Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

Sommario

È stata sviluppata e valutata una metodologia di campionamento basata su macroschiuma per il rilevamento e la quantificazione del norovirus su superfici dure ambientali.

Abstract

norovirus umani sono una delle principali cause di un'epidemia di gastroenterite e sporadici in tutto il mondo. Poiché la maggior parte delle infezioni sono o diffondono direttamente per via da persona a persona o indirettamente tramite superfici ambientali o cibo, fomiti contaminati e superfici inanimate sono veicoli importanti per la diffusione del virus durante focolai di norovirus.

Abbiamo sviluppato e valutato un protocollo utilizzando tamponi macrofoam per il rilevamento e la tipizzazione dei norovirus umani provenienti da superfici dure. Rispetto ai tamponi in fibra con punta o salviette antistatiche, tamponi macrofoam consentire il recupero virus (range 1,2-33,6%) dalle superfici dei sedili wc fino a 700 cm ^2. Il protocollo include i passaggi per l'estrazione del virus dalle tamponi e ulteriore concentrazione dell'RNA virale utilizzando colonne di rotazione. In totale, 127 (58,5%) dei 217 campioni di tamponi che erano stati raccolti da superfici in navi da crociera e le strutture di assistenza a lungo termine in cui norovirus gastroenterite era statosegnalati risultati positivi per GII norovirus mediante RT-qPCR. Di questi 29 (22,8%) potrebbe essere genotipizzati con successo. In conclusione, l'individuazione di norovirus sulle superfici ambientali che utilizzano il protocollo che abbiamo sviluppato può aiutare a determinare il livello di contaminazione ambientale durante le epidemie, così come il rilevamento del virus quando i campioni clinici non sono disponibili; può anche facilitare il monitoraggio dell'efficacia delle strategie di bonifica.

Introduzione

Norovirus umani sono una delle principali cause di un'epidemia e sporadici gastroenterite acuta in tutto il mondo ^{1, 2, 3.} Il virus è estremamente contagiosa e la trasmissione avviene attraverso persona diretta all'interazione persona o indirettamente attraverso il contatto con alimenti contaminati, acqua o superfici ambientali. Norovirus può essere versato per lunghi periodi e prolungato la sopravvivenza del virus sulle superfici ambientali è stata documentata ^{1, 2, 3.} Durante spargimento di picco, miliardi di particelle virali vengono rilasciati per grammo di feci e vomito contiene anche un numero sufficiente di particelle virali di causare infezioni ^{4, 5, 6, 7, 8,}ef "> ^{9, 10.} Inoltre, il trasferimento del virus tra le superfici inanimate e la pelle umana può facilmente verificarsi ^{2, 11, 12.} Quindi, il monitoraggio della contaminazione ambientale può aiutare a indagini sui focolai e nel valutare l'efficacia di clean-up e procedure di disinfezione.

Diversi protocolli di campionamento ambientali sono stati descritti per la rilevazione di rotavirus, colifago MS2, calicivirus felino (FCV), e batteriofago P22 ^{13, 14, 15, 16.} Tuttavia, le condizioni di validazione descritti in questi studi, tra cui essiccazione veloce (<1 ora) e piccole superfici (25 x 100 cm ^2), potrebbero non rappresentare adeguatamente le impostazioni del campo. Inoltre, il basso livello di contaminazione di enviro previstosuperfici nmental richiedono protocolli che sono in grado di rilevare pochissime particelle virali.

Abbiamo sviluppato un metodo di campionamento di superficie macrofoam-based per il rilevamento e la tipizzazione di norovirus. Questo metodo è stato validato nel corso di diversi focolai di norovirus. Il protocollo comprende 1) come raccogliere campioni di tampone da superfici ambientali (2) come mantenere meglio l'integrità dei campioni durante la raccolta e il trasporto al laboratorio, e 3) prove di laboratorio e la tipizzazione di norovirus.

Protocollo

1. Tampone campionamento nel campo

1. Indossare un paio di guanti puliti.
2. Misurare le dimensioni della zona di campionamento senza toccare la superficie con un nastro di misurazione o un righello. Cercare di stimare l'area nel modo più accurato possibile e compilare un modulo di rapporto (Tabella supplementare 1).
3. Controllare il kit tampone per eventuali perdite e borse trasporto del campione etichetta e kit tamponi.
4. Spostare il tampone attraverso l'area di campionamento come segue: un colpo in direzione orizzontale, un colpo in direzione verticale, ed un colpo in diagonale. Non tamponare una superficie maggiore di 700 cm ^2.
5. Posizionare ogni tampone in una provetta e stringere il tappo saldamente.

