La stimolazione di Notch segnalazione in mouse osteoclasti Precursori

Sommario

La segnalazione notch è una forma di comunicazione cellulare che si basa sul contatto diretto tra le cellule. Per indurre correttamente la segnalazione di Notch in vitro, i ligandi di Notch devono essere presentati alle cellule in uno stato immobilizzato. Questo protocollo descrive i metodi per la stimolazione in vitro della segnalazione Notch nei precursori degli osteoclasti di topo.

Abstract

La segnalazione Notch è una componente chiave di molteplici processi fisiologici e patologici. La natura della segnalazione di Notch, tuttavia, rende difficile l'indagine in vitro dei suoi ruoli variabili e talvolta contraddittori. Come componente della comunicazione diretta cellula-cellula sia con i recettori che con i ligandi legati alla membrana plasmatica, la segnalazione Notch non può essere attivata in vitro con la semplice aggiunta di ligandi ai terreni di coltura, come è possibile con molte altre vie di segnalazione. Invece, i ligandi di Notch devono essere presentati alle cellule in uno stato immobilizzato.

Le variazioni nei metodi di attivazione della segnalazione Notch possono portare a risultati diversi nelle cellule in coltura. Nei precursori degli osteoclasti, in particolare, le differenze nei metodi di stimolazione di Notch e nella coltura e differenziazione dei precursori degli osteoclasti hanno portato a disaccordo sul fatto che la segnalazione di Notch sia un regolatore positivo o negativo della differenziazione degli osteoclasti. Mentre confronti più ravvicinati della differenziazione degli osteoclasti in diverse condizioni di stimolazione di Notch in vitro e modelli genetici hanno ampiamente risolto la controversia riguardante la segnalazione di Notch e gli osteoclasti, metodi standardizzati di stimolazione continua e temporanea della segnalazione di Notch in cellule in coltura potrebbero prevenire tali discrepanze in futuro.

Questo protocollo descrive due metodi per stimolare la segnalazione di Notch specificamente nei precursori di osteoclasti di topo in coltura, sebbene questi metodi dovrebbero essere applicabili a qualsiasi tipo di cellula aderente con piccoli aggiustamenti. Il primo metodo produce una stimolazione continua della segnalazione di Notch e prevede l'immobilizzazione del ligando di Notch su una superficie di coltura tissutale prima della semina delle cellule. Il secondo, che utilizza il ligando Notch legato a perle di agarosio, consente la stimolazione temporanea della segnalazione Notch nelle cellule che sono già aderenti a una superficie di coltura. Questo protocollo include anche metodi per rilevare l'attivazione di Notch nei precursori degli osteoclasti, nonché marcatori trascrizionali rappresentativi dell'attivazione della segnalazione di Notch.

Introduzione

Il percorso di segnalazione Notch dei mammiferi è omologa alla stessa via in Drosophila melanogaster e si compone di quattro recettori transmembrana Notch (Notch1-4) e cinque ligandi di membrana della Jagged (JAG1 & JAG2) e Delta-like (DLL1, 3, e 4) le famiglie ^1. Notch viene avviata quando il recettore Notch su una cellula ricevente è vincolato da ligando su una cella di trasmissione ^2. Nel corso di questo trans-attivazione, il Notch ligando legato alla membrana produce una forza che si estende sul Notch recettore di membrana ^{3, 4.} La forza di stiramen....

Protocollo

Tutte le ricerche sugli animali vertebrati è stata eseguita in conformità con i protocolli approvati dalla University of Pennsylvania Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC).

1. Culture Media Preparazione

1. Preparare α-MEM sciogliendo medium (MEM) in polvere essenziale minimo e 1,9 g di bicarbonato di sodio in 900 ml di H ₂ O e integrare con 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 100 ml calore siero fetale bovino inattivato. Sterilizzare usando un filtro di 0,22 micron polietersulfone (PES).
2. Preparare medio macrofagi, completandolo α-MEM con 35 ng ....

Risultati

Lo scopo di questo metodo è quello della cultura e stimolare segnale di Notch in precursori degli osteoclasti. Se correttamente colto, precursori degli osteoclasti presentano una morfologia a forma di fuso principalmente allungata con citoplasma liscia (Figura 1A). Si deve prestare attenzione per evitare l'attivazione immunologica dei precursori degli osteoclasti. Dopo l'attivazione, precursori diffondono e diventano appiattito con schiuma citoplasma (Fig.......

Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo

Cultura e nella differenziazione in vitro dei precursori degli osteoclasti fornisce una piattaforma utile per l'indagine dei meccanismi molecolari di osteoclastogenesi e l'identificazione di bersagli terapeutici per la rigenerazione ossea e la conservazione della massa ossea. Quando la coltura precursori degli osteoclasti del mouse, l'elemento più critico è la manutenzione dei precursori in uno stato ingenuo. Come mac.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mouse ricombinante M-CSF	Biolegend	576402	Disponibile presso diversi fornitori, attività di test prima degli esperimenti
Topo ricombinante RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Disponibile presso diversi fornitori, attività di test prima degli esperimenti
Jagged1-Fc R	& D Systems	1277-JG-050	Disponibile da più fornitori, attività di test prima degli esperimenti
Perle di agarosio di proteina G	InvivoGen	gel-agg-2
IgG anti-umane di capra Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Polvere media essenziale minima	Sigma-Aldrich	M0894
Reagente di dissociazione cellulare accutasi	ThermoFisher	A1110501	Utilizzato per sollevare i precursori degli osteoclasti
Fosfatasi acida, Kit leucocitario (TRAP)	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Utilizzato per colorare gli osteoclasti differenziati