Cellule umane del polmone dendritiche: distribuzione spaziale e fenotipica di identificazione in endobronchiale biopsie utilizzando l'immunoistochimica e citometria a flusso

Sommario

Le cellule immunitarie residenti nei polmoni, comprese le cellule dendritiche (DC) negli esseri umani, sono fondamentali per la difesa contro i patogeni e gli allergeni inalati. Tuttavia, a causa della scarsità di tessuto polmonare umano, gli studi sono limitati. Questo lavoro presenta protocolli per l'elaborazione di biopsie endobronchiali della mucosa umana per lo studio delle DC polmonari utilizzando l'immunoistochimica e la citometria a flusso.

Abstract

I polmoni sono costantemente esposti all'ambiente esterno, che oltre a particelle innocue, contiene anche agenti patogeni, allergeni e tossine. Al fine di mantenere la tolleranza o di indurre una risposta immunitaria, il sistema immunitario deve gestire in modo appropriato gli antigeni inalati. Le cellule dendritiche polmonari (DC) sono essenziali per mantenere un delicato equilibrio per avviare l'immunità quando necessario senza causare danni collaterali ai polmoni a causa di una risposta infiammatoria esagerata. Mentre esiste una comprensione dettagliata del fenotipo e della funzione delle cellule immunitarie come le DC nel sangue umano, la conoscenza di queste cellule in tessuti meno accessibili, come i polmoni, è molto più limitata, poiché gli studi su campioni di tessuto polmonare umano, specialmente da individui sani, sono scarsi. Questo lavoro presenta una strategia per generare una caratterizzazione spaziale e fenotipica dettagliata delle DC residenti nel tessuto polmonare in esseri umani sani sottoposti a broncoscopia per il campionamento di biopsie endobronchiali. Da ogni individuo possono essere raccolte diverse piccole biopsie che possono essere successivamente incorporate per il sezionamento ultrafine o digerite enzimaticamente per l'analisi citofluorimetrica avanzata. I protocolli delineati sono stati ottimizzati per fornire il massimo delle informazioni da piccoli campioni di tessuto che, in condizioni di stato stazionario, contengono solo una bassa frequenza di DC. Mentre il presente lavoro si concentra sulle DC, i metodi descritti possono essere direttamente ampliati per includere altre cellule (immunitarie) di interesse che si trovano nel tessuto polmonare mucoso. Inoltre, i protocolli sono direttamente applicabili anche a campioni ottenuti da pazienti affetti da malattie polmonari in cui la broncoscopia fa parte dell'accertamento della diagnosi, come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), la sarcoidosi o il cancro del polmone.

Introduzione

I polmoni sono in continuo contatto con l'ambiente esterno e sono esposti a entrambe le particelle innocue e microbi con la capacità di causare la malattia. Pertanto, è fondamentale per il sistema immunitario di montare potenti risposte immunitarie contro patogeni, ma è altrettanto importante mantenere la tolleranza agli antigeni inalati che non causano malattie. Per fornire potenti sorveglianza immunitaria, il sistema respiratorio è fiancheggiata da una rete di cellule del sistema immunitario, comprese le cellule dendritiche (DC). DC sono cellule professionali presentanti l'antigene con la capacità unica di attivare le cellule T naive. In polmoni umani, DC residenti incontrano un antigene e poi processo e trasportano ai linfonodi polmonari drenanti per presentazione e l'attivazione delle cellule T ^{1, 2, 3.}

Nel sistema immunitario umano, DC può essere suddiviso in più sottoinsiemi, con distinct ma sovrapposte funzioni: CD1c ⁺ e CD141 ⁺ DC mieloidi (MDC) e CD123 ⁺ cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) ^{4, 5.} Mentre la maggior parte conoscenza dettagliata sulle DC umana deriva da studi di sangue, è ormai evidente che i polmoni umani porto anche rare popolazioni di sottoinsiemi DC con cellule T capacità stimolante ^{6, 7, 8, 9.} Tuttavia, i dati accumulati dimostrano che le cellule immunitarie, tra DC, differiscono nella loro frequenza, fenotipo e funzione a seconda della loro posizione anatomica ^10. Pertanto, è importante studiare le cellule immunitarie dal tessuto rilevante per comprendere il loro contributo alla immunità locale e tolleranza. Nel loro insieme, questo sottolinea la necessità di studiare DC polmone residente al momento di affrontare le malattie polmonari, nonostante DC sangue che viene più facilmente disponibili e accessibili nell'uomo.

