Articolo metodologico

Visualizzazione di interazione proteina-proteina in nucleare e citoplasmatica frazioni da Co-immunoprecipitazione e In Situ Proximity Assay legatura

DOI:

10.3791/55218

⸱

16 gennaio 2017

 ,  , 
1University Children's Hospital Basel (UKBB), University of Basel, 2Department of Clinical Research, University of Basel

In questo articolo

Sommario

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Le interazioni proteina-proteina possono verificarsi sia nel nucleo che nel citoplasma di una cellula. Per studiare queste interazioni, vengono applicati la tradizionale co-immunoprecipitazione e il moderno saggio di legatura di prossimità. In questo studio, confrontiamo questi due metodi per visualizzare la distribuzione delle interazioni NF90-RBM3 nel nucleo e nel citoplasma.

Abstract

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Le interazioni proteina-proteina sono coinvolte in migliaia di processi cellulari e avvengono in un contesto spaziale distinto. Tradizionalmente, la co-immunoprecipitazione è una tecnica popolare per rilevare le interazioni proteina-proteina. La successiva analisi Western blot è il metodo più comune per visualizzare le proteine co-immunoprecipitate. Recentemente, il saggio di legatura di prossimità è diventato un potente strumento per visualizzare le interazioni proteina-proteina in situ e offre la possibilità di quantificare le interazioni proteina-proteina con questo metodo. Analogamente all'immunocitochimica convenzionale, anche la tecnica del saggio di ligazione di prossimità si basa sull'accessibilità degli anticorpi primari agli antigeni, ma al contrario, il saggio di ligazione di prossimità rileva le interazioni proteina-proteina con una tecnica unica che coinvolge la PCR a circolo rotante, mentre l'immunocitochimica convenzionale mostra solo la co-localizzazione delle proteine.

Il fattore nucleare 90 (NF90) e la proteina 3 del motivo legante l'RNA (RBM3) sono stati precedentemente dimostrati come partner interagenti. Sono prevalentemente localizzati nel nucleo, ma migrano anche nel citoplasma e regolano le vie di segnalazione nel compartimento citoplasmatico. Qui, abbiamo confrontato l'interazione NF90-RBM3 sia nel nucleo che nel citoplasma mediante co-immunoprecipitazione e saggio di legatura di prossimità. Inoltre, abbiamo discusso i vantaggi e i limiti di queste due tecniche nella visualizzazione delle interazioni proteina-proteina rispetto alla distribuzione spaziale e alle proprietà delle interazioni proteina-proteina.

Introduzione

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Fattore nucleare 90 (NF90) è una proteina multi-isoforma con numerose funzioni, tra cui la risposta all'infezione virale, regolazione di interleuchina-2 post-trascrizione e regolazione dei miRNA biogenesi 1-3. RBM3 è una proteina RNA-binding, coinvolto nella traduzione e miRNA biogenesi e può essere indotta da vari fattori di stress, tra cui l'ipotermia e ipossia 4-6. Recentemente, abbiamo trovato NF90 e RBM3 in un complesso proteico 7. L'interazione di NF90 e RBM3 è essenziale per modulare l'attività della proteina chinasi RNA-like chinasi reticolo endoplasmatico (PERK) in risposta proteina spiegato 7. Sia NF90 e RBM3 si trovano prevalentemente nel nucleo, ma una piccola percentuale di NF90 e navetta RBM3 nel citoplasma e si legano lì gli uni agli altri per funzioni specifiche, ad esempio, per regolare l'attività vantaggio. Pertanto, è importante visualizzare la distribuzione delle interazioni NF90-RBM3 nel compartimento subcellulare, che può indicareloro diversi ruoli nel rispettivo comparto.

Decenni fa, lievito due ibridi (Y2H) è stato sviluppato per rilevare l'interazione tra due proteine 8. Tuttavia, a causa della costruzione artificiale di proteine ​​fuse, risultati falsi positivi hanno limitato l'applicazione di questo metodo. Per lungo tempo, co-immunoprecipitazione era la tecnica principale per analizzare le interazioni proteina-proteina, specialmente in condizioni endogene 9. Per analizzare il complesso proteico co-immunoprecipitato, Western blot è la tecnica più conveniente, mentre la spettrometria di massa è usato quando eccellente sensibilità e la precisione sono desiderati. Negli ultimi anni, saggio di prossimità legatura è stato sviluppato come un nuovo metodo per rilevare interazioni proteina-proteina in entrambe le cellule e tessuti in situ 10,11.

Qui, abbiamo confrontato il più popolare metodo di co-immunoprecipitazione e relativamente nuovo metodo di analisi di prossimità legatura a catturare NF9Interazione 0-RBM3 in frazioni subcellulari. Abbiamo anche discusso i vantaggi ei limiti di entrambe le tecniche.

