Analizzando Synaptic Modulazione di Drosophila melanogaster Fotorecettori dopo l'esposizione alla luce prolungata

Atsushi Sugie; Christoph Möhl; Satoko Hakeda-Suzuki; Hideaki Matsui; Takashi Suzuki; Gaia Tavosanis

doi:10.3791/55176

Articolo metodologico

Analizzando Synaptic Modulazione di Drosophila melanogaster Fotorecettori dopo l'esposizione alla luce prolungata

DOI:

10.3791/55176

⸱

10 febbraio 2017

Atsushi Sugie¹^,²^,⁵ , Christoph Möhl³ , Satoko Hakeda-Suzuki⁴ , Hideaki Matsui¹^,² , Takashi Suzuki^*⁴ , Gaia Tavosanis^*⁵

¹Department of Neuroscience of Disease, Center for Transdisciplinary Research, Niigata University, ²Brain Research Institute, Niigata University, ³Image and Data Analysis Facility, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), ⁴Graduate School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology (Titech), ⁵Dendrite Differentiation, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui mostriamo come quantificare il numero e la distribuzione spaziale delle zone attive sinaptiche In Drosophila melanogaster fotorecettori, evidenziata con un marcatore molecolare geneticamente codificato, e la loro modulazione dopo una prolungata esposizione alla luce.

Abstract

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Il sistema nervoso ha la notevole capacità di adattarsi e rispondere a vari stimoli. Questa regolazione neurale è ottenuto tramite la plasticità a livello sinaptico. La zona attiva (AZ) è la regione a livello della membrana presinaptica che media il rilascio dei neurotrasmettitori ed è composto da un insieme denso di proteine ponteggi. AZS di Drosophila melanogaster (Drosophila) fotorecettori subisce rimodellamento molecolare dopo una prolungata esposizione alla luce ambientale naturale. Così il livello di attività neuronale in grado di riorganizzare la composizione molecolare del AZ e contribuire alla regolazione della potenza funzionale.

A partire dalla esposizione alla luce di set-up preparazione alla immunoistochimica, questo protocollo dettagli come quantificare il numero, la distribuzione spaziale, e il livello di delocalizzazione delle molecole sinaptiche a AZS in fotorecettori Drosophila. Utilizzando l'analisi delle immagini software, grappoli della componente GFP-fuso AZ Bruchpilot sono stati identificati per ogni fotorecettore R8 (R8) terminale degli assoni. macchie Bruchpilot rilevati sono stati assegnati automaticamente ai singoli assoni R8. Per calcolare la distribuzione di frequenza posto lungo l'assone, abbiamo implementato un personalizzato software plugin. start-point di ogni assone e end-point sono stati definiti manualmente e la posizione di ciascun punto Bruchpilot stati proiettati sulla linea di collegamento tra inizio e fine-point. Oltre al numero di cluster Bruchpilot, abbiamo anche quantificato il livello di delocalizzazione Bruchpilot-GFP all'interno dei cluster. Queste misure riflettono in dettaglio le dinamiche sinaptiche spazialmente risolti in un singolo neurone in diverse condizioni ambientali agli stimoli.

Introduzione

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La modulazione della funzione sinaptica contribuisce alla notevole capacità del sistema nervoso di rispondere o adattarsi alle mutevoli stimoli ambientali precisione. Regolazione della probabilità di rilascio delle vescicole presinaptico è un modo per controllare la forza sinaptica ^1. Rilascio delle vescicole sinaptiche hanno luogo presso la zona attiva (AZ), una regione specializzata della membrana presinaptica ^2. L'AZ è caratterizzato da una cassetta di proteine specifiche ^{^3,} ^4. La maggior parte delle proteine che contribuiscono alla AZ di montaggio ....

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Protocollo

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Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo si riferiscono a lavori esclusivamente con Drosophila e non sono soggetti alle leggi sul benessere degli animali in Germania e Giappone.

1. Condizioni espozione

Preparare le mosche che portano sensless-flippase (sens-FLP) e Bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) ¹⁵ per la visualizzazione di BRP-GFP in fotorecettori neuroni R8 (R8s). Il BRP codifica locus genomico all'interno di un cromosoma artificiale batterico (BAC) è stato modificato per generare questo costrutto BRP-FSF-GFP. ....

