Isolamento di mouse endometriale epiteliali e stromali cellule per<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualizzazione

Sommario

Questo studio presenta un metodo standardizzato e convalidato per l'isolamento e la coltura del mouse principale stromale endometriale e cellule epiteliali, che può essere utilizzato in un sistema di co-coltura per studiare in decidualizzazione vitro.

Abstract

Decidualizzazione è un processo di differenziazione progesterone-dipendente delle cellule stromali endometriali ed è un prerequisito per il successo l'impianto dell'embrione. Sebbene molti sforzi sono stati fatti per rivelare i meccanismi sottostanti decidualizzazione, la segnalazione esatta tra le cellule epiteliali che sono in contatto con l'embrione e le cellule stromali sottostanti rimane poco compresa. Pertanto, lo studio decidualizzazione in un modo che prende sia la epiteliali e cellule stromali in considerazione potrebbero migliorare le nostre conoscenze circa i dettagli molecolari di decidualizzazione. A questo scopo, in modelli in vivo di decidualizzazione artificiale sono fisiologicamente più rilevanti; Tuttavia, la manipolazione di comunicazione intercellulare è limitata. Attualmente, in colture in vitro di cellule stromali endometriali vengono utilizzati per studiare la modulazione della decidualizzazione da più molecole di segnalazione. Convenzionalmente, le cellule stromali umane o il mouse endometriali sonousato. Tuttavia, la disponibilità di campioni umani è molto spesso limitata. Inoltre, l'uso di tessuti murini è accompagnato varietà nel metodo di coltura. Questo studio presenta un metodo validato e standardizzato per ottenere puro cellulare endometriale epiteliale (CEE) e le culture stromali cellulare (ESC) con adulti topi intatti trattati con estrogeni per tre giorni consecutivi. Il protocollo è ottimizzato per migliorare la resa, la vitalità e la purezza delle cellule ed è stato ulteriormente esteso per studiare decidualizzazione in un coculture di CEE e ESC. Questo modello può essere adatto a sfruttare l'importanza di entrambi i tipi di cellule in decidualizzazione e di valutare il contributo di molecole di segnalazione significativi secrete dalle CEE o ESC durante la comunicazione intercellulare.

Introduzione

L'endometrio umano è il rivestimento interno dell'utero e subisce cicli mensili di scomposizione e di riparazione come preparazione per eventuali gravidanze. È costituito da un singolo strato di cellule epiteliali che rivestono il lume uterine e stroma sottostante, che varia in spessore in funzione delle fluttuazioni di ormoni ovarici estrogeno e progesterone. Durante la fase luteale, l'aumento di progesterone dopo l'ovulazione si indurre la differenziazione delle cellule stromali endometriali in cellule deciduali rotonde più grandi, un processo chiamato decidualizzazione ^{1, 2.} Nell'uomo, questo fenomeno si verifica spontaneamente per formare il predecidua, ma diventa più pronunciato su impianto dell'embrione. Una conseguenza funzionale decidualizzazione è che l'utero diventa transitoriamente ricettivo all'impianto dell'embrione. Questo intervallo è etichettato come 'finestra dell'impianto'. Durante il primo periodo di impianto dell'embrione, la decidualized ecellule stromali ndometrial circondano l'embrione impiantare fornirà una barriera per impedire il passaggio di sostanze nocive per l'embrione ^3. Durante la gravidanza, questo decidua fornirà le sostanze nutrienti per il feto in via di sviluppo prima placentation ha avuto luogo, e poi formare la parte materna della placenta ^4.

Considerazioni etiche e pratiche limitano la progettazione di studi umani di indagare il processo di decidualizzazione e hanno spinto l'uso di modelli animali. Essere un membro del gruppo placentazione hemochorial, l'endometrio di roditori subirà decidualizzazione prima placentazione ^5. Nei roditori, tuttavia, l'avvio del processo decidualizzazione dipende dalla presenza di blastocisti nel lume uterino, indicando che uno stimolo supplementare è necessaria per innescare le reazioni deciduali ^6. Ciò implica una comunicazione complicato tra the endometriali cellule epiteliali che hanno il contatto diretto con la blastocisti, e le cellule stromali sottostanti. Tuttavia, decidualizzazione può essere artificialmente indotta utilizzando stimoli come graffi meccanica o l'instillazione di olio in un utero ormonalmente innescato. Anche se gli studi in vivo utilizzando modelli decidualizzazione artificiali ci hanno permesso di migliorare le nostre conoscenze nel complesso processo di segnalazione di decidualizzazione, meccanicistici studi approfonditi, ad esempio, l'indagine della comunicazione indispensabile tra le cellule epiteliali e stromali, sono limitate. Pertanto, in vitro studi decidualizzazione possono essere utilizzati per manipolare percorsi importanti e studiare processi fondamentali. A tal fine, colture di cellule stromali endometriali primarie possono essere impostati da endometrio umano o roditori. Impiegando roditori acconsente l'uso di animali geneticamente modificati per studiare il ruolo di una specifica proteina di interesse durante il processo di decidualizzazione. Tuttavia, immaturo, prepubertopi ty sono spesso utilizzati per evitare complicazioni del ciclo estrale, mentre in altri casi uteri vengono raccolti da tutte le fasi del ciclo estrale, che si traduce in una eterogeneità nelle colture. Inoltre, il processo di decidualizzazione è stato studiato in diversi protocolli, ad esempio, da (i) ormoni addizionale (estrogeni, progesterone o adenosina monofosfato ciclico (cAMP)) al mezzo di coltura, oppure (ii) isolamento di cellule deciduali da topi a giorno 4,5 di (pseudo) la gravidanza, che richiedono ulteriore necessità di un controllo spina e maschi vasectomized. Queste limitazioni dimostrano la necessità di un metodo standardizzato per studiare in decidualizzazione vitro. In questo studio, un modello fisiologico per esaminare decidualizzazione in vitro a partire da adulto, saranno presentati (pseudo) femmine di topo gravide non. In questo metodo, iniezione giornaliera di 17β-estradiolo (E2) induce la proliferazione di cellule endometriali, con un conseguente aumento della resa di omogeneo e ppopolazioni di cellule ure. Inoltre, l'uso di un sistema coculturing permette lo studio del crosstalk epitelio-stromale e la capacità di manipolare il processo di decidualizzazione su diversi livelli.