I primi studi che hanno indagato DC polmonari residente nell'uomo utilizzassero principalmente morfologia e l'espressione dei singoli marcatori, come HLA-DR e CD11c, in sezioni di tessuto usando immunoistochimica ^{11, 12, 13.} Al contrario, studi più recenti hanno di solito fatto affidamento su analisi di citometria di flusso per studiare diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie. Tuttavia, poiché è difficile trovare un singolo marker superficie cellulare che identifica univocamente uno specifico sottoinsieme DC, il potenziale limitazione di studi applicando citofluorimetria solo quattro colori è il rischio di inclusione popolazioni cellulari con marcatori fenotipici simili come DC. Ad esempio, CD11c è espresso su tutte DC mieloidi e la stragrande maggioranza dei monociti. D'altra parte, negli studi di applicazione di pannelli più avanzati citometria di flusso, tessuto polmonare non-cancerose da resezioni chirurgiche di pazienti sono stati in genere utilizzatoxref "> ^{10, 14, 15, 16,} anche se non è chiaro se queste popolazioni rare sono veramente rappresentativi delle DC presente in soggetti sani. Nel complesso, gli studi sono limitati in gran parte dovuto al fatto che rimosso chirurgicamente o tutto il tessuto polmonare umano è scarso.

Per superare alcune di queste limitazioni, questo lavoro descrive come eseguire una dettagliata analisi della distribuzione spaziale e l'identificazione fenotipica delle DC in biopsie endobronchiali mucosa ottenuti da volontari sani che si sottopongono a una broncoscopia. Diversi piccoli biopsie possono essere raccolti da ogni individuo e possono essere successivamente integrati per il sezionamento e l'analisi mediante immunoistochimica o enzimaticamente digerito per analisi avanzata citometria a flusso. Usando tessuto polmonare in forma di biopsie endobronchiali ottenuti broncoscopie conferisce il vantaggio di rendere possibile l'esecuzione della study su volontari sani, a differenza chirurgia aperta dei polmoni che, per ovvi motivi, è limitata a pazienti che necessitano di chirurgia toracica. Inoltre, il tessuto che viene campionata durante una broncoscopia da volontari sani è fisiologicamente normale, in contrasto ad una zona non interessata del tessuto polmonare in pazienti con malattia polmonare. D'altra parte, le biopsie sono piccole e il numero di cellule recuperate, anche quando il pool diverse biopsie, limita il tipo di analisi che possono essere eseguite.

Mentre il presente lavoro si concentra sulla DC, i metodi descritti può essere ampliato per includere direttamente altre cellule del sistema immunitario () di interesse che si trovano nel tessuto mucoso polmone umano. Inoltre, i protocolli sono direttamente applicabili ai campioni ottenuti da pazienti affetti da malattie polmonari dove broncoscopia fa parte di stabilire la diagnosi, come la malattia cronica ostruttiva (BPCO), sarcoidosi, o il cancro ai polmoni.

Protocollo

NOTA: Questa ricerca è stato approvato dal Etico Review Board regionale in Umeå, Svezia.