2. il deposito e trasporto tamponi al Laboratorio

1. Mantenere tamponi a 4 ° C per un massimo di 48 ore. Per una conservazione per periodi più lunghi, conservare i tamponi a -20 ° C (o -70 ° C).
2. Conservare le provette a 0-4 ° C (vale a dire. , Usare impacchi freddi) in un contenitore isolato durante il trasporto al laboratorio e nave entro 24-48 ore di raccolta.

3. Virus Concentrazione, virale RNA estrazione e purificazione

NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione utilizzare una centrifuga da tavolo a 5.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. Prestare la massima attenzione quando si lavora con il tampone universale estrazione degli acidi nucleici (UNEX). Indossare occhiali o visiera.

1. Etichettare una provetta 15 ml e una colonna RNA Midi per ogni campione. Includere un controllo di estrazione negativo in ogni esperimento.
2. Per preparare la soluzione di lisi per 10 tamponi, miscelare 25 ml di tampone UNEX con 25 mL di PBST (PBS pH 7,2 contenente 0,02% Tween-80).
3. Aggiungere 50 ml di sospensione colifago MS2 (10 ⁶ PFU / ml) a 50 ml di soluzione di lisi.
4. Posizionare un tampone in una provetta da 15 ml e aggiungere 5 ml di soluzione di lisi. Mescolare e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 5 ml di etanolo al 100% in ogni provetta e vortex per 10 s.
6. Rimuovere con cautela il bastoncino del tubo da 15 ml (contiene tampone UNEX) premendo delicatamente contro la parete della provetta per rimuovere il liquido in eccesso e poi scarta il tampone. I restanti volumi dovrebbero essere tra 9-10 ml.

4. Midi Colonna virale Nucleic Acid Extraction

1. Trasferire accuratamente 4,5 mL UNEX miscela / etanolo a partire dal punto 3.6 su una colonna midi, centrifugare e scartare il filtrato.
2. Caricare altri 4,5 ml della stessa miscela sulla stessa colonna, centrifuga, e scartare il filtrato.
3. Per il primo lavaggio, aggiungere 3,5 ml di etanolo al 70% sul Mezzogiorno della colonna, centrifugare e scartare il filtrato.
4. Per il secondo lavaggio, aggiungere altri 3,5 ml di etanolo al 70% nella colonna Midi. Centrifuga e scartare il filtrato.
5. Per la secca-spin, centrifugare le colonne Midi per eliminare ogni traccia di etanolo (che possono influenzare negativamente il recupero RNA virale).
6. Porre la colonna Midi a un nuovo 15 ml provetta da centrifuga. Aggiungere 250 microlitri tampone di eluizione sulla colonna Mezzogiorno; attendere 1 minuto prima centrifugazione per ottenere il massimo recupero di RNA virale.
7. Conservare l'acido nucleico estratto a -70 ° C o procedere immediatamente al punto 5.

5. La concentrazione di acido nucleico virale Utilizzando RNA Clean and Concentrator Kit

1. Aggiungere 500 ml di RNA Binding Buffer a 250 ml di RNA eluizione al punto 4.7 e vortex per 10 s.
2. Aggiungere 750 microlitri di 100% di etanolo e vortex per 10 s.
3. Etichettare una colonna di spin per ogni campione. Caricare il campione di 750 microlitri su una colonna di spin.
4. Centrifugare le colonne di rotazione a 12.000 xg per 1 min. Gettare il flow-through.
5. Caricare i restanti 750 ml su una colonna di spin e centrifugare a 12.000 xg per 1 min.
6. Per il prelavaggio, aggiungere 400 microlitri di RNA Prep buffer per ogni colonna di spin e centrifugare a 12.000 xg per 1 min. Gettare il flow-through.
7. Per il primo lavaggio, aggiungere 800 microlitri di RNA tampone di lavaggio in ogni colonna di spin e centrifugare a 12.000 xg per 1 min. Gettare il flow-through.
8. Per il secondo lavaggio, aggiungere 400 microlitri di RNA tampone di lavaggio a girare colonna e centrifugare a 12.000 xg per 1 min. Gettare il flow-through.
9. Per la secca-spin, centrifugare la colonna di selezione per eliminare ogni traccia di tampone di lavaggio a 12.000 xg per 2 minuti.
10. Trasferire accuratamente colonna di selezione per un 1,5 ml provetta pulita.
11. Aggiungere 25 microlitri tampone di eluizione su colonna di spin e incubare per 1 min a temperatura ambiente. Ciò aumenterà il recupero di RNA virale dalla colonna.
12. Raccogliere RNA mediante centrifugazione la colonna di spin a 10.000 xg per 1 min.
13. O procedere direttamente alla RT-qPCR (fase 6) o un negozio di RNA a -70 ° C.