Protocollo

AlexaFluor

Tutti gli esperimenti sugli animali per questo studio sono stati approvati dal comitato etico della KU Leuven (Belgio) (Progetto P174 / 2013). I topi sono stati alloggiati in condizioni standard, con ad libitum accesso a pellet cibo e acqua del rubinetto, e tenuti in condizioni controllate (23 ± 1,5 ° C, umidità relativa 40 - 60%, 12/12 luce / buio ciclo).

1. topi

1. Utilizzare disponibili in commercio ceppo di topi (cioè C57Bl / 6, femmina 8 - 12 settimane). Tipicamente, 4 - 5 topi produrranno una quantità appropriata di cellule per ulteriori esperimenti.
2. Iniettare topi intatti via sottocutanea con 100 ml di 17β-estradiolo (E2) soluzione (100 ng / 100 ml) per 3 consecutivi d prima all'isolamento per standardizzare la fase del ciclo estrale degli animali e di indurre proliferazione di endometriale cellule. La necessità di controllare la fase del ciclo dei topi prima di iniziare il protocollo è essere evitabilecausa 3 d trattamento estradiolo '.

2. preparati

1. Fare una soluzione di 100 ng / 100 ml E2 in olio di arachidi. Per le iniezioni di cinque topi (come descritto in 1.2), è necessaria una quantità di 1,5 mL.
   1. Sciogliere 1 mg E2 in 1 mL di etanolo per avere una soluzione stock di 1 mg / mL.
   2. Diluire questa soluzione, 1: 1.000 in olio di arachidi.
2. Fai 500 ml di soluzione di Hank salina bilanciata (HBBS) 1x integrato con 100 U / mL di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (in seguito indicato come HBSS +).
3. Fare 500 ml di filtrato cellulare mouse endometriale stromale (MESC) medio alla cultura MESC: Dulbecco Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12) con rosso fenolo, L-glutammina e 4- (2-idrossietil) piperazina-1-etansolfonico acido N - (2-idrossietil) piperazine- N '- (acido 2-etansolfonico) (HEPES) contenente 10% FBS, 0,5 mg / mL amfotericina B, e 100 mg / mL di gentamicina (further indicato come mezzo MESC).
4. Fare 500 ml di filtrato media MESC 2% alla cultura MESC durante decidualizzazione: DMEM / F12 con rosso fenolo, L-glutammina e HEPES contenente 2% FBS, 0,5 mg / ml amfotericina B, e 100 mg / ml gentamicina.
5. Preparare 500 ml di filtrato cellulare mouse endometriale epiteliale (MEEC) mezzo: DMEM contenente 10% FBS, 0,5 mg / ml amfotericina B, 100 mg / ml gentamicina, il 25% MCDB-105 di media, e 5 mg / ml di insulina (in seguito denominato come mezzo MEEC).
6. Preparare vetrini Poli-L-lisina (PLL) rivestiti per la cultura MESC.
   1. Disciogliere 25 mg di PLL in 250 mL di acqua distillata. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 micron.
   2. Aggiungere coprioggetto sterili in un 12-pozzetti. Aggiungere 300 ml di disciolto PLL sui vetrini.
   3. Rimuovere la soluzione dopo 30 min di incubazione. Le piastre possono essere conservati a 4 ° C fino all'utilizzo (fino a 1 - 2 mesi).
7. Preparare un 10 mg / mL di soluzione of tipo collagenasi IA e memorizzare aliquote di 300 ml a -20 ° C. Filtrare prima dell'uso.

3. preparativi necessari 24 ore prima di isolamento

1. Preparare collagene vetrini rivestiti per la cultura MEEC.
   1. Preparare una soluzione di acido acetico 0,02 M in acqua distillata (1 ml per vetrino).
   2. Aggiungere 150 microlitri collagene in 12 ml di 0,02 M di acido acetico per ottenere una concentrazione finale di 50 mg / mL.
   3. Aggiungere coprioggetto sterili in un 12-pozzetti.
   4. Aggiungere 1 ml di soluzione di collagene (vedi 3.1.2).
   5. Incubare O / N (minimo 12 ore) a 37 ° C.
      Durante l'isolamento:
   6. Rimuovere la soluzione di collagene fuori i coprioggetti mediante aspirazione e lasciare asciugare in un ambiente sterile (nella cappa a flusso laminare).
   7. Lavare i coprioggetti due volte con fosfato-Buffered Saline (PBS).
2. Preparare una soluzione pancreatina 2,5% aggiungendo 0,25 g pancreatina in un tubo canonica 15 mL contenente 10 mL diHBSS +. Agitare (200 rpm) la soluzione a 37 ° C per 1 h per aumentare la solubilità. Conservare a 4 ° C.

