Un sensore Aptamero-based per Unchelated gadolinio (III)

Sommario

Viene descritto l'uso di molecole di polideossinucleotide (aptamero 44-mer) per rilevare lo ione gadolinio (III) non chelato in una soluzione acquosa. La presenza dello ione viene rilevata tramite un aumento dell'emissione di fluorescenza del sensore.

Abstract

Viene dimostrato un metodo per determinare la presenza di ione gadolinio trivalente non chelato (Gd³⁺) in soluzione acquosa. Gd³⁺ è spesso presente in campioni di mezzi di contrasto a base di gadolinio a seguito di reazioni incomplete tra il ligando e lo ione, o come prodotto di dissociazione. Poiché lo ione è tossico, la sua rilevazione è di fondamentale importanza. Qui vengono descritti la progettazione e l'utilizzo di un sensore basato su aptamero (sensore Gd) per Gd³⁺. Il sensore produce una variazione di fluorescenza in risposta all'aumento delle concentrazioni dello ione e ha un limite di rilevamento nell'intervallo nanomolare (~100 nM con un rapporto segnale/rumore di 3). Il test può essere eseguito in un tampone acquoso a pH ambiente (~7 - 7,4) in una micropiastra a 384 pozzetti. Il sensore è relativamente poco reattivo nei confronti di altri ioni metallici fisiologicamente rilevanti come gli ioni sodio, potassio e calcio, sebbene non sia specifico per Gd³⁺ rispetto ad altri lantanidi trivalenti come l'europio(III) e il terbio(III). Tuttavia, i lantanidi non si trovano comunemente negli agenti di contrasto o nei sistemi biologici e il sensore può quindi essere utilizzato per determinare selettivamente il Gd³⁺ non chelato in condizioni acquose.

Introduzione

La crescente importanza della risonanza magnetica (MRI) nella diagnosi clinica, che è limitata dalla sensibilità intrinseca della tecnica, ha portato alla rapida crescita della ricerca per lo sviluppo di nuovi agenti di contrasto a base di gadolinio (GBCAs) ^1. GBCAs sono molecole che vengono somministrati per migliorare la qualità dell'immagine, e che in genere hanno la struttura chimica di uno ione trivalente gadolinio (Gd ³⁺⁾ coordinato ad un ligando polidentato. Questa complessazione è di importanza critica come unchelated Gd ³⁺ è tossico; essa è stata implicata nello sviluppo di fibrosi sistemica nefrogenica in alcuni pazienti con malattia renale o insufficienza ^2. Di conseguenza, rilevando lo ione libero acquosa è fondamentale per garantire la sicurezza dei GBCAs. La presenza di unchelated Gd ³⁺ nelle soluzioni GBCA spesso è il risultato di una reazione incompleta tra il ligando e lo ione, la dissociazione del complesso, o displacement da altri cationi metallici biologiche ^3.

Tra le varie tecniche attualmente utilizzate per la determinazione della presenza di Gd ^3+, quelli che usano cromatografia e / o spettrometria grado più alto in termini di versatilità e applicabilità ^4. Tra i loro punti di forza sono l'alta sensibilità e precisione, la capacità di analizzare diverse matrici di campioni (compresi siero umano ^5, urine e capelli ^6, acque di scarico ⁷ e contrasto agente formulazioni ^8), e la quantificazione simultanea di più ³⁺ complessi di Gd (una scheda di studi prima al 2013 è descritto in una revisione completa da Telgmann et al.) ^4. L'unico inconveniente è che molti di questi metodi richiedono strumentazioni (come la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente) ⁴ che alcuni laboratori non possono avere accesso. Nel contesto della nuova scoperta GBCA alla ricerca e livelli proof-of-concept, arMetodo elatively più conveniente, rapida e conveniente spettroscopica basata (come l'assorbimento UV-Vis o fluorescenza) può servire come una valida alternativa. Con queste applicazioni in mente, un sensore di aptameri a base acquosa fluorescente per Gd ³⁺ è stato sviluppato ^9.