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Protocollo

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1. Co-immunoprecipitazione

  1. Seed HEK293 cellule a 2 x 10 5 cellule per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti in 2 ml modificato (DMEM) supplemento di Dulbecco dell'Aquila con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 100 U / mL penicillina-streptomicina (Pen-Strep) .
  2. Crescere le cellule per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
  3. Lavare le cellule con soluzione salina fredda tampone fosfato (PBS) per tre volte. Celle di raccolta per centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  4. Preparazione delle frazioni nucleari e citoplasmatici utilizzando reagenti commerciali estrazione nucleari e citoplasmatici. Seguire le istruzioni del produttore con alcune modifiche.
    1. Utilizzare 3 x 10 6 cellule per un esperimento di co-immunoprecipitazione (circa il 90% di confluenza da 3 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti). Aggiungere 300 ml soluzione fredda citoplasmatica di estrazione (CER I) e vortex per 15 secondi alla massima velocità.
    2. Incubare per 30 minuti in ghiaccio. Durante l'incubazione, vortex per 5 s ogni 10 min.
    3. Aggiungere 16,5 ml di estrazione a freddo citoplasmatica soluzione II (CER II), vortex per 5 secondi e incubare per 5 minuti in ghiaccio.
    4. Vortex per 5 secondi e centrifugare a 16.000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    5. Trasferire il surnatante (estratto citoplasmatica) in un nuovo tubo pre-raffreddata, e tenere in ghiaccio fino al momento dell'utilizzo.
    6. Lavare pellet insolubili (nuclei contenenti) tre volte con 1 ml di PBS freddo ogni volta pipettando su e giù cinque volte. Rimuovere PBS dopo lavaggio.
    7. Aggiungere 150 ml soluzione di estrazione a freddo nucleare (NER), vortex per 15 secondi e incubare 1 ora su ghiaccio. Durante l'incubazione, vortex per 15 secondi e pipetta 10 volte con una punta di 200 microlitri ogni 10 min.
    8. Vortex per 15 s e centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C.
    9. Trasferire il surnatante (estratto nucleare) in un nuovo tubo pre-raffreddata, tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
  5. Estrarre il 10% del volume di estratti nucleari e citoplasmatici ciascuno come ingressi.
  6. UNdd PBS freddo ai rimanenti estratti ad un volume finale di 1 ml. Tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
    NOTA: Pre-clearing non è essenziale quando si utilizzano proteine ​​sfere magnetiche G-coniugato. Tuttavia, se lo sfondo è elevata, eseguire il pre-clearing incubando 40 microlitri di proteine ​​perline G-coniugati magnetici (50% liquami) e 1 ml diluito lisato da questo passaggio a 4 ° C per 30 minuti su un rotatore. surnatante separato (lisato pre-cancellati) da perline con cremagliera magnetica. Eliminare le perline.
  7. Per anticorpo primario coppia con sfere magnetiche proteine ​​G-coniugati, incubare 40 microlitri di proteine ​​sfere magnetiche G-coniugati (50% slurry) con anticorpi 4 mg policlonale di coniglio anti-RBM3 o IgG di coniglio (controllo negativo) in 200 ml di PBS più Tween 20 tampone (PBST, 0,02% Tween 20) a temperatura ambiente (RT) per 40 minuti su un rotatore.
  8. perline e surnatante separato anticorpo accoppiato con una cremagliera magnetica, e scartare il surnatante. Lavare le perline una volta con 200 microlitri PBST (0,02%).
  9. Aggiungere 1ml diluito lisati (o, se necessario, lisati pre-autorizzato) ai talloni e incubare su un rotatore a 4 ° C durante la notte.
  10. Il giorno successivo, separare le perline e il surnatante da una cremagliera magnetica, e scartare il surnatante. Lavare 3 x 10 minuti con 0,5 ml di PBST (0,02%) per ciascun tubo a 4 ° C su un rotatore con una velocità fissa di 20 rpm.
  11. Eluire proteine ​​delle perle con l'aggiunta di tampone campione di 40 microlitri (1x tampone campione commerciale e 50 mm 1,4-ditiotreitolo (DTT)). Riscaldare a 70 ° C per 10 min. Spin giù e travaso di liquidi in una nuova provetta da 1,5 ml.
  12. Diluire lisati input in tampone campione (concentrazione finale: tampone campione commerciale 1x e 50 mM DTT) e scaldare a 70 ° C per 10 min. ingressi di carico e proteine ​​immunoprecipitate dal l'ultimo passo di un prefabbricato 4-12% gel bis-Tris. Il volume di carico dei pozzetti non deve superare i 20 microlitri. Eseguire l'elettroforesi in tampone esecuzione commerciale 1x in ghiaccio per 35 min.
    NOTA: nucleare di carico ed estratto citoplasmaticas in un rapporto di 1: 2 (V / V), che riflette la stessa quantità iniziale di cellule.
  13. Trasferimento proteine ​​di membrana PVDF in tampone di trasferimento commerciale 1x a 30 V per 2 ore a 4 ° C.
  14. Block membrana con 5% di latte scremato in PBST (0,1% Tween 20) a temperatura ambiente per 40 minuti su un agitatore.
  15. Incubare a membrana con anticorpi primari (sia diluito in 1: 1.000) in PBST (0,1%) a 4 ° C durante la notte.
  16. Lavare 3 x 10 min con PBST (0,1%) a temperatura ambiente su un agitatore.
  17. Incubare a membrana con perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-topo o anti-coniglio anticorpi secondari (sia diluito in 1: 5.000) in PBST (0,1%) a temperatura ambiente per 1 ora.
  18. Lavare 3 x 10 min con PBST (0,1%) a temperatura ambiente su un agitatore.
  19. Utilizzare 0,2 ml chemiluminescenza (ECL) miscela di substrato per cm 2 di membrana, incubare a temperatura ambiente per 5 min. Evitare di tutta la luce da questo punto in poi, tranne luci rosse.
  20. Eliminare il liquido ed esporre ad una pellicola a raggi X in una cassetta di pellicola. Sviluppare pellicola utilizzando un pr pellicola automaticamacchina ocessing.

