La restenosi dopo procedure cardiovascolari (chirurgia bypass, angioplastica o stenting) è un problema significativo che riduce la durata di queste procedure. Una terapia ideale potrebbe inibire la proliferazione delle cellule muscolari lisce (VSMC), promuovendo la rigenerazione dell'endotelio. Descriviamo un modello per la valutazione simultanea della proliferazione VSMC e della funzione endoteliale in vivo.
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Articolo metodologico
Lesione aortica di crusca a murina: un efficace
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ricostruzione arteriosa, sia in caso di angioplastica che di intervento di bypass, comporta traumi iatrogeni che provocano disturbi endoteliali e proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC). I modelli murini comuni studiano piccole vasi come le arterie carotide e femorali. Qui descriviamo un sistema in vivo in cui sia la proliferazione VSMC che la funzione di barriera endoteliale possono essere valutate contemporaneamente in un grande recipiente. Abbiamo studiato la risposta aortica infrarenale alla lesione nei topi C57BL / 6. L'aorta è stato ferito dalla vena renale sinistra alla biforcazione aortica da 30 crush transmural di durata di 5 secondi con un applicatore a cotone. I cambiamenti morfologici sono stati valutati con l'istologia convenzionale. Lo spessore della parete aorta è stato misurato dalla superficie luminare all'adventitia. L'integrazione di EdU e la colorazione di contatori con DAPI e l'alpha-actina è stata utilizzata per dimostrare la proliferazione del VSMC. L'attivazione di ERK1 / 2, un moderatore noto della formazione di iperplasia intima, è stato scoraggiatoEstratti da Western Blot. L'effetto dell'infiammazione è stato determinato da immunohistochemistry per le cellule B, le cellule T e macrofagi . Le sezioni di endotelio sono state visualizzate con la microscopia elettronica a scansione (SEM). La funzione di barriera endoteliale è stata determinata con la colorazione Evans Blue. La lesione transmurale ha provocato l'ispessimento della parete aortica. Questa lesione ha causato la proliferazione del VSMC, soprattutto 3 giorni dopo la lesione e l'attivazione precoce di ERK1 / 2 e la diminuzione della espressione p27 kip1. La lesione non ha determinato l'aumento delle cellule B, delle cellule T o dell'infiltrazione dei macrofagi nella parete del vaso. La lesione ha causato denudazione parziale della cellula endoteliale e la perdita del contatto cellulare. La lesione ha causato una significativa perdita di funzione barriera endoteliale, che è tornata alla base dopo sette giorni. Il modello di lesioni aortiche blasfonde trasversali murine fornisce un sistema efficace per studiare contemporaneamente sia la proliferazione VSMC che la funzione di barriera endoteliale in un grande recipiente.
Introduzione
La restenosi Seguendo procedure cardiovascolari (chirurgia bypass, angioplastica o stenting) è un problema significativo riducendo la durata di queste procedure. Tutte le procedure di rivascolarizzazione sono afflitte da restenosi. Le strategie presenti per prevenire la restenosi (stent che eluiscono farmaci e palloni rivestiti di droga) inibiscono sia la cellula muscolare liscia vascolare (VSMC) che la proliferazione delle cellule endoteliali (EC). Di conseguenza, questi interventi prevengono la restenosi mediata dal VSMC, ma impediscono anche la rigenerazione dell'endotelio. Senza un endotelio intatto, i pazienti devono essere su potenti agenti antiagglomeranti per ridurre il rischio di trombosi in situ a rischio di complicazioni emorragiche. Una terapia ideale inibirà la proliferazione del VSMC, promuovendo la rigenerazione dell'endotelio. Pertanto, vi è la necessità di studiare simultaneamente la proliferazione VSMC e la funzione di barriera endoteliale i n vivo .