Il aptameri (Gd-aptamero) è una lunga molecola di DNA a singolo filamento 44-base con una specifica sequenza di basi che è stata isolata attraverso il processo di evoluzione sistematica dei ligandi di arricchimento esponenziale (SELEX) ^9. Per adattare l'aptamero in un sensore fluorescente, un fluoroforo è attaccato al terminale 5 'del filamento, che viene quindi ibridato con un filamento di tempra (QS) con 13 basi complementari (Figura 1). Il QS è etichettato con una molecola quencher scuro al 'capolinea 3. In assenza di Gd ^3+, il sensore (Gd-sensore), costituito da un rapporto 1: 2 moli di Gd-aptamero e QS rispettivamente avrà emissione di fluorescenza minima dovuta ttrasferimento di energia o dal fluoroforo alla quencher. L'aggiunta di soluzione acquosa di Gd ³⁺ sposterà QS dal Gd-aptamer, con un conseguente aumento di emissione di fluorescenza.

Figura 1. Il sensore (Gd-sensore) che consiste nella aptamer 44-passo lungo (Gd-aptamero) codificata con fluoresceina (un fluoroforo) e il 13-passo lungo tempra filamento (QS) contrassegnati con DABCYL (un quencher scuro) . In assenza di unchelated Gd ^3+, la fluorescenza del sensore è minima. Con l'aggiunta di Gd ^3+, spostamento del QS si verifica e si osserva un aumento di emissione di fluorescenza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Vi è attualmente, quello comunemente usato metodo spettroscopico-based per rilevareing acquosa ³⁺ Gd. Questo saggio utilizza arancione xilenolo molecola, che subisce uno spostamento della lunghezza d'onda massima assorbimento dai 433 ai 573 nm su di chelazione allo ione ^10. Il rapporto tra queste due assorbanza massimi può essere utilizzato per quantificare la quantità di unchelated Gd ^3+. Il sensore aptamero è un'alternativa (può anche essere complementari) al dosaggio xilenolo arancio, come i due metodi hanno le condizioni di reazione (come il pH e la composizione delle soluzioni tampone utilizzato), selettività bersaglio, gamme lineari di quantificazione, e le modalità di rilevamento ^9.

Protocollo

NOTA: l'acqua di biologia molecolare di grado è utilizzato in tutte le preparazioni tampone ed una soluzione. Tutti i tubi monouso (microcentrifuga e PCR) e puntali sono DNase- e RNase-free. Si prega di consultare la scheda di sicurezza (SDS) per tutte le sostanze chimiche prima dell'uso. L'utilizzo di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) è fortemente raccomandato.

1. Preparazione dei aptamero archivio Solutions

1. Acquisto 2 basi di polydeoxynucleotide commercio. Ordinare entrambi i filamenti con purificazione tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
   Parte 1 (Gd-aptamero):
   5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
   Parte 2 (QS):
   5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 '
2. Sciogliere ogni filo in acqua per fare 100 micron singole soluzioni di riserva del Gd-aptamer e il QS.
3. Conservare queste soluzioni a -20 ° C. Le soluzioni sono stabili finora, per 3 anni.
4. Per ridurre al minimo freezcicli e-disgelo, memorizzare le soluzioni madre in 10 microlitri aliquote.