1. broncoscopia per il campionamento endobronchiale biopsie di soggetti umani

1. Ottenere il consenso informato da tutti i partecipanti.
2. Trattare soggetti con midazolam per via orale (4-8 mg) e glicopirronio per via endovenosa (0,2-04 mg) 30 minuti prima della broncoscopia. Applicare anestesia topica con lidocaina nella laringe e bronchi. Lasciate che il gargarismo soggetto con ~ 3 ml di lidocaina al 4% e si applicano 3 ml alla base della lingua e nella laringe tramite una siringa laringe. Ottimizzare l'anestesia topica con 8-10 dosi di spray lidocaina. Effettuare questa operazione con la seduta soggetto.
3. Inserire un video broncoscopio flessibile attraverso la bocca tramite un boccaglio di plastica con il soggetto in posizione supina. Utilizzare uno spray catetere appositamente creati per completare l'anestesia topica della trachea distale e bronchi attraverso il broncoscopio. Qui, usare una dose di circa5-10 ml di lidocaina 2%.
4. Prendere 6-9 endobronchiali biopsie della mucosa dalla carena principale e le principali divisioni bronchiali con pinze fenestrate (Figura 1). Dopo la broncoscopia e prima di lasciare l'ospedale, lasciare che il resto soggetto per 2-4 ore e di fornire lui / lei con un pasto leggero.

2. Incorporare biopsie in glicole metacrilato (GMA) Resina

NOTA: Il protocollo immunostaining GMA è stato originariamente sviluppato presso l'Università di Southampton, Istochimica Unità di Ricerca ^17.

1. Fissazione: Per l'immunoistochimica, rimuovere le biopsie delle pinze e metterli direttamente in fiale di vetro contenenti 3 ml di inibitori di acetone e proteasi disidratati ghiacciate (phenylmethylsulfonyl fluoruro (35 mg / 100 ml di acetone) e iodoacetamide (370 mg / 100 ml di acetone )). Fissare il tessuto durante la notte a -20 ° C (figura 2).
   NOTA: Le seguenti operazioni devono essere Perfoconfermate in una cappa aspirante con opportuni guanti di nitrile. Il kit embedding contiene componenti che possono causare reazioni di sensibilizzazione, irritazione, e / o cutanee allergiche. Tutti i rifiuti devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi.
2. Disidratazione: Rimuovere l'acetone con gli inibitori e sostituire con acetone fresco disidratato (senza inibitori) per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovere l'acetone e sostituirlo con benzoato di metile per 15 min.
3. Infiltrazione: Preparare una soluzione di elaborazione di 5% soluzione di metil benzoato di glicole metacrilato monomero; 10 ml è sufficiente per un flaconcino. Usando una pipetta Pasteur plastica, aspirazione Eliminare la soluzione metil benzoato e sostituirlo con 3 ml di soluzione di elaborazione. Incubare le biopsie e soluzione di elaborazione eccesso a 4 ° C per 2 ore; pipette Pasteur possono essere usati per tutte le successive modifiche soluzioni, tra cui incorporamento soluzione.
4. Sostituire la soluzione di elaborazione ogni 2 ore (3x 2 incubazione hr), quindi il tempo di infiltrazione totale del biopsies nella soluzione di elaborazione è di almeno 6 ore. Inserire etichette di carta nella parte alta delle capsule embedding per identificare le biopsie.
5. Preparare una soluzione incorporamento di perossido di benzoile 75 mg in 10 ml di glicol metacrilato monomero. Aggiungere 0,25 ml di N, N poli -dimethylaniline (ossido di etilene) (acceleratore) alla soluzione embedding per iniziare la reazione di polimerizzazione. Rimuovere la soluzione di elaborazione e mettere una biopsia nella capsula embedding rilevanti con pinze.
6. Lentamente riempire la capsula embedding verso l'alto con l'incorporamento soluzione e chiudere il tappo. Evitare di disturbare la biopsia e la creazione di grosse bolle d'aria. Incubare le capsule a 4 ° C fino a quando la resina si è completamente polimerizzato.
7. Conservare le biopsie incorporati a -20 ° C in una provetta da 50 ml contenente circa 5 g di gel di silice.

