Articolo metodologico

Utilizzando modelli di Zebrafish di umana virus infezioni allo schermo farmaci antivirali e caratterizzare host immune cellulo Risposte

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DOI:

10.3791/55235

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20 gennaio 2017

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1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, 3School of Biology and Ecology, University of Maine, 4Division of Intramural Research, Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 5Department of Chemical and Biological Engineering, University of Maine

In questo articolo

Sommario

Vengono dimostrati modelli di infezione sistemica e localizzata da zebrafish per il virus dell'influenza umana A. Utilizzando un modello di infezione sistemica, il pesce zebra può essere utilizzato per lo screening di farmaci antivirali. Utilizzando un modello di infezione localizzata, il pesce zebra può essere utilizzato per caratterizzare le risposte delle cellule immunitarie dell'ospite.

Abstract

Ogni anno, le epidemie di influenza stagionale influenzano profondamente le società di tutto il mondo. Nonostante gli sforzi globali, l'influenza rimane un onere sanitario intrattabile. La strategia principale per ridurre le infezioni è la vaccinazione annuale. Nei soggetti che hanno contratto l'influenza, i farmaci antivirali possono mitigare i sintomi. C'è una chiara e insoddisfatta necessità di sviluppare strategie alternative per combattere l'influenza. Diversi modelli animali sono stati creati per modellare le interazioni ospite-influenza. Qui vengono descritti i protocolli per la generazione di modelli di zebrafish per l'infezione sistemica e localizzata da virus dell'influenza umana A (IAV). Utilizzando un modello di infezione sistemica da IAV, è possibile eseguire lo screening di piccole molecole con potenziale attività antivirale. Come prova di principio, viene descritto un protocollo che dimostra l'efficacia del farmaco antivirale Zanamivir nel pesce zebra infetto da IAV. Mostra come i fenotipi della malattia possano essere quantificati per valutare l'efficacia relativa di potenziali antivirali nel pesce zebra infetto da IAV. Negli ultimi anni, c'è stato un crescente apprezzamento per il ruolo critico che i neutrofili svolgono nella risposta dell'ospite umano all'infezione influenzale. Il pesce zebra ha dimostrato di essere un modello indispensabile per lo studio della biologia dei neutrofili, con impatti diretti sulla medicina umana. Viene descritto un protocollo per generare un'infezione localizzata da IAV nella linea di pesce zebra Tg(mpx:mCherry) per studiare la biologia dei neutrofili nel contesto di un'infezione virale localizzata. Il reclutamento di neutrofili in siti di infezione localizzati fornisce un ulteriore fenotipo quantificabile per valutare manipolazioni sperimentali che possono avere applicazioni terapeutiche. Entrambi i protocolli di zebrafish descritti ricapitolano fedelmente gli aspetti dell'infezione umana da IAV. Il modello di zebrafish possiede numerosi vantaggi intrinseci, tra cui l'elevata fecondità, la chiarezza ottica, l'adattabilità allo screening farmacologico e la disponibilità di linee transgeniche, comprese quelle in cui le cellule immunitarie come i neutrofili sono marcate con proteine fluorescenti. I protocolli qui descritti sfruttano questi vantaggi e hanno il potenziale per rivelare intuizioni critiche sulle interazioni ospite-IAV che potrebbero alla fine tradursi nella clinica.