4. isolamento e la coltura di cellule di topo endometriale epiteliali (MEEC) e mouse endometriale stromali Cells (MESC)

1. Aggiungere 25 mg di tripsina in un tubo da 15 ml contenente soluzione pancreatina 2,5% (v 3.2) per finire con una soluzione finale contenente 0,25% tripsina (in seguito denominata mix digestione MESC).
2. Isolamento della cervice
   1. Controllare la fase del ciclo degli animali con un esame striscio vaginale.
      1. Trattenere l'animale e lavare la vagina delicatamente con 50 microlitri di PBS 3 - 5 volte.
      2. Raccogliere il colore finale su un vetrino.
      3. Esaminare il materiale sotto un microscopio campo chiaro utilizzando un obiettivo 10X o 20X.
      4. Utilizzare solo topi che sono in fase di estro. Questa fase è caratterizzata dalla presenza di cellule epiteliali cornified nella lavanda vaginale (Figura 1 ).
   2. Eutanasia gli animali usando un metodo appropriato, come dislocazione cervicale o di CO ₂ narcosi indotta.
   3. Spruzzare le carcasse con il 70% di etanolo per generare un ambiente sterile.
   4. L'utilizzo di strumenti chirurgici sterili, aprire l'addome e spingere l'intestino da parte di visualizzare entrambe le corna uterine.
   5. Afferra il corno uterino alla fine più distale sotto la tuba di Falloppio. Sezionare le corna uterine dalla tuba di Falloppio e rimuovere il tessuto adiposo e tessuto connettivo. Tagliare il corno alla fine distale di sopra del corpo uterino e posizionarlo in 35 mm piastra di Petri con 3 ml di HBSS +.
      1. Ripetere questo passaggio per l'altro corno e per gli altri animali fino a quando tutte le corna uterine sono raccolti.
   6. Pulire il corno uterino (in HBSS +) ulteriormente sotto uno stereoscopio e rimuovere tutti adiposo residua o del tessuto connettivo.
   7. Tagliare le corna uterine aperte longitudinalmente per esporre il lume uterino e sostituire °e corno in una nuova capsula di Petri con fresco HBSS +.
   8. Trasferire tutte le corna uterine al tubo da 15 ml contenente pancreatina e tripsina.
   9. Incubare orizzontalmente per 60 min a 4 ° C in un agitatore orbitale (50 rpm).
   10. Incubare in orizzontale per 45 minuti a 23 ° C (RT), senza agitare.
   11. Incubare orizzontalmente per 15 minuti a 37 ° C (bagno d'acqua), senza agitare.
   12. Intanto rendere la miscela di digestione MESC sciogliendo 300 ml di 1 mg / ml di collagenasi magazzino in 2,7 mL di soluzione di 0,05% di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA).
       NOTA: Da ora in poi, ulteriori misure di isolamento vengono eseguite in un ambiente sterile sotto una cappa a flusso laminare.
3. Mouse endometriale cellule epiteliali (MEEC) Cultura
   1. Dopo 2 ore di incubazione, con attenzione versare via la soluzione surnatante.
   2. Trasferire il uteri in una capsula di Petri contenente medio MEEC freddo e incubare per 5 minuti al fine di inattivare la tripsinaattività.
   3. Trasferire il uteri ad una provetta da 15 ml contenente 3 ml di HBSS freddo +.
   4. Vortex per 10 s per liberare i fogli epiteliali.
   5. Sciacquare il uteri in un piatto pulito Petri con 3 ml HBSS +.
   6. Ripetere passaggio 4.3.2 - 4.3.4 per ottenere un totale di tre sospensioni contenenti fogli epiteliali.
   7. Trasferire il uteri al mix digestione MESC e incubare per 30 minuti a 37 ° C agitando (200 rpm) (andare al punto 4.4 per un ulteriore isolamento di MESC).
   8. Recuperare i fogli epiteliali pipettando tre sospensioni cellulari dolcemente su una maglia di nylon 100 micron per rimuovere i residui di tessuto.
   9. Centrifugare la sospensione cellulare raccolta a 500 xg per 5 min.
   10. Risospendere il pellet in 12 ml di terreno MEEC e mescolare bene.
   11. Settle la soluzione per 5 minuti per separare restante MESC mediante sedimentazione per gravità.
   12. Rimuovere con attenzione le superiori 2 mL utilizzando una pipetta da 5 ml.
   13. Centrifugare la suspensio cellularen a 500 xg per 5 min.
   14. Risospendere in media MEEC pipettando gentilmente su e giù.
   15. Piastra le cellule su vetrini collagene rivestite con la densità desiderata per ulteriori esperimenti (Figura 2a).
   16. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5% per almeno 12 h.
       NOTA: per immunocolorazione o esperimenti funzionali come l'imaging di calcio a fluorescenza, si consiglia di placcare le cellule direttamente sui vetrini, mentre semina in un 6-pozzetti è consigliato quando l'RNA o proteine ​​isolamento è desiderato. Isolamento di cellule stromali endometriali topo è diviso in due giri come la purezza delle cellule dopo una sola digestione può essere insufficiente. Gli uteri sono digeriti due volte per un recupero cellulare ottimale e la purezza. In entrambi i turni gli interventi tecnici sono identici. Le cellule raccolte da entrambi i turni possono essere conservati per ulteriori esperimenti, se lo desideri dal ricercatore.
4. Mouse endometriale Strcellulare OMAL (MESC) Cultura: 1 ^° Turno
   1. Prima dell'inizio del primo turno digestione, preparare una seconda miscela di digestione sciogliendo 300 ml di 1 mg / ml di collagenasi magazzino in 2,7 ml di soluzione 0,05% tripsina-EDTA. Questo mix è necessaria nella fase 4.4.8.
   2. Preparare tre piccole piastre di Petri con il freddo (4 ° C) HBSS 3 x 15 mL con 3 ml di terreno MESC (tubo X1, X2 e X3) + e.
   3. Dopo 30 min di incubazione, agitare la soluzione tripsina uteri contenente delicatamente per 10 s. cellule Mesc si staccheranno dal tessuto uterino e rimarranno nella soluzione tripsina.
   4. Trasferire il uteri alla prima piastra di Petri contenente 3 ml di freddo (4 ° C) HBSS + e risciacquare bene.
   5. Aggiungere 3 ml di terreno MESC alla provetta contenente in origine le corna uterine (tubo in fase 4.4.3) di inibire l'attività tripsina.
   6. Trasferire il uteri dalla piastra di Petri con il freddo (4 ° C) HBSS + per tubo X1 contenente 3 ml di terreno MESC e agitare delicatamente per 10 s.
   7. Ripetere i punti 4.4.4 (trasferimento in una capsula di Petri con il freddo (4 ° C) HBSS +) e 4.4.6 (trasferimento di X2 e X3 tubo) due volte.
      NOTA: Per concludere, questo protocollo si tradurrà in 4 sospensioni cellulari: una provetta contenente la soluzione tripsina e 3 tubi con terreno contenente MESC MESC (tubi X1, X2 e X3).
   8. Trasferire uteri nel nuovo digestione MESC, come descritto nel passaggio 4.4.1 e incubare per 30 min a 37 ° C, in verticale.
   9. Raccogliere le cellule stromali passando quattro sospensioni cellulari attraverso una maglia di nylon 40 micron. Risciacquare la rete con altri 5 ml di MESC.
   10. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 7 minuti.
   11. Risospendere il pellet in MESC e piatto su vetrini PLL-rivestite per ulteriori esperimenti con la densità desiderata.
   12. Incubare per un minimo di 4 - 6 h o O / N a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%.
5. Mouse endometriale stromale cellulare (MESC) Cultura: 2 ^° Turno
   1. Preparare tre piccole piastre di Petri con il freddo (4 ° C) HBSS 3 x 15 mL con 3 ml di terreno MESC (Tubi Y1, Y2 e Y3) + e.
   2. Ripetere i punti 4.4.3 - 4.4.7.
   3. Trasferire l'ultima sospensione cellulare insieme cervice ad una rete di nylon 40 micron.
   4. Raccogliere le cellule stromali passando il contenuto del tubo Y1, Y2 e Y3 attraverso la maglia di nylon. Risciacquare la rete con altri 5 ml di MESC.
   5. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 7 minuti.
   6. Risospendere il pellet in media MESC e piastra su vetrini PLL-rivestite per ulteriori esperimenti (Figura 2b).
   7. Incubare per un minimo di 4 - 6 ore a 37 ° C con 5% di CO _2.
      NOTA: per immunocolorazione o esperimenti funzionali come l'imaging di calcio a fluorescenza, si consiglia di placcare le cellule su vetrini, mentre semina in un 6-pozzetti è consigliato quando l'RNA o proteine ​​isolamento è desiderato.