2. Immunocitochimica e di prossimità legatura Assay

  1. Seme HEK293 cellule a 1.5 x 10 4 cellule per camera in una 8-camera di poli-D-lisina scorrevole rivestito in 0,4 ml DMEM supplementato con 10% FBS e 100 U / ml Pen-Strep.
  2. Crescere le cellule per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
  3. Aspirare media, e fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) per 10 minuti a RT.
  4. Aspirare PFA, e lavare 3 x 10 minuti con 0,5 ml di PBS per ogni camera.
  5. Permeabilize e cellule blocco con 0,5% Triton X-100 e 5% di siero normale di capra (NGS) in PBS a temperatura ambiente per 1 ora.
  6. Incubare con anticorpi primari in 0,1% Triton X-100 e 5% in PBS NGS su agitatore a 4 ° C durante la notte. Diluire topo monoclonale anti-NF90 anticorpi e policlonale di coniglio anti-RBM3 anticorpi 1: 100 in PBS per doppia colorazione. Per il controllo negativo, omettere indipendentemente uno dei due anticorpi primari, e omettere entrambi gli anticorpi in un terzo controllo.
    NOTA: non utilizzare il blocco commerciale e reagenti diluizione.
  7. Lavare 3 x 10 minuti con 0,5 ml di PBS per camera.
  8. Con riserva di immunocitochimica o di prossimità protocolli di analisi legatura
    1. immunocitochimica
      1. Incubare con 1: 500 diluito verde colorante fluorescente accoppiati anti-topo e fluorescenti anti-coniglio anticorpi secondari rossi dye-accoppiato a temperatura ambiente per 1 ora. Evitare la luce da questo punto in poi.
      2. nuclei di contrasto con 4 ', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) diluito 1: 5000 in PBS a temperatura ambiente per 10 min.
      3. Lavare 3 x 10 minuti con 0,5 ml di PBS per camera.
      4. Rimuovere le camere del vetrino e asciutta. Montare con 250 μ, medio per vetrino di montaggio.
    2. test legatura di prossimità
      1. Preparare prossimità sonde test legatura. Mescolare e diluire due sonde di prossimità test legatura (anti-topo e anti-coniglio anticorpi secondari allegati con diversi oligonucleotidi che possono legare °ruvida aggiunta di altre due oligonucleotidi in soluzione legatura) sia 1: 5 in 0,1% Triton X-100 e 5% NGS in PBS, con un volume totale di 320 microlitri per una slitta 8-camera (circa 40 microlitri per cm 2) . Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
      2. Rimuovere le camere dal vetrino e aggiungere le sonde diluito. Incubare in un incubatore di umidità a 37 ° C per 1 ora.
      3. Preparare la soluzione legatura. Mescolare 8 ml ligasi, 64 ml 5 x legatura magazzino e 248 ml H 2 O.
      4. Preleva il liquido dalla diapositiva, e lavare 2 x 5 min in 1x tampone di lavaggio A (fornito con il kit).
      5. Aggiungere la soluzione legatura e incubare in un incubatore di umidità a 37 ° C per 30 min.
      6. Preparare la soluzione di amplificazione. Mix 4 microlitri polimerasi, 64 ml 5x amplificazione magazzino e 252 ml di H 2 O. Evitare la luce da questo punto in poi.
      7. Toccare il liquido dalla diapositiva, e lavare 2 x 2 min in 1x tampone di lavaggio A.
      8. Aggiungere l'amplificatoresoluzione lification e incubare in un incubatore umidità buio a 37 ° C per 100 min.
      9. Preleva il liquido dalla diapositiva, e lavare 2 x 10 min in 1x tampone di lavaggio B (fornito con il kit). Lavare per 1 min a 0,01X tampone di lavaggio B.
      10. Asciugare il vetrino e montare con 250 microlitri di un mezzo di montaggio commerciale (con DAPI) per vetrino.
  9. Esaminare segnali fluorescenti sotto un microscopio utilizzando una lente oculare 10X e 20X lente obiettivo. Acquisire le immagini da una telecamera CCD.