3. Sezione del GMA-embedded endobronchiali biopsie

1. Rivestimento vetrino da microscopio: Lavare i vetrini da microscopio in unlavastoviglie su un ciclo normale. Coprire le diapositive e lasciare asciugare all'aria.
2. Preparare una soluzione di rivestimento di 10% di poli-L-lisina soluzione (PLL) in acqua distillata. Immergere i vetrini in soluzione di rivestimento per 5 minuti, e poi lasciarli asciugare all'aria. Conservare diapositive PLL rivestite secco nelle loro scatole originali.
3. Lavare le strisce lastra di vetro con il 0,1% di Tween 20 in acqua distillata. Sciacquare il bicchiere con il 70% di etanolo e asciugare con carta assorbente. Tagliare lame di vetro dalla striscia di vetro con un produttore di coltello. Conservare le lame in un contenitore che impedisce il movimento di assicurare che il bordo di taglio non venga danneggiato o scheggiato.
4. Biopsia taglio: Posizionare la capsula biopsia in uno splitter capsule e ridurre ogni lato con una lama singola-edge in acciaio al carbonio. Rimuovere la biopsia GMA-embedded e fissarlo saldamente in una morsa. Trim eccesso GMA da tutto il biopsia utilizzando la lama in acciaio.
5. GMA sezionamento.
   1. Preparare la soluzione di ammoniaca 0,05% con acqua distillata. Posizionare il coltello vetro e la biopsia in the microtomo. Allineare con cura il blocco biopsia con la lama regolando il portalama e l'angolo del blocco biopsia modo che la lama si appoggia piatta contro la superficie del blocco.
   2. Tagliare 2 micron sezioni spesse utilizzando il microtomo su una velocità di taglio lento e utilizzare pinze per trasferire e galleggiare le sezioni in acqua ammoniaca. Float sezioni per 45-90 secondi, permettendo delicato recupero antigene e dispiegarsi della sezione.
   3. Pick up sezioni con vetrino da microscopio. Controllare l'istologia biopsia mediante colorazione rapidamente con blu di toluidina.
   4. Essiccare i vetrini su un insieme piastra calda a 50 ° C e applicare 500 ml di toluidina filtrato blu macchia da una sezione con una pipetta di plastica Pasteur. Scaldare la sezione sulla piastra calda fino a quando un anello verde comincia ad emergere ai margini della macchia, e poi lavare con acqua.
   5. Utilizzando un microscopio ottico, controllare l'istologia biopsia. Sezioni utilizzati per immunoistochimica dovrebbero contenere buone zone della lamina integrepropria e dell'epitelio, con il minor numero di ghiandole e il meno della muscolatura liscia possibile.
   6. Come nella sezione 3.4.2, tagliare sezioni che hanno un buon istologia e prenderli con vetrini da microscopio PLL-rivestite per la colorazione immunoistochimica. Tagliare almeno due sezioni da ciascuna biopsia per l'analisi. diapositive asciugare per almeno 1 ora. Dopo l'essiccazione, le sezioni possono essere avvolti in carta stagnola e conservati a -20 ° C per 2 settimane, oppure possono essere immediatamente immunoistochimica.

4. la colorazione immunoistochimica di GMA-embedded endobronchiali biopsie

NOTA: sodio azide è tossica. Preparare la soluzione di sodio azide 0,1% all'interno di una cappa aspirante e lontano da acidi. A contatto con acidi libera gas tossico.