Attualmente, ci sono severModelli di topo restenosi 1 . Questi modelli includono lesioni carotide e lesioni del filo femorale 2 . I modelli aortici includono il posizionamento dello stent 3 , la lesione a palloncino 4 e l'allograft aortico 5 . Tutti i modelli presenti sono limitati. La legatura carotide genera una lesione neointimale mediata dal flusso e non ha lesioni endoteliali. Inoltre, le arterie carotide e femorali hanno molte pieghe meno strati cellulari rispetto ai vasi umani, limitando il loro valore traduzionale. L'aorta del topo, che è di circa 1,3 mm di diametro, è l'unica vaso che si avvicina ad un'arteria umana (coronaria) clinicamente rilevante (3).
Nonostante il potenziale di traslazione dei modelli murali aortici della malattia, i modelli correnti hanno limitazioni. Questi modelli richiedono abilità microchirurgiche avanzate e attrezzature specializzate come palloncini e stents per angioplastica. Qui, noi presentiamoUna nuova tecnica riproducibile per indurre contemporaneamente la proliferazione del VSMC e disturbare la funzione di barriera endoteliale.
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Protocollo
Dichiarazione di etica: I protocolli per la manipolazione degli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura degli animali (IACUC) dell'Università del Maryland (protocollo numero 0416009) e condotto secondo gli standard internazionali AAALAC.
1. Procedura chirurgica
- Tecnica anestetica
- Sterilizzare tutti gli strumenti utilizzati per la chirurgia di sopravvivenza con sterilizzazione a vapore a 121 ° C per 30 min.
- Indurre l'anestesia attraverso un serbatoio di induzione con 100% O 2 e 2,5% isoflurano consegnato tramite vaporizzatore di precisione. Post-induzione, interrompere l'isoflurano e sciacquare la camera con O 2 . Mantenere l'anestesia con 1,5-2% di isoflurano tramite maschera e 1 L / min O 2 per inalazione.
- Attaccare sia la camera di induzione e la maschera facciale ad un detergente per carbone per l'assorbimento del gas di scarico per proteggere il personale. Garantire un adeguato livello anestetico da dimostrareChe non vi è risposta a stimoli nocivi (pizzicotto del piede).
- Creare un campo operativo costituito da un vassoio chirurgico con rilievo isotermico per fornire un supporto termico durante l'intervento chirurgico. Un ulteriore pad isotermico fornirà un supporto termico agli animali nella loro gabbia di recupero.
- Preparazione degli animali
- Eseguire la seguente inchiesta sui maschi C57BL / 6 maschi di 10-12 settimane.
- Rimuovere i peli sulla superficie addominale ventrale dell'animale dallo sterno fino alla regione inguinale con un agente depilatore o un tagliatore elettrico con una lama di 40.
- In caso di agente depilatorio, applicare questo composto alla zona chirurgica per 2-3 minuti e poi rimuoverlo con cotone. Utilizziamo un composto commercialmente disponibile di idrossido di calcio e idrossido di sodio.
- Preparare l'area sopra la spalla con alcol al 70% e iniettare sottocutanea carprofen (5 mg / kg) con un ago da 25 gauge o più piccolo. QuestoIl trattamento fornirà analgesia postoperatoria per l'animale.
- Trasferisci l'animale al campo chirurgico e posiziona nella ricostruzione dorsale.
- Preparare il sito chirurgico sciacquando 8-12% di providone-iodio con un applicatore di cotone pulito o garza di cotone. Quindi sciacquare la pelle due volte con alcool al 70%.
- Mettere il lubrificante oculare in entrambi gli occhi per ridurre l'incidenza della desquamazione corneale. Coprire il sito chirurgico con un drappo sterile.
- Tecnica operativa
- Effettuare un'incisione mediana di laparotomia addominale di circa 2-2,5 cm di lunghezza con un bisturi che inizia immediatamente caudale il processo xiphoid e si estende verso il bacino.
- Mobilizzare l'intestino e il duodeno e riflettere lateralmente a destra. Roll up una striscia di cotone sterile confezionato e imbevuto di salina sterile per l'iniezione per consentire l'imballaggio della viscera per migliorare l'esposizione.
- Con il piccolo intestino mobilitato al lato destro dellaL'addome esporre il retroperitoneo ed esporre l'aorta addominale dalla vena renale sinistra alla biforcazione aortica ( Figura 1 ).