Introduzione

Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), i virus influenzali infettano il 5-10% degli adulti e il 20-30% dei bambini ogni anno e causano 3-5 milioni di casi di malattie gravi e fino a 500.000 morti in tutto il mondo 1. vaccinazioni annuali contro l'influenza rimangono l'opzione migliore per prevenire la malattia. Gli sforzi come il piano d'azione globale che hanno aumentato l'uso vaccino stagionale, la capacità di produzione di vaccini, e la ricerca e lo sviluppo in più potenti strategie vaccinali al fine di ridurre la morbilità e la mortalità associate con focolai di influenza stagionale 2. I farmaci antivirali come gli inibitori della neuraminidasi (ad esempio Zanamivir e Oseltamivir) sono disponibili in alcuni paesi e si sono dimostrati efficaci nei sintomi attenuanti, quando somministrato entro le prime 48 ore di insorgenza 3, 4, 5. Nonostante gli sforzi a livello mondiale, il contenimento dell'influenza stagionale outbreaks rimane una sfida formidabile in questo momento, come virus dell'influenza deriva antigenica spesso supera capacità attuali di adattarsi al cambiamento genoma del virus 6. strategie vaccinali di targeting di nuovi ceppi di virus devono essere sviluppate in anticipo e sono a volte resi meno di ottimale efficace a causa di cambiamenti imprevisti nei tipi di ceppi che alla fine predominano in una stagione influenzale. Per queste ragioni, vi è una chiara necessità di sviluppare strategie terapeutiche alternative per contenere le infezioni e riducendo la mortalità. Con il raggiungimento di una migliore comprensione delle interazioni ospite-virus, potrebbe essere possibile sviluppare nuovi farmaci anti-influenzali e terapie adiuvanti 7, 8.

L'host-influenza umana A interazione virus (IAV) è complessa. Diversi modelli animali di infezione umana IAV sono stati sviluppati in modo da ottenere una visione in l'interazione ospite-virus, inclusa,ing topi, cavie, ratti, criceti cotone, furetti e macachi 9. Oltre a fornire dati importanti che hanno migliorato la comprensione delle dinamiche di accoglienza-IAV, ogni organismo modello possiede svantaggi significativi che devono essere considerati quando si tenta di tradurre le scoperte in medicina umana. Ad esempio, i topi, che sono il modello più diffuso, non facilmente sviluppano sintomi di infezione IAV-indotte quando infettati con il virus dell'influenza umana isolati 9. Questo perché i topi non hanno il trofismo naturale per l'influenza umana isolati da cellule epiteliali del mouse esprimono alfa-2,3 legami acido sialico invece delle α-2,6 collegamenti acido sialico espressi sulle cellule epiteliali umane 10. Le proteine emoagglutinina presenti in IAV ceppi umani favorevolmente legano ed entrano cellule ospiti cuscinetto legami alfa-2,6 acido sialico attraverso endocitosi mediata dai recettori 9, 11, 12, 13. Di conseguenza, è ormai accettato che nello sviluppo di modelli murini per l'influenza umana, la cura deve essere presa per abbinare la tensione appropriata del mouse con il ceppo di influenza appropriata al fine di ottenere fenotipi di malattia che ricapitolano aspetti della malattia umana. In contrasto, cellule epiteliali del tratto respiratorio superiore furetti possiedono alfa-2,6 legami di acido sialico che assomigliano cellule umane 14. Furetti infetti condividono molte delle caratteristiche patologiche e cliniche osservate nella malattia umana, compresa la patogenicità e trasmissibilità del virus 14 di influenza umana e aviaria, 15. Essi sono anche altamente suscettibili di prove di efficacia del vaccino. Tuttavia, il modello furetto per l'influenza umana ha diversi svantaggi principalmente legati alla loro dimensione e il costo di allevamento che fanno acquisizione di statisticamente signifidati sopraelevazione impegnativi. Inoltre, furetti hanno già mostrato differenze nella farmacocinetica di droga, la biodisponibilità e tossicità che rendono l'efficacia di prova difficile. Ad esempio, i furetti presentano tossicità per il canale ionico M2 amantadina inibitore 16. Pertanto, è chiaro che nella scelta di un modello animale per studiare domande circa infezioni IAV umani, è importante considerare vantaggi e limiti intrinseci, e l'aspetto della interazione ospite-virus che è indagato.

Il zebrafish, Danio rerio, è un modello animale che fornisce opportunità uniche per studiare l'infezione microbica, ospiterà la risposta immunitaria, e potenziali terapie farmacologiche 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. La presenza di acidi sialici α-2,6-legate sulla superficie delle cellule nel zebrafish suggerito la sua suscettibilità al IAV, che è stata confermata in studi infezione e ripreso in vivo utilizzando un ceppo reporter fluorescente di IAV 19. In zebrafish IAV-infetti, un aumento dell'espressione dei antivirali ifnphi1 e MXA trascrizioni indicato che una risposta immunitaria innata era stato stimolato, e la patologia visualizzato da zebrafish IAV-infettati, incluso edema e la distruzione dei tessuti, era simile a quella osservata nelle infezioni influenzali umani . Inoltre, la IAV inibitore della neuraminidasi antivirali Zanamivir mortalità limitata e ridotta la replicazione virale in zebrafish 19.