5. Vimentin/ Citocheratina doppia colorazione per la convalida dei MEEC pura e culture Mesc

1. Seme le cellule su vetrini.
2. Lavare 3 x 5 min con PBS contenente calcio e magnesio su agitatore orbitale (50 rpm).
3. Fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) (ATTENZIONE!) Per 10 minuti, non su agitatore.
4. Lavare 3x con PBS senza calcio e magnesio su agitatore (50 rpm).
5. Permeabilize le cellule con 0,2% Triton X-100 per 10 minuti su un agitatore (50 rpm).
6. Lavare 3x con PBS su un agitatore.
7. Block con siero 5% di capra (GS) in PBS per 2 h in un agitatore (50 rpm)
8. Incubare le cellule con anticorpi monoclonali di coniglio anti-vimentina umana (1: 500) e monoclonale di topo pancytokeratin anti-umano (1: 1.000) a 4 ° C in un agitatore (50 rpm). Gli anticorpi sono diluiti in PBS con 0,5% GS.
9. Lavare 3x con PBS in un agitatore (50 rpm).
10. Incubare le cellule con anticorpi secondari (1: 1.000 in 0,5% GS) Alexa Fluor 488 coniugato IgG anti-coniglio e Alexa Fluor 488-conjugated IgG anti-topo su un agitatore.
11. Lavare 3x con PBS su un agitatore.
12. Montare i vetrini con mezzo di montaggio acquoso contenente DAPI e O secca / N.
13. Sigillare i vetrini con smalto e continuare a 4 ° C per un ulteriore uso (Figura 2a, b).

6. In Vitro decidualizzazione in un sistema coculture

NOTA: quattro a cinque animali sono tenuti a stabilire un sistema di co-coltura in una piastra da 24 pozzetti. Continuare con il seguente protocollo in un ambiente sterile, preferibilmente sotto una cappa a flusso laminare.

