Articolo metodologico
Questo protocollo descrive una tecnica di dosaggio individuale scalabile di dosaggio in Drosophila che fornisce dati robusti e quantitativi per misurare il comportamento di manipolazione. Il metodo si basa sulla comparazione della differenza di accumulo di tinture nei corpi di animali non trattati e trattati in un determinato periodo di tempo.
Il comportamento di grooming di Drosophila è un complesso programma locomotore multiplo che richiede un movimento coordinato di entrambi i lati e le zampe. Qui presentiamo un protocollo di dosaggio e un nuovo disegno a camera che è economicamente efficiente e scalabile per studi su piccola o larga scala di Drosophila . Le mosche vengono spolverate in tutto il corpo con la colorazione gialla brillante e hanno dato tempo per rimuovere il colorante dai loro corpi all'interno della camera. Le mosche vengono quindi depositate in un determinato volume di etanolo per solubilizzare il colorante. Sono misurate e registrate l'assorbanza spettrale relativa dei campioni di coloranti etanolo per animali da allevamento contro animali non macellati. Il protocollo fornisce dati quantitativi di accumulo di tinture per singole mosche, che possono essere facilmente mediate e confrontate tra campioni. Ciò consente ai disegni sperimentali di valutare facilmente le abilità di cura per gli studi sugli animali mutati o sulle manipolazioni dei circuiti. Questa procedura efficace è versatile e scalabile. Mostriamo wOrc-flow del protocollo e dati comparativi tra animali WT e animali mutanti per il Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR ).
Il grooming in Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) è un comportamento robusto innato che coinvolge il coordinamento di più programmi motori indipendenti 1 . I frutti volano puliscono i loro corpi di polvere, microbi e altri agenti patogeni che potrebbero inibire la normale funzione fisiologica, come la vista e il volo, o portare a importanti sfide immunitarie. Nel rilevare e reagire sia all'attivazione meccanica 2 che all'immunizzazione 3 , le mosche si ripetono a strofinare le gambe insieme o su una regione corporea mirata fino a quando non è sufficientemente pu....
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1. Preparazione
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Il dosaggio di cure rende dati quantitativi per valutare le prestazioni comportamentali basate sul residuo relativo della colorante accumulata lasciata sui corpi delle mosche dopo un tempo di misura impostato per la cura (30 min). Le figure di esempio del disegno della camera di scorrimento scorrevole e delle fasi principali del dosaggio sono evidenziate in figura 1 . Le mosche aggregano una quantità significativa di tintura dalla polverizzazione immedia.......
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Il test di cura è relativamente semplice, ma avremmo cautela i sperimentatori a prestare particolare attenzione ai seguenti problemi. Il mantenimento di una guarnizione a tenuta stretta delle viti sulle piastre superiore e inferiore dopo l'introduzione di mosche e tinture è essenziale per i risultati riproducibili. Il colorante giallo brillante è molto fine e le giunture sciolte consentiranno perdite di tintura dai bordi della camera. L'irregolarità del contenuto di tinture per ciascun pozzetto potrebbe facilmen.......
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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Desideriamo ringraziare Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon e Rose Hedreen per iniziare a sperimentare e stabilire questa metodologia e progetti di camera. Ringraziamo Kelly Tellez e Graham Buchan per la lettura e la modifica del manoscritto. Ringraziamo Andrew Seeds e Julie Simpson per il loro lavoro pionieristico e il loro consiglio e supporto per suggerire l'uso di Brilliant Yellow Dye (Sigma). Questo lavoro è sostenuto in parte da Mary E. Groff Chirurgia e Ricerca Medica e Educazione Charitable Trust, il Bronfman Science Center, e Hellman Fellows Program.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubo trasparente in PVC Tygon ad alta flessibilità | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", utilizzato con puntali per micropipettor e rete per costruire aspiratori orali |
| Puntali per micropipette (1 mL e 200 μ L) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Utilizzato per costruire la camera di toelettatura e gli aspiratori per la bocca |
| Dumont #5 Pinze | Roboz Strumento chirurgico | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | si consiglia l'uso di guanti in nitrile durante la manipolazione di questo prodotto |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | impostato per "toccare" |
| Etanolo | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | VWR International | 10025-726 | |
| Provette per microcentrifuga da 0,65 mL | VWR International | 20170-293 | possono essere riutilizzate con saggi successivi |
| Piastra UV a 96 pozzetti | Corning | ||
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | è necessario scaricare il catalogo per accedere al numero | di prodotto http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Software per lettore e imager per micropiastre | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" plastica acrilica | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 dadi | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" viti a testa esagonale | McMaster-Carr | 92185A199 | la piastra inferiore deve essere filettata per questa vite |
| di dimensioni 8 - 32 x 1/2" viti a testa esagonale | McMaster-Carr | 92185A194 | la seconda piastra dall'alto deve essere filettata |
| 2 - 56 3/8" viti a croce a testa piatta | McMaster-Carr | 91500A088 | queste tengono insieme le due piastre centrali |
| 0,175" ID, 1/4" OD, 0,34" tubo in alluminio | McMaster-Carr | 92510A044 | Prodotto internamente; Il prodotto elencato ha all'incirca le stesse dimensioni e dovrebbe funzionare per viti di misura 8. Questi fungono da guaine per le viti da 1" e posizionano leggermente il cappuccio esagonale verso l'alto rispetto alla superficie della piastra superiore |
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