2. Preparazione del 2x Gd-sensore Solution

1. Preparare il tampone (20 mM HEPES, 2 mM MgCl _2, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Regolare il pH a ~ 7,4 con NaOH e HCl, e filtrare bottiglia migliori filtri sterili monouso con 0,2 micron membrana PES. Conservare in bottiglie sterili. Se filtrato e conservato correttamente (a temperatura ambiente), il buffer è stabile finora, per 2 anni.
2. Diluire 1 ml di soluzione di Gd-aptamer magazzino (dal punto 1.2) e 2 ml di soluzione di riserva QS (dal punto 1.2) in 497 ml di tampone. Mescolare bene con un vortice. La loro concentrazione nella soluzione Gd-sensore 2x sono 200 e 400 nm, rispettivamente.
   NOTA: Il volume della soluzione Gd-sensore 2x preparato in questa fase è 500 ml, che è sufficiente per testare 6 - 7 concentrazioni variabili di Gd ³⁺ per la curva di calibrazione e le soluzioni di contrasto(Fase 3). Ogni campione darà pozzetti duplicati in una piastra da 384 pozzetti.
   1. Regolare il volume della soluzione di Gd-sensore 2x in base al numero di soluzioni Gd ³⁺ che deve essere testato.
3. Trasferire la soluzione Gd-sensore 2x in 9 provette PCR, con 50 microlitri in ogni provetta. Mettere le provette in un termociclatore.
4. Impostare il programma nel termociclatore per riscaldare la soluzione nei tubi a 95 ° C, tenere premuto per 5 min e quindi raffreddare lentamente la soluzione a 25 ° C sopra ~ 15 min (al tasso di ~ 0.05 - 0,1 ° C / S). Il ciclo di riscaldamento e raffreddamento è di garantire ibridazione ottimale tra il Gd-aptamer e QS. risultati parziali ibridazione in tempra incompleta e uno sfondo più elevata fluorescenza del sensore. Se un termociclatore non è disponibile, effettuare questo processo utilizzando un bagno di acqua calda, invece.
5. Una volta raffreddata a 25 ° C, utilizzare immediatamente la soluzione, o mantenere nel termociclatore (fino a circa 2 h) fino al momento di essereusato. Quando un bagno di acqua viene utilizzata per il riscaldamento, lasciare le provette nel bagno come l'acqua si raffredda lentamente a temperatura ambiente.

3. costruire la curva di fluorescenza taratura e rilevare la presenza di Unchelated Gd ³⁺ in una soluzione di Gd Agente Contrast

1. Sciogliere GdCl ₃ solido nel tampone (lo stesso buffer come al punto 2.1).
2. Attraverso diluizione in serie, preparare 100 ml ciascuna di 6 diverse soluzioni Gd ³⁺ in tubi microcentrifuga al doppio delle concentrazioni finali desiderati per la curva di calibrazione (2x soluzioni).
   1. Ad esempio, per costruire una calibrazione per 0 (tampone solo senza GdCl _3), 50, 100, 200, 400, e 800 nM di Gd ^3+, preparare soluzioni contenenti 0, 100, 200, 400, 800, e 1600 nM dello ione. Assicurati di includere sempre il 'vuoto' con 0 ns Gd ³⁺ come il controllo negativo.
3. Sciogliere il mezzo di contrasto per essere provaDE al tampone. Preparare 2 o 3 diverse concentrazioni delle soluzioni di contrasto tramite diluizione in serie.
   NOTA: Test 3 diverse concentrazioni della soluzione di agente di contrasto è raccomandato. Questo per garantire che queste concentrazioni sono all'interno del range lineare. Se i campioni esaminati non presentano un rapporto lineare, ridurre le concentrazioni di agente di contrasto utilizzato.
4. Prendere le provette PCR contenente la soluzione 2x Gd-sensore dal punto 2.5 del termociclatore.
5. Aggiungere 50 ml di ciascuna soluzione Gd ³⁺ dal punto 3.2 in 6 delle provette PCR 9 contenente la soluzione 2x Gd-sensore. Mescolare pipettando su e giù. Ogni tubo PCR contiene ora la concentrazione desiderata di Gd ³⁺ da testare, 100 nM Gd-aptamer, e 200 nM QS.
6. Per le provette PCR restanti contenenti la soluzione Gd-sensore 2x, aggiungere 50 ml delle soluzioni di contrasto dal punto 3.3. Mescolare bene pipettando su e giù un paio di volte.
7. Incubare le solutions nei tubi PCR per circa 5 min a temperatura ambiente. Essi possono essere lasciati riposare per un massimo di 30 min.
8. Trasferire 45 ml di ciascun tubo in una piastra da 384 pozzetti. Ogni tubo di PCR darà pozzetti in duplicato.
9. Registrare la fluorescenza di ciascun pozzetto su una piastra-reader. Il fluoroforo (FAM) utilizzati per la progettazione Gd-sensore è di eccitazione e di emissione massimi di 495 e 520 nm, rispettivamente, come indicato sul sito web del fornitore. Scegliere opportune lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione o filtri a seconda che la piastra-lettore è monochromator- o filter-based.
10. Tracciare il grafico della fluorescenza in unità di fluorescenza arbitrarie (AFU) contro la concentrazione di Gd ^3+.
11. Tracciare il grafico come il cambiamento di fluorescenza volte contro la concentrazione di Gd ^3+. Calcolare la variazione di fluorescenza volte dividendo la AFU di ciascuna concentrazione dal AFU della soluzione 'in bianco' (con 0 nM di Gd ^3+). Il cambiamento di fluorescenza piega consentirà di normalization dei risultati, qualora il display AFU alcuni periodica (diversi giorni, ecc) variazioni.
12. Confrontare l'emissione di fluorescenza della soluzione contenente l'agente di contrasto e 'blank', che è la soluzione contenente 0 nM GdCl ₃ (tampone solo).
    NOTA: Una maggiore fluorescenza della soluzione GBCA implica la presenza di unchelated Gd ^3+, che può richiedere ulteriore purificazione del mezzo di contrasto. La quantità di unchelated Gd ³⁺ attuale può essere stimata utilizzando la curva di calibrazione costruita nel punto 3.10 o 3.11.