In questo rapporto, un protocollo per l'avvio del sistemainfezioni ic IAV in embrioni di zebrafish è descritto. Utilizzando Zanamivir a dosi clinicamente rilevanti come una prova di principio, è dimostrata l'utilità di questo zebrafish modello di infezione IAV per i composti di screening per l'attività antivirale. Inoltre, un protocollo per la generazione di un localizzata, epiteliale infezione IAV nel zebrafish nuotare vescica, un organo che è considerato anatomicamente e funzionalmente analogo al polmone mammiferi 21, 29, 30, 31, è descritto. Usando questo modello di infezione IAV localizzata, il reclutamento dei neutrofili al sito di infezione possono essere monitorati, consentendo indagini il ruolo della biologia dei neutrofili nelle infezioni IAV e l'infiammazione. Questi modelli zebrafish integrano modelli animali esistenti di infezioni IAV umane e sono particolarmente utili per testare piccole molecole e le risposte delle cellule immunitarie a causa della possibilità di una maggiore spotere Istituti statistici, capacità di moderata a test high-throughput, e le capacità per monitorare il comportamento delle cellule immunitarie e la funzione di luce-microscopia.

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Protocollo

Tutti i lavori devono essere eseguiti utilizzando il livello di biosicurezza 2 (o BSL2) standard descritti dai Centri statunitensi per il controllo delle malattie (CDC) e in conformità con le direttive stabilite dalla Institutional Animal Care e sull'uso di comitati (IACUC). Si prega di conferire con i funzionari competenti per garantire la sicurezza e la conformità.

1. Zebrafish Cura e manutenzione

  1. Spawn zebrafish e raccogliere il numero necessario di embrioni per gli esperimenti. Quando necessario, vasche di allevamento di massa, come quelli descritti dal Adatto et al. 32, possono essere impiegati per raccogliere un gran numero di embrioni evolutivamente-messa in scena.
  2. Lasciare embrioni a svilupparsi fino stadio desiderato di sviluppo (48 ore post-fertilizzazione per un'infezione sistemica IAV [sezione 3] o 5 giorni dopo la fecondazione per una, nuotare infezione della vescica localizzata [sezione 4]) in piatti profondi Petri a bassa densità (< 100 embrioni / piatto) a 28 ° C in acqua uovo sterile contenente 60 mg / ml sale marino (es Instant Ocean) in acqua distillata.
    1. Rimuovere embrioni morti con pipette di trasferimento in plastica e cambiare uovo acqua al giorno per garantire la salute e lo sviluppo ottimale.

2. Preparazione dei Materiali e reagenti

  1. Preparare un 4 mg / ml soluzione stock di Tricaine-S (aggiustare il pH a 7,0-7,4) in acqua distillata e autoclave. Conservare a 4 ° C.
  2. Tirare capillari di vetro borosilicato con filamenti con un estrattore micropipetta (ad es Micropipetta Estrattore con le seguenti impostazioni: impostazione della pressione = 100, il calore = 550, tirare = [nessun valore], velocità = 130, tempo = 110).
    NOTA: Prima di rifilatura l'ago, la lunghezza da dove l'ago comincia a cono alla punta dell'ago sarebbe di circa 12-15 mm. Questo può variare, tuttavia, in base alle preferenze e applicazione. A lungo, conicità più graduale può essere preferibile a causa della maggiore capacità di perforare l'embrione e la ri ridottask della piegatura dell'ago o rottura.
  3. Sciogliere 2 g di agarosio in acqua uovo 100 ml usando un forno a microonde. Fai piastre su cui allineare ed iniettare gli embrioni versando fuso agarosio in piatti profondi Petri e permettendogli di solidificare.
  4. Fare un 10 mg / ml magazzino del Zanamivir in acqua priva di nucleasi. Aliquotare e congelare a -20 ° C.
  5. Sciogliere 0,5 g di agarosio in acqua uovo 50 ml utilizzando un forno a microonde per rendere il montaggio degli embrioni di agarosio. Mantenere a bagnomaria a 50 ° C fino al momento dell'uso durante l'imaging.