6. Mutiplex RT-qPCR Rilevazione di genogruppo I e II Norovirus, e colifago MS 2 (tabella integrativa 2)

1. le superfici di lavoro pulito, pipettES, e centrifughe con la soluzione di decontaminazione RNase per ridurre possibili contaminazioni.
2. Scongelare reagenti RT-qPCR sul ghiaccio. RNA disgelo sul ghiaccio (in una zona / camera separata).
3. Determinare il numero di reazioni e aggiungere almeno il 10% più di essi (ad esempio se sono necessari 10 reazioni, fare miscela master per 11).
4. Vortex singoli componenti Master Mix, ad eccezione di 25x RT-qPCR enzima, per 5 s. Mescolare accuratamente l'enzima muovendo il tubo con un dito.
5. Brevemente componenti mix di master centrifuga per 5 s.
6. Preparare la miscela master per il tempo reale di rilevamento RT-PCR di GI norovirus e GII secondo le istruzioni del kit e aggiungere primer e sonde oligonucleotidiche specifiche per norovirus in 1,5 ml provetta (Tabella supplementare 3).
7. Mescolare il master mix pipettando 5-10 volte su e giù (vortex non è raccomandata). Aliquota 22 ml di master mix in ciascun pozzetto della real time PCR piastra da 96 pozzetti.
8. Vortex RNA campioneper 5 secondi, e raccogliere da brevi (5 s) centrifugazione.
9. Aggiungere 3 ml di RNA campione e GI e GII controlli positivi alla piastra RT-qPCR (seguire modello dalla tabella 2). Aggiungere 3 ml di nucleasi-Freewater nei pozzetti non-modello-controllo (NTC).
10. Sigillare la piastra in tempo reale con pellicola adesiva ottica.
11. centrifugare delicatamente la piastra in tempo reale a 1.300 xg per 1 min per rimuovere eventuali bolle d'aria o gocce di liquido che possono essere presenti nei pozzetti.
12. Impostare un real-time PCR e strumento di set-up le seguenti condizioni termocicli: 1) step RT per 10 min. a 45 ° C (2) attivazione di Taq polimerasi, 10 min. a 95 ° C e (3) 45 cicli di 15 s a 95 ° C e 60 s a 60 ° C.

7. La quantificazione di Norovirus in tampone campioni

1. Verificare i risultati dei controlli positivi e negativi per convalidare i risultati RT-qPCR (Tabella supplementare 3).
2. Determinare se ogni curva standard incontra ilvalori accettabili riportati nella tabella integrativa 2 e calcolare la deviazione standard generale per la curva standard utilizzando Equazione 1.
   (Equazione 1)% di efficienza = 100 x 10 ^{(media Ct Values-Intercept) / Slope.}
3. Se il software termociclatore PCR non calcola la pendenza per ogni curva standard, determinare pendenza e R ² valori di regressione utilizzando un software statistico (per esempio Excel, SPSS o SAS). Inoltre, calcolare l'efficienza% per curve standard seguenti equazione I
4. Registrare il numero di RNA copie calcolato dal software termociclatore per tutti i campioni di prova basati su curve standard che soddisfano i criteri specificati nella tabella supplementare 4. Eseguire nuovamente tutti i campioni con le curve standard t cappello non soddisfano i criteri o hanno controlli falsi-positivi. Controllare i valori Ct di colifago MS2, che è stato aggiunto come controllo interno per monitorare l'inibizione della PCR.
5. Determinare il numero totale di RNA copie per campione dallo moltiplicando il numero RNA copia calcolata al punto 7.2 dal rapporto tra il volume (25 a 50 mL) del totale eluente RNA a quella del RNA (da 3 a 5 mL) usato per la reazione RT-qPCR. In alternativa, calcolare la densità RNA dividendo il numero totale RNA copia per la superficie dell'oggetto (cm ²⁾ analizzato.