- Con un applicatore sterile a cotone, consegnare 30 frantumazioni consecutive, ogni cinque secondi in durata.
- Rimuovere l'imballaggio e consentire al viscera di tornare alla propria posizione nativa.
- Chiudere la fascia con una sutura monofilamento assorbibile 4-0 (polidioxanone). La pelle è chiusa con una sutura monofilamento non in assorbimento 6-0 (nylon).
- Recupero e cura post-procedura
- Dopo la procedura, posizionare l'animale in una gabbia di recupero con biancheria pulita su un tampone isotermico per continuare il supporto termico finché l'animale non è in grado di ambulare normalmente. Non lasciare l'animale incustodito fino a dimostrare la capacità di mantenere la ricostruzione sternale.
- Monitorare l'animale ogni ora per i primi 4 h dopo l'intervento chirurgico. Una volta che l'animale sta ambulando normalmente ritornare i T alla camera di affiliazione assegnata. L'animale non sarà ospitato in compagnia di un altro animale fino a quando non sarà completamente recuperato.
- Monitorare l'animale due volte al giorno per i primi 72 h dopo l'intervento chirurgico e almeno 3 volte la settimana dopo. Il monitoraggio include la pesatura dell'animale tre volte alla settimana.
- Amministrare carpofen (5 mg / kg) sottocutanea due volte al giorno per i primi 72 h dopo l'intervento chirurgico.
2. Approvvigionamento di tessuti
- Metodo di eutanasia
- Eutanizzare gli animali in momenti prestabiliti.
- Indurre l'anestesia attraverso un serbatoio di induzione con 100% O 2 e 2,5% isoflurano consegnato tramite vaporizzatore di precisione.
- Per studiare l'integrità dell'endotelio, somministrare tintura blu all'animale.
NOTA: Evans Blue è un colorante azoto caricato negativamente con un'elevata affinità di legame per l'albumina e può solo macchiare i vasi sanguigni in assenza di un endotilo intattoS = "xref"> 6. - Per gli studi di integrità endoteliale, al momento dell'eutanasia, perfusione degli animali con 5 mL di 0.3% Evans Blue colorante seguita da 5 mL di PBS a pressione fisiologica per 5 minuti. L'animale viene mantenuto in un piano chirurgico di anestesia durante la procedura di perfusione.
- Per studiare l'integrità dell'endotelio, somministrare tintura blu all'animale.
- Dopo aver raggiunto un piano profondo anestetico, aprire il petto con una sternotomia. Fare una lacerazione nell'atrio destro per consentire il drenaggio del sangue dall'animale e accedere al ventricolo sinistro è accessibile con un ago da 21 G e iniettare la soluzione salina fosfatizzata (PBS) finché l'effluente dal atrio destro non è chiaro.
- Dopo la perfusione con PBS, entrare nell'addome attraverso un'incisione midline.
- Ancora una volta, mobilitare l'intestino sottile al lato destro dell'addome che esprima l'aorta infrarenale, seziona acutamente l'aorta dai tessuti adiacenti e lo accetta dalla vena renale sinistra alla biforcazione aortica.
- Conservare l'aorta esaurita in un paraformald del 4%Ehyde soluzione fino al processo di trasformazione del tessuto.
- Per gli studi di integrità endoteliale, aprire l'aorta longitudinalmente e fissarlo a un foglio di cera esponendo l'intera superficie della lumina 6 . Eseguire una valutazione qualitativa dell'integrità endoteliale per il grado di colorazione con il colorante Evans Blue 6 .
- Per altri esami istologici, tagliare l'aorta trasversalmente e inserirlo in composti ottimali di taglio (OCT) come dettato dal metodo istologico da utilizzare 7 .
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Risultati
Le sezioni trasversali delle aorta incorporate in OCT sono state sezionate e macchiate con ematoxilina e eosina e poi contate con la macchia Verhoeff-Van Gieson (VVG) per identificare la lamina elastica interna ed esterna 7 . L'ispessimento della parete aortica indotta da lesioni a crisi è aumentato rispetto alle aorte degli animali trattati con una procedura sham (laparotomia e piccola mobilitazione intestinale). Lo spessore delle pareti, valutato dalla dista...