3. sistemica IAV infezione (48 ore post-fecondazione)

ATTENZIONE: Tutto il personale di ricerca devono consultarsi con i loro supervisori e medici per quanto riguarda la vaccinazione prima di iniziare il lavoro con IAV.

  1. dechorionate manualmente embrioni il giorno dell'esperimento utilizzando # 5 pinze. Fare attenzione a rimuovere e euthanize embrioni che sono stati feriti nel processo a 200 mg / ml di soluzione Tricaine.
  2. preparazione of IAV per microiniezione
    NOTA: I ceppi che hanno dimostrato di infettare embrioni di zebrafish sono l'influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), l'influenza A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), e il reporter fluorescente ceppo di influenza NS1-GFP 33. Dettagli sulla APR8 e X-31, e altri ceppi, si possono trovare presso il database Influenza Research
    1. Propagare il ceppo NS1-GFP di IAV in uova di gallina embrionate come descritto in precedenza 34, 35. Raccogliere, un'aliquota, e titolare del liquido allantoico contenente IAV, e conservare a -80 ° C. Pre-titolati APR8 e X-31 virus possono essere acquistati in commercio.
      1. Poco prima infezione, rapidamente scongelare un'aliquota IAV nelle mani guantate e poi rapidamente mettere in ghiaccio per ridurre la perdita di titolo.
    2. diluizione virale
      1. Se si utilizza il APR8 o X-31 virus, diluire a 3,3 x 10 6 uova dose infettiva 50% (DIU50) / ml in sterili, ghiacciata PBS supplemENTED con 0,25% di rosso fenolo (per aiutare nella visualizzazione) in una cappa a flusso laminare. Allo stesso tempo impostare un controllo contenente PBS sterile con il 0,25% rosso fenolo.
      2. Se si utilizza NS1-GFP ceppo 33, diluire a ~ 1,5 x 10 2 formando la placca unità (PFU) per NL in sterile, ghiacciata PBS contenente 0,25% rosso fenolo (per aiutare nella visualizzazione) in una cappa a flusso laminare. Allo stesso tempo impostare un controllo contenente liquido allantoico da uova di gallina infette diluiti come il virus in PBS sterile con lo 0,25% rosso fenolo.
      3. Mantenere IAV sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
    3. soluzione virus pipetta in aghi microiniezione utilizzando punte microloader appena prima dell'uso. Inserire l'ago microiniezione nel supporto adeguato dell'apparato di iniezione (ad es MPPI-3 sistema di iniezione a pressione).
    4. Durante la visualizzazione al microscopio stereo, clip delicatamente la punta dell'ago microiniezione con taglienti, sterilizzato # 5 pinze.
      NOTA: E 'raccoded che la punta microiniezione essere ritagliato a poco a poco.
    5. Premere il pedale del sistema di iniezione pressione e iniettare in una goccia di olio microscopio immersione in un vetrino micrometrico di calibrazione. Misurare il diametro della goccia. Calcolare il volume della goccia usando l'equazione V = 4 / 3πr 3, dove V è il volume in nl ed r è il raggio in micron.
      NOTA: Se il diametro calo è troppo piccolo, vetro supplementare può essere tagliato o impostazioni di pressione e di sincronizzazione può essere regolata. Se il diametro di goccia è troppo grande, impostazioni di pressione e di temporizzazione possono essere regolati.
    6. Regolare impostazioni di pressione e di temporizzazione sull'iniettore pressione e / o Reclip la punta dell'ago fino a quando il volume di iniezione desiderato si ottiene (tipicamente 1-3 nl). impostazioni di pressione tra 20 e 30 impostazioni psi e durata degli impulsi tra 40 e 80 msec sono tipici. Regolare la contropressione in modo che contrasta pressione capillare, ma non perde IAV (pressione di rete pari a zero).
  3. Allineare embrioni per iniezione
    1. Anestetizzare gli embrioni dechorionated a 200 mg / ml Tricaine.
    2. Una volta che il movimento cessa, trasferire 10-20 embrioni ad una piastra di agarosio al 2% (preparata nella sezione 2.3) con una pipetta di plastica. Utilizzare pipetta di plastica per rimuovere il liquido in eccesso.
    3. Allineare delicatamente embrioni per la microiniezione con un capillare fuoco lucido e vetro borosilicato sigillato. Utilizzando un microscopio stereo, embrioni delicatamente orientare in modo che il condotto di Cuvier o la vena posteriore cardinale è in linea con l'ago microiniezione (Figura 1A).
  4. IAV microiniezione
    1. inserire delicatamente l'ago microiniezione nel condotto di Cuvier o la vena posteriore cardinale. Premere pedale per iniettare il volume desiderato di IAV nel sistema circolatorio dell'embrione (Figura 1A). Gli embrioni possono essere iniettati più di una volta, se necessario.
      NOTA: Il bolo iniezione deve essere travolti nella circolazione e distribbuite in tutto il corpo. Se il volume di iniezione raccoglie al sito di iniezione, rimuovere embrione da esperimento e Eutanasia.
    2. Ripetere iniezioni su diversi embrioni con la soluzione di controllo specifica per il ceppo di virus scelti. Per APR8 e X-31, utilizzare il controllo di cui al punto 3.2.2.1; per la NS1-GFP, utilizzare il controllo di cui al punto 3.2.2.2.
  5. Trasferimento degli embrioni a piastre di Petri etichettati contenenti acqua uovo sterile e posto in incubatori a 33 ° C.
    NOTA: Infected embrioni devono essere coltivate a 33 ° C per sostenere la replicazione virale maggiore. Inoltre, l'incubazione a 33 ° C imita più da vicino la temperatura del tratto respiratorio superiore umana, che è in stretto contatto con temperature più basse in ambiente esterno ed è dove si verificano infezioni IAV. Gli embrioni possono ambientarsi ad un ampio intervallo di temperature 34.