1. Preparare gli inserti di coltura cellulare durante la centrifugazione e / o incubazione fasi del isolamento delle cellule epiteliali (come descritto in 4.3) in una piastra da 24 pozzetti aggiuntivo.
   1. Aggiungere 200 - 400 ml di mezzo MESC nella quantità desiderata di pozzetti della piastra da 24 pozzetti.
   2. Mettere gli inserti nei preriempite 24 pozzi con pinza sterile.
2. Risospendere il pellet MEEC(Volume di lavoro: 150 - 300 ml per inserto) (passo 4.3.14) in media MEEC e si dividono nel corso degli inserti. Coltivare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%.
3. Seme le cellule stromali in un altro 24-pozzetti (compatibile con gli inserti colture cellulari) dopo il secondo turno di isolamento delle cellule stromali (fase 4.5.6). Utilizzare un volume di lavoro di 400 microlitri sospensione cellulare per pozzetto.
4. Lasciare le cellule stromali di allegare per almeno 4 - 6 ore a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%.
5. Trasferire gli inserti di coltura cellulare coperti con le cellule epiteliali dal primo 24-pozzetti nel secondo 24-pozzetti coperti da cellule stromali. Utilizzare pinze sterilizzate o toccare gli inserti solo ai loro piedi impiccagione.
6. Cultura le cellule a 37 ° C in 5% CO ₂ incubatore per un periodo da 3 - 5 d finché le cellule epiteliali formano un monostrato e le cellule stromali soddisfare l'80 - 90% di confluenza. Inoltre, utilizzare il Transepithelial Resistenza elettrica (TEER)monitorare il monostrato epiteliale mediante l'uso di un misuratore epiteliale Volt / Ohm come descritto da Grant et al. ^7. I valori di 800-1000 / pozzetto sono stati sufficienti a considerare l'confluenti monostrato epiteliale.
7. Se necessario, sostituire la media ogni 2 - 3 d utilizzando pipette di vetro o puntali sottili. Iniziare con la sostituzione del mezzo delle cellule stromali (seminate in basso), prima di sostituire il mezzo negli inserti. Si raccomanda di utilizzare preriscaldato mezzo di coltura cellulare a 37 ° C.
8. Preparare il supporto decidualizzazione per indurre in decidualizzazione vitro prima di iniziare l'esperimento. Utilizzare un volume di lavoro di 400 microlitri per pozzetto di cellule stromali.
   1. Preparare le seguenti soluzioni madre e aliquote conservare a -20 ° C.
      1. Preparare 250 pM medrossiprogesterone 17-acetato (MPA) in etanolo.
      2. Preparare 100 Soluzione mm 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-cAMP in acqua ultrapura.
   2. Rendere il medium deciduali contenente 1 mM MPA e 0,5 mM cAMP nel medio MESC contenente il 2% FBS.
9. Rimuovere delicatamente il supporto dai pozzi e aggiungere il supporto deciduali sulle cellule stromali. Se è necessaria una condizione di controllo, utilizzare il mezzo MESC contenente il 2% FBS.
10. Rimuovere il supporto dagli inserti di coltura cellulare e aggiungere 300 ml di media MEEC sulle celle.
11. Incubare le cellule per 5 d in un incubatore a 37 ° C in 5% CO _2.
12. Dopo il quinto giorno, valutare il grado di decidualizzazione nelle cellule stromali mediante RT-qPCR (vedi sotto).
13. Convalidare la vitalità delle cellule epiteliali utilizzando il reagente fattibilità resazurina-based.
    1. Preparare una soluzione 1:10 di reagente viabilità in media MEEC.
    2. Trasferire gli inserti di coltura cellulare in un nuovo 24-pozzetti.
    3. Aggiungere 150 - 300 ml di reagente fattibilità - soluzione MEEC sulle celle.
    4. Incubare a 37 ° C in CO ₂ 5% per un periodoalmeno 4-5 ore o durante la notte e di valutare la vitalità cellulare osservando un cambiamento di colore (blu al viola / rosa).
       NOTA: decidualizzazione può anche essere valutata utilizzando un mouse prolattina-specifici ELISA, come preferito dal ricercatore.

7.Validation di decidualizzazione da qRT-PCR

NOTA: Per validazione del decidualizzazione da qRT-PCR, si raccomanda di eseguire tutte provini condizioni in duplicato per ricevere una quantità sufficiente di cellule per l'analisi dell'RNA.
RT-PCR quantitativa viene eseguita come descritto in precedenza in De Clercq et al. ^8.
In breve:

1. Isolare l'RNA totale utilizzando un kit di isolamento di RNA commerciale.
   1. Valutare la quantità e la qualità del RNA utilizzando metodi commerciali secondo il protocollo del produttore, rispettivamente.
2. Sintetizzare cDNA, secondo il protocollo del produttore a partire dal 1 mg di RNA totale.
3. Utilizzare un kit commerciale secondo il protocollo del produttore per effettuare la reazione di qRT-PCR.
   1. Eseguire tutti i campioni in triplice copia.
   2. Fare uso del commerciale TaqMan Master Mix e sonde TaqMan specifiche per i geni housekeeping desiderati e prolattina (prl8a2) per effettuare la reazione.

Risultati

Panoramica generale del protocollo

La figura 1A illustra una panoramica generale del protocollo. Una iniezione giornaliera di E2 (100 ng) per tre giorni consecutivi è stato utilizzato per sincronizzare gli animali e standardizzare la fase del ciclo estrale. Il ciclo estrale può essere valutata da lavande vaginali ed è diviso in proestrus, estro, diestrus, e la fase metestrus. La fase di ciclo può essere designato in base al rapporto di cellule desquamate nel lavaggio, che sono soggetti a variazioni ormonali. L'aumento dei livelli di estrogeni renderà gli animali si evolvono alla fase di estro. Questa fase può essere facilmente rilevato dalla presenza di cellule epiteliali corneo esclusivamente e l'assenza di leucociti (Figura 1B). Il giorno 4, uteri di animali che si trovano in fase di estro sono raccolti e MEEC e MESC sono isolati (Figura 1C). decidualizzazione cun essere indotta aggiungendo 0,5 mM cAMP e 1 pM MPA al mezzo FBS 2% nel corso di un periodo di incubazione di 5 d.

Controllo Qualità di MEEC e Mesc Culture

La purezza delle colture cellulari primarie può essere valutato dalla differenza di espressione vimentina e citocheratina. Vimentina è un filamento intermedio che viene espresso in cellule mesenchimali, quindi nelle cellule stromali endometriali. Citocheratina è un filamento intermedio trovato nel citoscheletro di tessuto epiteliale. La figura 2A mostra il livello di espressione di mRNA di vimentina e citocheratina in MEEC e MESC valutata utilizzando qRT-PCR. livelli Vimentin sono ricchi di MESC e povera di MEEC (2.2x superiore, p <0.001), mentre i livelli di citocheratina sono ricchi di MEEC e povera di MESC (36x superiore, p <0.001). A vimentina / citocheratina doppia colorazione è stata eseguita e ha indicato che le cellule stromali esprimono vimentina mentre epitcellule helial esprimono citocheratina (Figura 2B, C). L'assenza di anticorpo primario è stato usato come controllo negativo per l'immunocolorazione (Figura 2D, E). Queste colorazioni immunoistochimiche dimostrare che entrambe le colture di cellule endometriali (MEEC e Mesc) hanno una purezza fino al 90%.