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Risultati

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Figura 1 dimostra che NF90 e RBM3 sono entrambe le proteine nucleari e solo una piccola frazione è presente nel citoplasma. In particolare, ci sono tre diverse bande colorate positivo per RBM3. Il più piccolo appena al di sotto del 20 kDa riflette la dimensione corretta del RBM3 (il peso molecolare previsto di RBM3 è di 17 kDa). L'origine delle altre due bande resta ancora da esplorare. esperimenti di co-immunoprecipitazione con RBM3 come la proteina esca hanno rivelato ...

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Discussione

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Ci sono diversi vantaggi e carenze per entrambi i metodi. Come relativamente nuova tecnica, un evidente vantaggio di dosaggio vicinanza legatura è la possibilità di chiarire le interazioni proteina-proteina a livello di singola cellula, invece di un lotto di cellule eterogenee. Immagini ad alta intensità e la risoluzione (ad esempio con microscopio confocale) prevedono la possibilità per la quantificazione contando macchie fluorescenti singoli. Al contrario, la combinazione convenzionale di tecnica di co-immuno...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto dal Fondo Nazionale Svizzero per la Ricerca Scientifica (FNS, 31003A_163305).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
L'aquila modificata di Dulbecco' s Medium (DMEM)SigmaD6429Alto glucosio
4.500 mg/L
Siero fetale bovino (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10270106
Penicillina-Streptomicina (PenStrep)BioConcept4-01F00-H
NE-PER Reagenti per estrazione nucleare e citoplasmaticaThermo Fisher Scientific78833
1,4-Ditiotreitolo (DTT)Carl Roth6908.3
Dynabeads Protein GNovex, Thermo Fisher Scientific10003D
DRBP76 (NF90/NF110) anticorpoBD Transduction Laboratories612154utilizzare 1:1.000 per WB e 1:100 per l'anticorpo ICC/PLA
RBM3ProteinTech14363-1-APutilizzare 1:1.000 per WB e 1:100 per ICC/PLA
Lamin A/C anticorpoCell Signaling Technology#2032usa 1:1.000 per WB 
anticorpo anti-GAPDHAbcamab8245uso 1:1.000 per WB 
coniglio normale IgGSanta Cruzsc-2027
anti-coniglio IgG, anticorpo secondario legato a HRPCell Signaling Technology#7074uso 1:5.000 per WB 
anticorpo secondario HRP anti-topoCarl Roth4759.1uso 1:5.000 per WB 
Substrato di blotting ECL occidentale ClarityBio-Rad#1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris GelNovex, Thermo Fisher ScientificNP0321BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0002
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP00061
Amersham Hypond P 0.2 Membrana PVDFGE Healthcare Life Sciences10600021
Poli-D-lisina Vetrino per coltura a 8 pozzettiCorning BioCoat354632
Paraformaldeide (PFA)SigmaP6148
Siero di capra normale (NGS)Gibco, Thermo Fisher Scientific PCN5000
IgG anti-topo di capra (anticorpo H+L), Alexa Fluor 488 coniugatoThermo Fisher ScientificA-11001
IgG anti-coniglio di capra (anticorpo H+L), Alexa Fluor 568 coniugatoThermo Fisher ScientificA-11011
4′, 6-diamidin-2-fenilindolo (DAPI)SigmaD9542
Duolink PLA sonda Anti-mouse PLUSSigmaDUO92001
Duolink PLA sonda Anti-coniglio MINUSSigmaDUO92005
Reagenti di rilevamento Duolink RossoSigmaDUO92008
Duolink Tamponi di lavaggio FluorescenzaSigmaDUO82049
Duo Mezzo di montaggio con DAPISigmaDUO82040
Mowiol 4-88Sigma81381
MicroscopioOlympusAX-70
Telecamera CCDSPOTInsight 2MP Firewire
Pellicola radiograficaFujifilmSuper RX
Macchina per l'elaborazione di pellicoleFujifilmFPM-100A

Riferimenti

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  1. Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
  2. Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
  3. Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
  4. Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
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  6. Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
  7. Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
  8. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  9. Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
  11. Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
  12. Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).

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