1. Tracciare intorno sezioni utilizzando una penna a punta di diamante e organizzare le diapositive su una griglia colorazione.
2. Eseguire un blocco perossidasi. Preparare una soluzione blocco perossidasi di perossido di idrogeno 0,3% in soluzione di sodio azide 0,1%. Apply 1 ml del blocco perossidasi di sezioni e incubare per 30 min.
3. Preparare una soluzione di lavaggio di 0,05 M salina Tris tamponata (TBS), pH 7,6. Lavare i vetrini in TBS, 3x 5 min.
4. Preparare una soluzione blocco BSA 1% in DMEM. Fate questo in anticipo e in grandi volumi, aliquotare e congelare fino al momento. Scolate le diapositive e incubare sezioni in soluzione di blocco per 30 minuti per bloccare legame degli anticorpi non specifico. Se legame aspecifico verifica ancora, includere una fase di incubazione 30 min con 5% siero di blocco della stessa specie l'anticorpo secondario.
5. Diluire anticorpo primario (CD45 o CD1a) in TBS alla concentrazione desiderata (CD45 diluito 1: 1.000; CD1a diluito a 1: 1,00) e applicarla alle diapositive. Coprioggetti sezioni e incubare una notte a temperatura ambiente.
6. Lavare i vetrini in TBS tre volte. Diluire anticorpo secondario biotinilato (diretto contro le specie ospite anticorpi primari, in questo caso di coniglio anti-topo F (ab _'2)) in TBS alla concentrazione desiderata (1:300 diluizione) e applicarla alle diapositive. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
7. Preparare una streptavidina biotina-perossidasi almeno 30 minuti prima dell'uso. Assicurarsi che vi sia sufficiente a coprire tutte le diapositive. Lavare i vetrini in TBS tre volte. Applicare la soluzione ai vetrini e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
8. Lavare i vetrini in TBS tre volte. Preparare 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC) soluzione di substrato perossidasi (fatta secondo le istruzioni del produttore). Applicare alle diapositive e incubare per 20-30 minuti o fino a quando l'intensità colorazione desiderata si sviluppa.
9. Sciacquare i vetrini in acqua corrente per il 5 min. Controcolorare sezioni con la soluzione ematossilina di Mayer filtrata per 2 minuti. Lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min.
10. Scolate le diapositive e coprire le sezioni con un mezzo di montaggio acquoso permanente. Essiccare i vetrini a 80 ° C in un forno di essiccazione. Lasciare raffreddare i vetrini, e poi montarli con DPX e posto un vetrino.

5. StAnalisi aining

1. Analizzare le sezioni a 40X di ingrandimento utilizzando un microscopio ottico con una telecamera montata collegata a un computer.
   NOTA: Per l'analisi cellulare, conteggio positivamente macchiato, cellule nucleate all'interno della lamina propria bronchiale e l'epitelio intatto, escluse le aree di muscolo liscio, le ghiandole, grandi vasi sanguigni e il tessuto non corrispondenti o danneggiato.
2. Calcolare la media dei conteggi delle cellule e correggere il numero medio di cellule per l'area della lamina propria e la lunghezza dell'epitelio. L'area della lamina propria e la lunghezza dell'epitelio può essere calcolato utilizzando un programma di analisi di immagine.

6. digestione enzimatica di endobronchiali biopsie

1. Biopsie di lavaggio: Utilizzando pinze sterili, posto biopsie intatti in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) (Figura 3). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante a 30 rpm. Trasferire le biopsie a un d steriliish per decantazione il contenuto della provetta 15 ml con HBSS.
2. L'interruzione di muco con DTT: Sostituire il HBSS nel tubo con 10 ml di HBSS contenente 5 mM 1,4-ditiotreitolo (DTT). Trasferire le biopsie di nuovo nel tubo da 15 ml con pinza sterile. Incubare per 15 minuti a RT su una piattaforma oscillante a 30 rpm.
3. Agitare il tubo dolcemente per 15 sec. Trasferire le biopsie su un piatto sterile per decantazione il contenuto della provetta 15 ml di HBSS e DTT.
4. Trasferire le biopsie al mezzo di coltura: sostituire il HBSS e DTT nel tubo con 10 ml di RPMI 1640 medium coltura. Trasferire le biopsie di nuovo nel tubo da 15 ml con pinza sterile. Incubare per 10 minuti a RT su una piattaforma oscillante a 30 rpm.
5. Digerire biopsie con collagenasi e DNasi.
   1. Preparare una soluzione di digestione di collagenasi II (0,25 mg / ml) e DNase (0,2 mg / ml) in RPMI preriscaldata contenente soluzione 1 M HEPES. Aggiungere 500 ml di soluzione di digestione per bene in un culto del tessuto 48 pozzettipiatto ure.
   2. Mettere 1 biopsia per pozzetto in soluzione digestione. Incubare la piastra su una piattaforma agitazione per 60 min a 37 ° C a 220 rpm. Pipetta su e giù dopo 30 min di ri-disperdere le biopsie, e dopo 60 min, di disaggregare completamente il tessuto.
6. Preparazione sospensioni singola cella.
   1. Pool insieme biopsie digerito dai pozzetti in una provetta da 50 ml di passare attraverso un filtro cella 40 micron. Raccogliere le cellule rimanenti lavando i pozzetti con tampone FACS ghiacciata (tampone fosfato salino (PBS) contenente 2% di siero fetale bovino).
   2. Comprimere il tessuto rimanente sul setaccio cellulare utilizzando il retro dello stantuffo di una siringa. Centrifugare le cellule digeriti a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di tampone FACS ghiacciata. Contare le cellule utilizzando un emocitometro manualmente e Trypan blu macchia per valutare la vitalità delle cellule.