Decidualizzazione in MEEC / Mesc co-colture

Dopo l'isolamento, le cellule endometriali mouse e stromali sono state seminate in un sistema di co-coltura di imitare l'ambiente endometriale. Le cellule sono state coltivate fino a quando le cellule epiteliali formano un monostrato nell'inserto coltura cellulare (valori TEER di 800 - 1.000 / pozzetto), e le cellule stromali raggiunto uno stato sub-confluenti. Decidualizzazione stata indotta nelle cellule stromali con l'applicazione di 0,5 mM cAMP e 1 pM MPA. Dopo cinque giorni di incubazione, i livelli di mRNA di prolattina sono stati valutati nelle cellule stromali da qRT-PCR come indicazione per decidualization (Figura 3A). I livelli di prolattina erano altamente espresso in cellule sottoposte agli ormoni e non rilevabili in cellule incubate con il mezzo di controllo (p <0.01).

Poiché le cellule epiteliali sono difficile da visualizzare all'interno degli inserti di coltura cellulare, un test di vitalità è stata eseguita immediatamente dopo il periodo di incubazione di cinque giorni (Figura 3B). Una miscela di normale mezzo di crescita e un reagente redditività è stato aggiunto ai pozzetti e incubato per un periodo di minimo da 8 - 12 h. Il cambiamento di colore dal blu al rosa brillante ha indicato la presenza di cellule epiteliali vitali. Si noti che il cambiamento di colore si verifica solo quando le cellule vitali sono presenti.

Figura 1: panoramica generale del protocollo. (A) Schema del protocollo di isolamento a partire da tregiorni consecutivi di iniezioni di estrogeni. Il giorno 3, i preparativi necessari dovrebbero essere preparati. Il giorno 4, fase di estro viene valutata (indicato dalla stella) eseguendo una lavanda vaginale. MESC e MEEC sono isolate utilizzando diverse fasi di digestione. Il giorno 6, o quando le cellule sono confluenti, decidualizzazione può essere indotto nel sistema di co-coltura con l'aggiunta di cAMP e MPA al mezzo e un periodo di incubazione di cinque giorni (giorno 6 - 11). (B) immagine rappresentativa della fase estrus caratterizzata dalla presenza di cellule epiteliali cornified nella lavanda vaginale (ingrandimento 10X). (C) quadro rappresentativo di MESC e MEEC (ingrandimento 20X, barra della scala: 100 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immunocolorazione e RT-PCR quantitativa per Vimentina e Citocheratina in MEEC e MESC. (A) i livelli di RNA messaggero di espressione vimentina e citocheratina per indicare la purezza delle culture. i livelli di RNA sono stati relativamente quantificati per la media geometrica dei geni housekeeping ACTB e TBP. I dati sono stati mostrati come media ± SEM. Vimentin / citocheratina doppia colorazione sulle culture Mesc (B) e le culture MEEC (C). Inserire nella sinistra mostra una vista di ingrandimento 63X. Controllo negativo con l'anticorpo primario omesso per MESC (D) e MEEC (E) (bar Scala: 50 micron). ***: P <0,001 con due vie ANOVA con correzione di Bonferroni per test multipli. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Validazione dei decidualizzazione tramite RT-PCR. Livelli (A) di mRNA di espressione prolattina nelle cellule stromali per valutare decidualizzazione. i livelli di RNA sono stati relativamente quantificati per la media geometrica dei geni housekeeping PGK1 e TBP. Il cambiamento volte in cellule coltivate in controllo o media deciduali è mostrato come media ± SEM. (B) le immagini illustrative di cellule stromali prima (in alto) e dopo (in basso) decidualizzazione stimolo. L'inserto a destra illustra un ingrandimento di una cellula stromale decidualized. Decidualizzazione è caratterizzata dalla presenza di cellule multinucleate, indicato dalle frecce nere. (C) Immagini rappresentative della valutazione della vitalità delle cellule epiteliali nell'inserto dopo il test. Le foto sono state scattate subito dopo la somministrazione del reagente vitalità (Prestoblue) (0 h) e la Fsusseguente mattina (ON). **: P <0,01 con test di Mann-Whitney U. ON: durante la notte. barra della scala: 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Decidualizzazione è la differenziazione progesterone-dipendente delle cellule stromali endometriali in cellule secernenti deciduali turno. Nell'uomo, questo processo avviene spontaneamente durante la fase luteale del ciclo mestruale e viene iniziato nelle cellule stromali che circondano le cellule vascolari per formare il predecidua. Tuttavia, nei roditori, la presenza di una blastocisti è indispensabile per indurre decidualizzazione. Il fatto che decidualizzazione avviene solo dopo il contatto con le cellule epiteliali dell'endometrio implica che i fattori importanti sono secreti dalle cellule epiteliali per indurre decidualizzazione nello stroma sottostante. Anche se questa differenza l'avvio del processo di decidualizzazione dovrebbe essere riconosciuto, il fatto che decidualizzazione umano diventa più robusto su impianto dell'embrione suggerisce che meccanismi simili potrebbero essere coinvolti. In vitro colture cellulari sono spesso usati per studiare l'effetto di molecole specifiche durante il processo di decidualizzazione.Tuttavia, la disponibilità e la quantità di tessuto umano che possono essere raccolti è spesso limitato e accompagnati da variazioni, ad esempio, fase del ciclo, numero di gravidanze e presenza di malattie ginecologiche, come l'endometriosi o adenomiosi. Molti di questi problemi possono essere evitati con l'uso di tessuto murino che è facilmente accessibile e fase del ciclo indipendente. Un altro notevole vantaggio dell'utilizzo di tessuto murino è la possibilità di utilizzare roditori geneticamente modificati e la possibilità di impostare un gran numero di esperimenti. Attualmente, molti protocolli di isolamento differenti sono stati descritti in letteratura con elevata variabilità nella età degli animali e il periodo in fase di estro al momento dell'uso.