4. localizzato, vescica natatoria IAV infezione a Tg (mpx: mCherry) transgenici Zebrafish (5 giorni dopo la fecondazione)

  1. Preparazione di IAV per microiniezione
    1. Diluire la tensione e la soluzione di controllo dell'iniezione NS1-GFP come descritto nella sezione 3.2.
    2. Preparare aghi come descritto nella sezione 2.2.
    3. Allineare Tg (mpx: mCherry) 35 larve contenente vesciche natatorie gonfiati come descritto nel paragrafo 3.3 con la seguente eccezione. Allineate larve in modo tale che l'ago può forare la vescica natatoria e il virus può essere depositato nel posteriore della vescica natatoria, come precedentemente descritto 36 (Figura 2A).
  2. IAV microiniezione
    1. Inserire delicatamente l'ago microiniezione nella vescica natatoria e iniettare il volume desiderato (ad esempio 5 nl) verso la parte posteriore della struttura (Figura 2A).
      NOTA: Il bolo iniezione deve raccogliere verso il posteriore e bolla d'aria della vescica natatoria dovrebbe be spostato in avanti. espressione GFP dovrebbe iniziare ad essere osservato dopo l'iniezione 3 ore.
    2. Ripetere l'iniezione con soluzione di controllo specifica per il ceppo di virus scelti, come descritto nella sezione 3.4.2.
  3. Trasferimento larve di piastre di Petri contenenti acqua uovo sterile e posto in incubatori a 33 ° C.

5. Il trattamento farmaco antivirale

NOTA: Il protocollo di seguito descrive il trattamento Zanamivir precedentemente mostrato in Gabor et al. 19. Questo protocollo può essere modificato per lo screening altri farmaci antivirali e ha il potenziale per essere modificato per lo screening più composti in un piatto ben 96, formato ad alta produttività.