8. genotipizzazione di campioni in tempo reale RT-PCR positiva per Hemi annidata convenzionale PCR Amplification

1. Preparare il primo turno di master mix per ogni set di primer del saggio RT-PCR (Tabelle integrativa 2 e 5).
2. Aggiungere 5 ml di norovirus RNA positivo per 20 ml di master mix.
3. Eseguire il RT-PCR con le seguenti condizioni: (1) RT passo per 30 minuti a 42 ° C (2) attivazione di Taq polimerasi, 15 min a 95 ° C, e (3) 40 cicli di 30 s a 95 ° C , 30 s a 50 ° C e 60 secondi a 72 ° C. Dopo 40 cicli, incubare per altri 10 min a 72 ° C.
4. Preparare il secondo turno di mix mater per ogni set di primer del saggio RT-PCR (Tabelle integrativa 2 e 5).
5. Aggiungere 23 ml master mix e aggiungere 2 ml di primo turno di RT-PCR prodotti (dal primo turno) ad ogni provetta (idealmente il prodotto primo turno deve essere diluito 1/10 in acqua RNase-free).
6. Ripetere il punto 8.3.
7. Preparare un gel di agarosio al 2% in EDTA 100 ml 1x Tris-acetato (40 mM Tris, 20 mM di acido acetico, e 1 mM EDTA, pH 8,3). Dopo dissoluzione agarosio riscaldando la miscela in un forno a microonde, aggiungere 10 ml di acido macchia nucleico per 100 ml di gel preparata dopo raffreddamento la miscela a 60-70 ° C, versare il gel e inserire i pettini. Lasciate che il gel accontentarsi di almeno 30 minuti.
8. Mescolare 15 ml di ciascun prodotto RT-PCR con 3 ml di colorante di caricamento 6x. Carico 15 microlitri di ciascun campione e elettroforesi il gel di agarosio a 100 V per 1 ora.
9. frammenti bersaglio Excise RT-PCR di dimensioni adeguate (330 bp per GI e 341 bp per GII) dal geld purificare RNA utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale. Il prodotto di PCR purificato può essere utilizzato per Sanger sequenziamento.

Risultati

La figura 1 presenta un diagramma di flusso del protocollo di campionamento tampone. Questo protocollo è costituito da quattro fasi principali; 1) la raccolta dei campioni, 2) conservazione e il trasporto, 3) virale purificazione dell'RNA e concentrazione e 4) analisi RT-qPCR e genotipizzazione.

Figura 1: Diagramma di flusso de...

Discussione

Norovirus hanno una dose infettiva umana del 50% tra i 18 ei 10 ^{3 20} particelle virali. Pertanto, anche la contaminazione di basso livello di superfici può costituire un rischio per la salute pubblica. Diversi aspetti del protocollo di campionamento tampone sono stati valutati tra cui: 1) diversi materiali tampone, 2) condizioni di conservazione tamponi durante il trasporto, 3) la concentrazione di RNA virale, e 4) colifago MS2 il controllo di estrazione interna.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome generico per kit
Macrofoam swab	Kit tampone EnviroMax preumidificato	Puritano	2588060PFUW
RNA Tampone di lisi	CDC Tampone UNEX	Microbiologics	Cat No MR0501
Colonna di spin per l'estrazione dell'RNA	Colonna Midi	Omega Biotek	Cat No R6664-02
Colonna di centrifuga per la purificazione dell'RNAKit di	pulizia e concentratore dell'RNA Zymol	Zymo Research	Cat No R1016
Kit RT-PCR in tempo reale	AgKit AgPath Kit RT-PCR in un solo passaggio	Life Technologies	Cat No 4387391
Kit RT-PCR convenzionale	Qiagen kit RT-PCR in un solo passaggio	Qiagen	Cat No 210212
Kit di estrazione del gel	Qiagen QIAkit di estrazione rapida del gel	Qiagen	Cat No 28704 o 28706
	Coliphage MS2	ATCC	Cat No 15597-B1
	Trascrizioni
Piattaforma PCR in tempo reale	Applied Biosystems	Modello ABI 7500
	MicroAmp Pellicola adesiva trasparente	Thermo Scientific	Cat No 4306311

Kit Kit del run-off dell'RNAPiastra di reazione ottica a 96 pozzetti Thermo Scientific Cat No 4316813