Questo studio presenta un nuovo metodo per primarie endometriali co-colture di cellule stromali ed epiteliali in cui si è avvalsi di un ciclo estrale standardizzata da una iniezione giornaliera di estrogeni prima dell'isolamento. Inoltre, gli estrogeni è kNown per indurre la proliferazione di cellule epiteliali e stromali che aumenta ulteriormente la resa per isolamento. Il protocollo isolamento descritto in questo documento si basava su Grant et al. ^7, tuttavia, ulteriori passi di ottimizzazione sono stati inclusi per aumentare la resa, la purezza, e la vitalità delle diverse colture cellulari. In primo luogo, HBSS è sempre integrato con antibiotici per evitare la contaminazione della coltura principale. Durante l'isolamento di MEEC, un adattamento della temperatura è stato fatto (15 min a 37 ° C) per aumentare la raccolta delle cellule epiteliali durante la prima digestione. Successivamente, un passaggio aggiuntivo è stato incluso per temperare attività enzimatica dopo tripsina-digestione aggiungendo mezzo contenente FBS per inibire la sua attività. Inoltre, MEECs sono stati passati attraverso un filtro di cui la maglia era più grande di quella che viene comunemente descritto (100 micron), come vengono spesso in raggruppamenti e fogli di cellule. Inoltre, la contaminazione da parte di cellule stromali stato ridotto eseguendo un addpasso transi- in cui MEECs e MESCs sono stati separati basati sulla sedimentazione di gravità. Infine, MEECs sono state seminate su vetrini collagene rivestite per aumentare l'attaccamento delle cellule di vetrini, come è apparso chiaro che l'attaccamento di vetrini non rivestiti o PLL rivestite era insufficiente. Durante l'isolamento dei MESCs, collagenasi (1 mg / mL) è stato integrato per migliorare la digestione. Inoltre, questa fase di digestione è stato eseguito in duplicato per evitare la contaminazione del MEECs rimanenti. Tutti questi passaggi aggiuntivi provocato colture pure e vitali di popolazioni di cellule omogenee.

La purezza della popolazione cellulare è stata valutata con immunocolorazione e qRT-PCR utilizzando vimentina come marcatore stromale e citocheratina come marker epiteliale. Chiaramente, un pattern di espressione opposto di vimentina e citocheratina è stata osservata in MEEC e MESC. Tuttavia, si può notare che l'mRNA espressione relativa di vimentina e citocheratina è simile nelle culture MEEC. similrisultati ar sono pubblicati da altri gruppi di ricerca, in cui le cellule epiteliali in coltura acquisiscono vimentin espressione ^9. Più importante è la differenza di espressione proteica tra vimentina e citocheratina come è stato osservato nelle colorazioni immunoistochimiche delle diverse popolazioni cellulari. Doppia immunoistochimica hanno dimostrato che TEE sono stati positivi per citocheratina ed ESC sono stati positivi per vimentina. L'uso di questi marcatori in immunocolorazione è un metodo consolidato e come standard usato per indicare i tipi cellulari ^10.

Anche se un sacco di ricerca è stata eseguita sul decidualizzazione di MESC, rimane la possibilità che la presenza di cellule epiteliali in questo modello può alterare i risultati di decidualizzazione. In primo luogo, è stato dimostrato che se MEEC crescere ad un monostrato in presenza di medie MESC condizionata o in un ambiente di co-coltura, il monostrato ha una resistenza elettrica migliorata epiteliale transepiteliale cella (TEER), derivanti da fattori secreti dal MESC ^7. Inoltre, Pierro et al. ¹¹ dimostrato che la proliferazione epiteliale, influenzato da 17β-estradiolo, potrebbe essere mediata da fattori secreti dalle cellule stromali, e in alternativa, le cellule epiteliali possono rilasciare fattori che modulano stromale decidualizzazione ^{12, 13.} Nel complesso, è chiaro che l'ambiente co-coltura epitelio-stromale fornisce una situazione più fisiologico che consente l'interazione paracrino e comunicazione. Il metodo di coltura due tipi cellulari diversi utilizzando un sistema di co-coltura inserto è stato descritto in precedenza ^{14, 15} ed è stato adattato per l'uso di cellule primarie murine. Per la rilevazione dei livelli di prolattina mRNA come lettura per decidualizzazione, la tecnica descritta ha una riproducibile lettura per decidualizzazione disponibili e consentires così lo studio del rapporto epitelio-stromale durante decidualizzazione. segnali paracrini mediati da MEEC potrebbero alterare la portata delle decidualizzazione nelle cellule stromali. Inoltre, il modello consente specifica modulazione del lato epiteliale senza influenzare direttamente le cellule stromali. Pertanto, questa co-coltura di MEEC e MESC offre uno strumento ideale per valutare l'effetto degli ormoni, citochine, ecc su cellule epiteliali con un read-out sul stromale decidualizzazione. Un altro vantaggio di questo sistema di co-coltura è che permette ai ricercatori di indagare il coinvolgimento di una proteina specifica nel decidualizzazione processo sia nel epiteliale o compartimento stromale utilizzando cellule isolate da animali transgenici. Inoltre, questa tecnica sarà molto utile per indagare adesione blastocisti di valutare se fattori paracrini secreti dalle cellule epiteliali in presenza di una blastocisti sono sufficienti ad indurre decidualizzazione del stromale sottostantecellule. Un passo importante in trofoblasto invasione correlata alla degradazione della matrice extracellulare, che è mediata dall'azione degli enzimi proteolitici. La tecnica proposta può essere applicato come un modello in vitro per studiare il cross-talk tra blastocisti, le cellule epiteliali e lo stroma di sostegno.