  1. A 3 ore dopo l'infezione, sostituire l'acqua uovo di NS1-GFP e pesce di controllo-infettati con acqua uovo sterile contenente 0, 16,7 o 33,3 ng / ml Zanamivir.
    NOTA: Queste concentrazioni sono state scelte in modo da tentare di replicare i livelli fisiologici raggiunti FOamministrazione llowing di Zanamivir nei pazienti umani (100, 200, o 600 mg, IV, due volte al giorno o 10 mg per via inalatoria, due volte al giorno). Le concentrazioni sieriche nei pazienti umani variava 9,83-45,3 ng / ml 36.
  2. Nel corso di 5 giorni, cambiare l'acqua uovo ogni 12 ore e sostituire con acqua uovo sterile contenente la giusta quantità di Zanamivir.
  3. Traccia corso di infezione.
    1. Anestetizzare zebrafish a 200 mg / ml Tricaine. Monitorare l'espressione GFP al microscopio a fluorescenza stereo per osservare visivamente differenze nei modelli di infezione tra i pesci IAV-infetti e di controllo e tra i pesci immersi nelle diverse concentrazioni di farmaci.
    2. Traccia morbilità e mortalità nel corso di 5 giorni.
      1. Registra osservazioni circa le dinamiche di infezione legati alla patologia della malattia, compresi i segni di letargia e prove di edema, differenze di pigmentazione, oculare e deformità cranio-facciali, e lordosi. patologia delle malattietipicamente diventa evidente nel controllo pesci infetti in post-iniezione 24-48, a seconda della quantità di virus iniettato. Raccogliere le immagini post-iniezione 24 ore.
      2. Ogni 24 ore per 5 giorni dopo l'infezione, registrare il numero di larve morte, morbosa, e sano. La morte è definito dall'assenza di un battito cardiaco discernibile. Tracciare i dati, se lo desideri. Ad esempio, i dati di scena come un grafico a barre in pila, con percentuali di pesci sani, morbosa, o morto tracciati sul l'asse y e il gruppo di trattamento sul l'asse x. 19
        NOTA: Le mortalità possono essere segnati da stime di sopravvivenza di Kaplan-Meier. A seconda dell'applicazione, può essere opportuno sviluppare approcci alternativi per la morbilità pesce di punteggio, tra cui una matrice di punteggio che può quantificare i livelli di morbilità in base alle suddette caratteristiche patologiche osservate.
      3. Consultare uno statistico di applicare le analisi statistiche appropriate.

6. la migrazione dei neutrofili

NOTA: Il protocollo di seguito descrive un metodo per il monitoraggio della migrazione dei neutrofili alla vescica natatoria a seguito di una localizzata, epiteliale infezione IAV. I metodi descritti possono essere modificati per verificare gli effetti di manipolazioni genetiche e chimiche. Usando questa tecnica, sarà possibile caratterizzare i meccanismi sottostanti comportamento neutrofili durante un'infezione IAV.

  1. Montaggio Zebrafish per l'imaging
    1. Anestetizzare le larve di essere ripreso in 200 mg / ml Tricaine.
    2. Trasferire un individuo Tg (mpx: mCherry) larva che è stato infettato con NS1-GFP ad un pozzo di un 24 ben, piatto fondo di vetro in una piccola goccia d'acqua uovo (~ 50-100 ml). Ripetere con altri pesci IAV-infetto e di controllo.
    3. Lentamente aggiungere 1% mezzi di montaggio degli embrioni agarosio a ciascuna (sezione 2.5) e, facendo attenzione a non introdurre bolle di grandi dimensioni.
      1. Regolare delicatamente la posizione della larva modo che è montato su un lato.Goody e Henry 37 descrivono come fare le sonde che funzionano bene in questa applicazione utilizzando perni di insetti che sono montati nei capillari di vetro borosilicato con filamenti e superglued a posto.
    4. Una volta che l'agarosio si indurisce, riempire delicatamente i singoli pozzi con acqua uovo contenente 200 mg / ml Tricaine.
    5. Con un microscopio confocale, cattura az serie pila di immagini campo chiaro e fluorescenza utilizzando un obiettivo 20X incentrata sulla vescica natatoria.
      1. Impostare i limiti superiore ed inferiore in modo che catturano tutti visibilmente osservabile fluorescenza verde e rosso.
      2. catturare immagini a 2.0 msec / pixel con passaggi che sono ≤ 4 micron. Aumentare il tempo per pixel e di ridurre la distanza tra i passaggi (ad esempio 0,5-1,0 micron) aumenta la risoluzione dell'immagine e la qualità.
      3. Generare una immagine bidimensionale unendo strati.
      4. Confrontare il numero di neutrofili MPX-mCherry-positive presenti in le vesciche natatorie di IAV-infetti e di controllo a iniezione zebrafish.