7. Analisi citofluorimetrica di cellule singole di endobronchiale biopsie dopo digestione enzimatica

1. Risospendere il pellet cellulare a circa 1 x 10 ⁶ cellule in 200 microlitri di tampone FACS.
2. Aggiungere un colorante vitalità cellulare per esclusione cellule morte secondo il protocollo del produttore.
3. Aggiungere 5 ml di FcR reagente di blocco e incubare per 5 minuti a 4 ° C.
4. Aggiungere gli anticorpi di superficie cellulare contro CD45 (2 ml), stirpe (CD3, CD20, CD56, CD66abce, e CD14, 2 ml ciascuna), CD16 (0,5 ml), HLA-DR (3 ml), CD11c (5 ml), CD123 (5 ml), CD1c (3 ml), e CD103 (2 mL) e incubare per 15 min a 4 ° C. Dettagli sulla anticorpi possono essere trovati nella sezione Metodi, ma, TITOLARE e ottimizzare gli anticorpi al flusso preciso citometro in uso. Lavare anticorpi in eccesso con PBS per 5 min a 400 x g. Acquisire i campioni freschi su un citofluorimetro o fissare le cellule in 1% paraformaldeide prima Acquisiz tardiionico.
5. Identificare dendritiche umane in biopsie polmonari utilizzando un citofluorimetro dosaggio ¹⁸ (Figura 4).
   NOTA: l'utilizzo di un software di analisi di citometria a flusso, le cellule immunitarie si distinguono dalle altre cellule polmonari da gating su CD45. Le cellule morte possono essere escluse come cellule che sono positivi per il colorante Live / Dead. Di tutti CD45 ⁺ dal vivo le cellule, le cellule lignaggio (cellule B, le cellule T, le cellule NK, neutrofili e monociti) può essere escluso con un cocktail di anticorpi contro CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14, CD16 e in un canale. Dopo che le cellule, HLA-DR ⁺ permetteranno l'identificazione di tutti i DC umane. MDC possono essere distinti da PDC in base alla espressione di CD11c o la mancanza di CD11c, rispettivamente. MDC possono essere ulteriormente suddivise in CD1c ⁺ MDC o CD141 ^+.

Risultati

Gli studi che caratterizzano le cellule dei tessuti residenti delle vie respiratorie umane del sistema immunitario, tra cui DC, sono limitate, in gran parte dovuto al fatto che rimosso chirurgicamente o tutto il tessuto polmonare umano è scarso. Qui, un metodo meno invasivo per ottenere tessuto polmonare da biopsie endobronchiali (EBB) su volontari sani e protocolli sviluppati per studiare le cellule immunitarie nel tessuto mediante immunoistochimica o citometria a flusso sono delineati....

Discussione

Questo documento descrive come generare una caratterizzazione spaziale e fenotipica dettagliata del polmone DC tessuti residenti negli esseri umani sani utilizzando immunoistochimica e citometria a flusso su biopsie della mucosa endobronchiali raccolti durante la broncoscopia. Nei paragrafi seguenti passaggi critici nel protocollo sono discusse in dettaglio.