Tuttavia, al momento poco si sa circa l'origine delle cellule epiteliali che possono essere così luminale come ghiandolare. Pertanto, è necessaria un'ulteriore caratterizzazione del profilo genetico e molecolare delle cellule epiteliali. Inoltre, il metodo descritto è limitato nella conoscenza disponibili sulla polarizzazione delle cellule epiteliali. Al momento, la polarizzazione delle cellule epiteliali non è stata presa in considerazione. Tuttavia, differenze di espressione di proteine ​​di membrana sono descritte nelle membrane apicali e basali. la polarizzazione non appropriato dello strato epiteliale potrebbe avere un impatto sulla interazione tra paracrino epitheliAl e cellule stromali. Tuttavia, i metodi per ottenere cellule epiteliali polarizzate è stato descritto e potrebbero essere incluse nella tecnica descritta ^{15, 16.}

Complessivamente, il protocollo descritto propone una tecnica per stabilire con successo colture cellulari primarie di topo epiteliali endometriale e cellule stromali. Questa tecnica si traduce in colture cellulari pure come confermato da qRT-PCR e immunostaining di vimentina e citocheratina. In definitiva, un epiteliale e stromale co-coltura è stata introdotta che consente la ricerca di segnali paracrini mediati da uno MEEC e / o MESC nel processo decidualizzazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ThinCert Inserto per colture tissutali per piastre a 24 pozzetti; 1 µ m dimensione dei pori; Gli	Greiner Bio-one	662610	sono forniti anche per altre piastre multipozzetto e/o altre dimensioni dei pori. Altri fornitori: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/
Nunc Piastre a 24 pozzetti trattate con coltura cellulare	Thermo Scientific	142475	http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475
8-Bromoadenosina 3′,5′-sale sodico monofosfato ciclico	Sigma Aldrich	B7880	Preparare una soluzione madre di 100 mM in acqua Milli Q. Conservare le aliquote a -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en®ion=BE
Medrossiprogesterone 17-acetato	Sigma Aldrich	M1629	Preparare una soluzione madre di 250 µ M in etanolo. Conservare le aliquote a -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en®ion=BE
Olio di Arachis	Supermercato		utilizzato l'olio di arachide da cucina standard che si trova in ogni supermercato
Reagente per la vitalità cellulare PrestoBlue	Thermo Scientific	A13261
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1 HBSS 1x, senza calcio, senza magnesio, senza fenolo rosso	Gibco	14175-046	Conservare in frigo il più a lungo possibile. Utilizzare HBSS+ freddo durante il protocollo. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046
17-β Estradiolo	Sigma Aldrich	E8875	Preparare una soluzione madre di 1 mg/mL in EtOH prima di diluire in olio di arachide (1:1.000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en& region=BE
Filtro per mezzo cellulare Stericup, 0.22 µ m, polietersulfone, 500 mL, SCGPU05RE	Merck Millipore
http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE Penicillina-Streptomicina (5.000 U/mL)	Gibco	15070-063	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063
DMEM/F12, rosso fenolo, L-glutammina, HEPES	Gibco	11330-032	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057
Siero fetale bovino, qualificato, inattivato termicamente, approvato dall'UE, Sud America Origine	Gibco	10500-056	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064
Amfotericina B	Gibco	15290-018	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018
Gentamicina (50 mg/mL)	Gibco	15750-037
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037 DMEM, basso glucosio, piruvato, senza glutammina, senza rosso fenolo	Sigma	Aldrich D5921	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en®ion=BE
MCDB-105	Sigma Aldrich	M6395	Diluire in acqua Milli Q, regolare il pH a 7 con NaOH e filtrare prima dell'uso. Conservare al buio. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en®ion=BE
Insulina da pancreas bovino	Sigma Aldrich	I1882	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en®ion=BE
Vetrini, vetro, 18 mm Ø	Glaswarenfabrik Karl Hecht	1001/18	http://www.hecht-assistant.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 & tx_rmproducts_pi1[p]=3504 & tx_rmproducts_pi1[v]=20088 & cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06
Poli-L-lisina	Sigma Aldrich	P2636	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en®ion=BE
Collagenasi tipo IA da Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C2674	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en®ion=BE
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190-094	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094
Tripsina da pancreas bovino	Sigma Aldrich	T7409	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en®ion=BE
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo	Gibco	25300-054	Caldo a temperatura ambiente prima dell'uso. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054
Filtro cellulare, 40 & micro; m mesh, monouso	BD Falcon	352340	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Filtro cellulare, 100 &; m mesh, monouso	BD Falcon	352360	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Millex-GP Unità filtro siringa, 0,22  µ m, polietersulfone, 33  mm, sterilizzato a raggi gamma	Merck Millipore	SLGP033RS	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1
Acido acetico (glaciale) 100%	Merck Millipore	1.00063	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063
Collagene I	Corning	354236	Da coda di topo. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29#
Pancreatina da pancreas suino	Sigma Aldrich	P3292	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en®ion=BE
35 mm Piastre per colture tissutali, Polistirene, Sterile	BD Falcon	353001	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630
Etanolo assoluto AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. reagente analitico	VWR Chemicals	20821296	https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP
vimentina monoclonale di coniglio anti-umana (D21H3)	Tecnologia di segnalazione cellulare	#5741	Utilizzare 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741
monoclonale di topo anti-citocheratina pan-umana	Sigma Aldrich	C2562	Utilizzare 1/1.000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en& region = BE
Soluzione di paraformaldeide, 4% in PBS	Affymetrix	19943	http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en®ion=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ
Siero di capra	Sigma	Aldrich G9023	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en®ion=BE
Capra anti-coniglio Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-11034	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;; generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;; coniugati:^\%22Alexa%20Fluor& registr;%20488\%22$;;
Anti-topo di capra Alexa Fluor 594	Thermo Scientific	A-11032	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2: \%22Capra%20hircus\%22;; generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;
Mezzo di montaggio VECTASHIELD con DAPI	Vector Laboratories	H-1200
http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html DPBS, con 14040174	Gibco		magnesio https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133

inserti Viene radio-sterilizzato di calcio e