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Discussione
Abbiamo caratterizzato gli effetti di un modello di lesioni aortiche murine che provoca l'iperplasia mediale e la disfunzione della barriera endoteliale. Il distacco parziale CE lungo l'aorta intima ha accompagnato la perdita di contatto cellulare e miglioramento delle protuberanze delle cellule. Corrispondentemente, la funzione di barriera endoteliale è stata significativamente compromessa, che ha stimolato i percorsi di segnalazione sensibili al mitogeno, portando alla proliferazione di VSMC e ad ispessimento ...
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Dichiarazioni
Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento per gli Affari dei Veterani per lo sviluppo della carriera (1IK2BX001553-01) (TSM) e la cure vascolari EJ Wylie Scholarship (TSM).
Ringraziamenti
Ringraziamo Ph.D. Hsia Ru-ching, presso l'Electron Microscopy Core Facility della University of Maryland School of Medicine per il suo supporto tecnico nel trattamento dei campioni di scansione microscopica elettronica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lubrificante oculare | Dechra | 17033-211-38 | Agenti farmaceutici |
| Isoflurano | VetOne | 502017 | Agenti farmaceutici |
| Carprofene | Zoetis | 26357 | Agenti farmaceutici |
| Vaporizzatore di precisione | Summit Medical | 10675 | Forniture chirurgiche |
| Scavenger di carbone | Bickford Inc. | 80120 | Forniture chirurgiche |
| Cuscinetto isotermico | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Forniture chirurgiche |
| Applicatore sterile con punta in cotone | Fisher Scientific | 23-400-124 | Forniture chirurgiche |
| 4-0 sutura monofilamento assorbibile | Ethicon, Inc | J310 | Forniture chirurgiche |
| 5-0 sutura monofilamento non assorbibile | Ethicon, Inc | 1666 | Forniture chirurgiche |
| 21 gauge x 1 pollice ago | BD Biosciences | 305165 | Forniture chirurgiche |
| 25 gauge x 1 pollice ago | BD Biosciences | 305125 | Forniture chirurgiche |
| Sterilizzatore a secco | Cellpoint | 7770 | Forniture chirurgiche |
| Forbici fini | Strumenti per le scienze | 14058-09 | Strumenti chirurgici |
| Pinze Adson Strumenti per | le scienze | 11006-12 | Strumenti chirurgici |
| Dumont #5 pinze per le scienze fini | Strumenti per le scienze | 11254-20 | Strumenti chirurgici |
| Vannas Forbici a molla 3 mm | Utensili per le scienze | 15000-00 | Strumenti chirurgici |
| Cacciavite per aghi | Fine Science Tools | 91201-13 | Strumenti chirurgici |
| Manico per bisturi #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Strumenti chirurgici |
| Lame per bisturi #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Strumenti chirurgici |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagenti per il trattamento dei tessuti |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagenti per il trattamento dei tessuti |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagenti per il trattamento dei tessuti |
| Cera da modellazione | Bego | 40001 | Reagenti per il trattamento dei tessuti |
| Composto OCT | Tissue-Tek | Sakura 4583 | Reagenti per soluzione di |
| ematossilina di Mayer | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagenti per analisi immunoistologica |
| Eosina Y soluzione alcolica | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagenti per analisi immunoistologiche |
| Kit colorante di elastina | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagenti per analisi immunoistologiche |
| Click-it Edu Alexa-488 Kit di imaging | Invitrogen | C10337 | Reagenti per analisi immunoistologiche |
| Anticorpi anti-Erk1/2 | Tecnologia di segnalazione cellulare | 4695 | Reagenti per immunoistologici anticorpi |
| anti-fosfo-Erk1/2 | Tecnologia di segnalazione cellulare | 4370 | Reagenti per analisi immunoistologiche |
| Anticorpi anti-p27kip1 | Tecnologia di segnalazione cellulare | 3698 | Reagenti per analisi immunoistologiche |
| Acido tricloroacetico | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagenti per analisi immunoistologiche |
Riferimenti
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