseo dei topi dopo l'esposizione all'irradiazione corporea totale. Sebbene entrambe le tecniche si basino su sonde di DNA marcate con fluorescenza, il metodo di rilevamento e il processo di acquisizione delle immagini dei segnali fluorescenti sono diversi. Queste due tecniche sono state utilizzate in varie aree di ricerca, come la biologia delle radiazioni, la citogenetica del cancro, la biodosimetria retrospettiva delle radiazioni, la citogenetica clinica, la citogenetica evolutiva e la citogenetica comparativa.

Introduction

I due metodi più affidabili per identificare le aberrazioni stabili intercromosomiche indotte dalle radiazioni sono l'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH), che consente la verniciatura di due o più cromosomi contemporaneamente, e il cariotipo spettrale (SKY), che conferisce un colore distinto a ciascuna coppia di cromosomi omologhi nel genoma. A differenza delle aberrazioni instabili, le aberrazioni stabili sono di natura persistente e possono essere propagate per diverse generazioni nelle popolazioni irradiate¹, e sono considerate come "firme" molecolari critiche delle lesioni citogenetiche indotte da radiazioni². Studi c....

Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono state eseguite in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo animale è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso degli animali della University of Arkansas per le scienze mediche. Tutti gli animali sono stati alloggiati sotto stabulario di aria condizionata di serie a 20 ± 2 ° C con 10 - 15 cicli orarie di aria fresca e di libero accesso al cibo roditori standard ed acqua. All'arrivo, i topi sono stati tenuti in quarantena per 1 settimana e fornito certificato Chow roditore.

Results

Irradiazione corporea totale induce numerose aberrazioni cromosomiche nelle cellule del midollo osseo di topi irradiati. L'attuale protocollo è ottimizzato per l'arresto mitotico in vivo di cellule del midollo osseo dopo l'esposizione alle radiazioni, la raccolta di cellule del midollo osseo dalle zampe posteriori di topi irradiati, isolamento di cellule del midollo osseo mononucleari mediante centrifugazione in gradiente di densità, la preparazione degli spread cellulari metafa.......

Discussion

Diversi passaggi critici determinano il successo di mFISH e SKY. Il primo e più importante passo è quello di ottimizzare il trattamento colchicina per l'arresto in vivo mitotico delle cellule mononucleate del midollo osseo. Il tempo di concentrazione di colchicina e il trattamento individualmente o in concerto determinare l'indice mitotico e condensazione cromosomica-due importanti presupposti per un efficace pittura cromosoma. Un tempo di trattamento ad alta concentrazione di colchicina o più porta a c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formamide	Sigma-Aldrich	221198-100ML
SSC Tampone 20&volte; Concentrato	Sigma-Aldrich	S6639-1L
SKY Reagente da Laboratorio per Imaging	Spettrale Applicato	FPRPR0030/M40
CAD - Kit di Rilevamento Anticorpi Concentrato	Imaging Spettrale Applicato	FPRPR0033
Vernici Singole Personalizzate - 3 Colori; Cromosoma 1 del topo: Rosso, Cromosoma 2 del topo: Verde, Cromosoma 3 del topo: Aqua	Applied Spectral Imaging	FPRPR0182/10
Vetrini coprioggetti	Fisher Scientific	12-545B
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Acido cloridrico, 37%, Acros Organics	Fisher Scientific	AC45055-0025
Piatti per la colorazione del vetro Fisherbrand con tappo a vite	Fisher Scientific	08-816
KaryoMAX Soluzione di cloruro di potassio	Life Technologies	10575-090
Fisherbrand Vetrini per microscopio Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Colcemid in polvere	Fisher Scientific	50-464-757
Histopaque-1083	Sigma-Aldrich	10831
Shepherd Mark I, modello 25 137Cs irradiatore	J. L. Shepherd & Associates	Modello 484B
Siringa 1 mL	BD Biosciences	647911
Alcool etilico, 200 Proof	Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), senza calcio e magnesio	Fisher Scientific	ICN1860454
Siero fetale bovino	Fisher Scientific	10-437-010
Metanolo	Fisher Scientific	A454SK-4
Acido acetico glaciale	Fisher Scientific	AC295320010
Zeiss Microscopio	Zeiss	AXIO Imager.Z2