I passaggi critici con il protocollo

Sezionamento e immunoistochimica: E 'fondamentale per mantenere i bl...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bronchoscopy
Broncoscopio BF1T160	Sorgente luminosa Olympus
	Olympus	Exera CV-160
Pinza fenestrata	Olympus	FB21C	Utilizzato per eseguire biopsie
Blocco del morso	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glucosio 25%			500 ml
glicopirronio bromuro 0,2 mg/ml			per via endovenosa. Previene la secrezione di muco/saliva
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o			Può essere utilizzato per un rilassamento extra
Lidocaina, 40 mg/ml			Somministrazione di bocca e gola / Gargarismi
Lidocaina 100 mg/ml spray			Somministrato alla parte posteriore della gola
Lidocaina 20 mg/ml spray			Somministrato tramite broncoscopio alle vie aeree
GMA processing and embedding
Fiale			5 ml
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-1L
Setacci molecolari, 4 Å	Alfa Aesar	88120	Pellet da 3-4 mm di diametro
Fenilmetilsulfonilfluoruro	Sigma-Aldrich	P-7626	0,035 g/100 ml di acetone
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I-6125	0,37 g/100 ml di acetone
Politene-piatto  Capsule di inclusione TAAB	TAAB laboratories	C094	500x 8 mm di diametro, politene, capsule a fondo piatto
Portacapsule	TAAB	laboratories C054	Contiene 25 capsule da 8 mm
JB-4 GMA embedding kit	Polysciences	00226	Contiene JB-4 soluzione A (0026A-800), JB-4 soluzione B (0026B-3.8), perossido di benzoile (02618-12)
Metil benzoato	Sigma-Aldrich	27614-1L
Gel di silice con indicatore di umidità	Scharlau	GE0043	2,5-6 mm
GMA sezionamento
Vetrini per microscopio	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Bordi tagliati, estremità smerigliata
Soluzione di poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 per soluzione di lavoro
Lastre di vetro per ultramicrotomia	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wash soluzione (0,1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Separatore di capsule	TAAB laboratories	C065
Lame a filo singolo in acciaio al carbonio	TAAB laboratories	B054
Morsa
Ammoniaca, 25%	VWR	1133.1000	2 ml in 1 L, 1:500 (0,05%)
Microtomo	Leica		Leica RM 2165
Sorgente luminosa	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscopio con supporto a braccio oscillante	Leica		Leica MZ6
GMA Immunoistochimica
Penna con punta di diamante	Histolab	5218
Perossido di idrogeno 30% soluzione	AnalaR Normapur	23619.264
Sodio azide	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Cloruro di sodio	VWR sostanze chimiche	27810.295
Albumina sierica bovina	Millipore	82-045-2	Probumina BSA grado diagnostico
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anticorpo CD45 umano	BioLegend	304002	Topo monoclonale, clone HI30, isotipo IgG1k. Concentrazione di lavoro di 500 ng/ml
Anticorpo CD1a umano	AbD Serotech	MCA80GA	monoclonale di topo, clone NA1/34-HLK, isotipo IgG2a. Concentrazione di lavoro di 10 & micro; g/ml
Controllo dell'isotipo IgG1 monoclonale di topo	Abcam	ab27479
Controllo dell'isotipo IgG2a monoclonale di topo	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite kit standard	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-ammino-9-etilcarbazolo) substrato di perossidasi aquilone	Vector Labs	SK-4200
Mayers ematossilina	HistoLab	01820
Mezzo di montaggio acquoso permanente	AbD Serotech	BUF058C
Forno
essiccazione DPX soluzione di montaggio permanente	VWR	360292F
Microscopio ottico	Leica		Leica DMLB
Fotocamera per microscopio	Leica		Leica DFC 320
Software di analisi	Leica		Leica Qwin V3
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Ditiotreitolo (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Collagenasi II	Sigma-Aldrich	C6885
DNasi	Sigma-Aldrich	10104159001  ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Pinza
a bilanciere con piattaforma	Grant instruments	PMR-30
conici da 50 ml	Falcon	14-432-22
40 &; filtro cellulare	m Falcon	352340
Citometria a flusso
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Kit colorante per cellule morte riparabile Aqua	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD
CD56	Biolegend	318332
CD66abce	Miltenyi	130-101-132
HLA-DR	BD
CD14	BD	557831
CD16	Biolegend	302026
CD11c	BD	560369
CD1c	Miltenyi	130-098-009
CD141	Miltenyi	130-090-514
CD103	Biolegend	350212
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	F8775
LSR II Citometro a flusso	Citometro a flusso	FlowJo
	FlowJo		Software per analisi