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Risultati

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L'occhio composto di Drosophila comprende ~ 780 ommatidi, ciascuna contenente otto tipi di fotorecettori (R1-8). R7 e R8 progetto loro assoni alla seconda ganglio ottico, midollo, dove formano sinapsi strati M6 e M3, rispettivamente, ^26. Per studiare l'effetto dell'esposizione prolungata alla luce sulla composizione molecolare dei fotorecettori zone attive R8, abbiamo approfittato del metodo STaR ^15. Livelli di espressione endogena.......

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Discussione

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In questo studio, abbiamo mostrato come preparare le condizioni di luce per esporre le mosche a un'intensità di luce uguali. Abbiamo quantificato non solo il numero di un puncta marcatore sinaptica, ma potrebbe anche spazialmente risolvere la densità delle sinapsi lungo gli assoni e misurare il livello di delocalizzazione della proteina marcatore nelle zone citoplasmatici. Questi tre valutazioni ci permettono di valutare i dettagli di dinamiche sinaptiche a livello dei neuroni singolo in diverse condizioni ambiental.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Siamo grati a T. Stürner per correzioni utili, discussioni e commenti sul manoscritto; SL Zipursky per la fornitura di scorte Fly; M Scholling per eseguire l'elaborazione delle immagini. Parte della analisi delle immagini è stata effettuata presso il laboratorio di A. Kakita. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Alexander von Humboldt e JSP borse per la ricerca all'estero (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Gli aiuti Grant-In- per start-up (24.800.024), su aree innovative (25.110.713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi Sankyo-, Fondazioni Toray (TS), finanziamento di base DZNE (GT) e DZNE luce Microscopia Facility (CM).

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fiala	Hightech, Giappone	MKC-20
Plug	Thermo Fisher Sciehtific, USA	AS-275
Cremagliera trasparente personalizzata in resina acrilica	Shin-Shin Corporation, Giappone		un'altezza di 41 cm, una base di 21 cm, uno spessore di 4 cm e un'altezza di 13 cm per ogni gradino
Incubatrice fredda	MITSUBISHI ELECTRIC, Giappone	CN-40A
Pannello LED	MISUMI, Giappone	LEDXC170-W
Misuratore di luce digitale	CEM	DT-1301
Fly pad	Tokken, Giappone	TK-HA03-S
Piastra di Petri (35 x 10 mm)	Greiner Bio-One International, Germania	627102
Compressa PBS	Takara, Giappone	T900
Triton X-100	Wako, Giappone	160-24751
Dumont #5 Pinze	Fine Science Tools	11251-20
Provetta da 1,5 mL	Sarstedt, Germania	A. 152X
Formaldeide 16%	NEM, Giappone	3152
Pipetman P-200	Gilson	F123601
Pipetman P-20	Gilson	F123600
Pipetman P-2	Gilson	F144801
anticorpo anti-chaoptin	DSHB	24B10
Alexa568-coniugato anticorpo di topo	Life Technologies	A-11031
VECTASHIELD Montaggio medio Vector	Laboratories, Inc.	H-1000
(76 x 26 mm)	Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germania
Vetrino coprioggetti (18 x 18 mm, 0,17 mm)	Zeiss, Germania	474030-9000-000
Microscopi industriali	Olympus, Giappone	SZ61-C-SET
Stereomicroscopio Illuminazione	Olympus, Giappone	KL 1600 LED
microscopia confocale	Zeiss, Germania	LSM780
Imaris	Bitplane, Svizzera		Versione 7.6.4 o superiore
Matlab	The MathWorks, Inc., USA
Excel per Mac	Valentina

Vetrino per microscopio

Riferimenti

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Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "....

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Ristampe e permessi

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Fotorecettori di Drosophila Analisi della zona attiva Quantificazione di Bruchpilot Protocollo di immunoistochimica Software di analisi delle immagini Metodo di rilevamento dei spot Misurazione dell orientamento assonale Valutazione della plasticit sinaptica Effetti dell esposizione alla luce

Analizzando Synaptic Modulazione di Drosophila melanogaster Fotorecettori dopo l'esposizione alla luce prolungata

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