Risultati

Una tipica variazione di fluorescenza della soluzione di Gd-sensore in presenza di unchelated Gd ³⁺ è mostrato in Figura 2. L'emissione può essere tracciata come la variazione di fluorescenza piega (Figura 2A) o la fluorescenza grezza lettura (Figura 2B) in unità arbitrarie (AFU). Entrambe le trame producono curve di calibrazione molto simili, con un intervallo lineare per le concentrazioni di Gd ³⁺ inferiore a 1 mi...

Discussione

Utilizzando il Gd-sensore aptameri base, un aumento di emissione di fluorescenza che è proporzionale alla concentrazione di unchelated Gd ³⁺ è osservato. Per ridurre al minimo la quantità di campione usato, il saggio può essere eseguito in 384 pozzetti micropiastra con un volume di campione totale di 45 microlitri per pozzetto. In questo disegno, la scelta di fluoresceina (FAM) e DABCYL (Dab) è basata principalmente sul costo dei reagenti; modificare la lunghezza d'onda di emissione, un diverso accoppiame...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
	IDTDNA	Sequenza di input e modifica del fluoroforo nella forma d'ordine	Può essere utilizzato un fluoroforo con una diversa lunghezza d'onda di emissione. L'aptamero può essere ordinato anche da un'altra azienda.
Filamento di quenching	IDTDNA	Sequenza di input e modifica del quencher nella forma d'ordine	È possibile utilizzare un quencher diverso per un trasferimento ottimale di energia dal fluoroforo. L'aptamero può essere ordinato anche da un'altra azienda.
		di grado di biologia molecolare	Nessun produttore specifico, sia il DEPC che il non DEPC trattato funzionano ugualmente bene
Cloruro di gadolinio (III) anidro	Strem	936416	tossico
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Cloruro di magnesio anidro	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Cloruro di sodio	Acros Organics
Cloruro di potassio	Fisher Scientific	P333-500
Idrossido di sodio, pellet	Fisher Scientific	BP359	Corrosivo
Acido cloridrico	Fisher Scientific	SA49	Tossico e corrosivo
384 pozzetti a flangia bassa nero fondo piatto Piastre NBS	Corning	3575	Piastre adatte per la fluorescenza lettura sono obbligatorie.
Nalgene Filtro sterile monouso per flaconi Nalgene	Thermo Scientific	5680020	Il tappo del flacone è dotato di membrana PES da 0,2 micron
Flaconi sterili monouso da 250 mL	Corning	430281	È possibile utilizzare un flacone più grande o più piccolo
Provette			Nessun produttore specifico, purché siano
provette			per PCR da 0,2 mL prive di DNAsi e RNAsiNessun produttore specifico, purché siano
Punte per pipette (non filtranti) di dimensioni			Nessun produttore specifico, purché prive di DNAsi e RNAsi
Equipment
Plate reader	Biotek Synergy H1		I lettori di lastre di altri produttori funzionerebbero altrettanto bene