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Risultati

Qui, vengono forniti dati che dimostrano come infezioni sistemiche IAV in zebrafish può essere utilizzato per testare l'efficacia dei farmaci (Figura 1A). Embrioni a 48 ore post-fertilizzazione sono iniettati con APR8 (figure 1C, 1F), X-31 (figure 1D, 1G), o NS1-GFP (Figure 1H-1I) attraverso il condotto di Cuvier di avviare una infezione virale. Un altro coorte di embrioni a 48 ore post-fertilizzazione sono stati ini...

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Discussione

Per massimizzare i benefici ottenuti dall'utilizzo di un piccolo animale di modellare interazioni ospite-patogeno umano, è importante per inquadrare domande di ricerca e ipotesi di test che capitalizzare i vantaggi intrinseci del sistema modello. Come modello per l'infezione IAV umana, il pesce zebra ha diversi punti di forza, tra cui ad alta fecondità, chiarezza ottica, subordinazione al vaglio di farmaci, e la disponibilità di linee transgeniche che etichetta le cellule immunitarie come neutrofili. Il zebrafis...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Mark Nilan per la cura e il mantenimento del pesce zebra e Meghan Breitbach e Deborah Bouchard per la propagazione di NS1-GFP e la determinazione dei titoli IAV. Questa ricerca è stata supportata dalla sovvenzione NIGMS, NIH P20GM103534 e dalla Maine Agricultural and Forest Experiment Station (numero di pubblicazione 3493).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Instant OceanSpectrum BrandsSS15-10
Piastre di Petri monouso sterili da 100 mm x 25 mm VWR89107-632
Pipette di trasferimento Fisherbrand13-711-7M
Tricaine-S (MS-222)Capillare in
con filamento Strumento Sutter BF120-69-10
Estrattore per micropipette fiammante/marrone Sutter InstrumentP-97
AgarosioLonza50004
ZanamivirAK ScientificG939
Dumont #5 pincipeMicroscopia elettronica Scienze72700-D
Punte per microloaderEppendorf930001007
Olio da immersione per microscopioOlympusIMMOIL-F30CC
Vetrino di calibrazione del tavolino per microscopio AmScopeMR095
MPPI-3 iniettore di pressione Strumentazione scientifica applicata Stereomicroscopio
OlympusSZ61
Unità di contropressioneStrumentazione scientifica applicata Kit
Strumentazione scientifica applicataInterruttore
Strumentazione scientifica applicataFSW
Strumentazione Scientifica ApplicataMM33
Base MagneticaStrumentazione Scientifica ApplicataBase Magnetica
Rosso Fenolo Sigma-Aldrich P-4758
Incubatrice a bassa temperaturaVWR2020
SteREO Discovery.V12Zeiss
IlluminatorZeissHXP 200C
Sorgente di luce freddaZeissCL6000 LED
Piastra multipozzetto con fondo in vetro, 24 pozzettiMattekP24G-0-13-F
Microscopio confocaleOlympusIX-81 con sistema confocale a scansione laser FV-1000
Charles River 490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) Charles River 
Influenza NS1-GFPReferenziato in Manicassamia et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)Citato in Lam et al. 2013
vetro borosilicato chimico occidentale porta micropipette BPU a pedale MPIP Micromanipolatore Software Fluoview Olympus Prism v6 GraphPad Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus 490715

Riferimenti

  1. W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
  2. W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
  3. De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
  4. von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
  5. Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
  6. Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
  7. Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
  8. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
  9. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  10. Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
  11. Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531(2000).
  12. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  13. Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
  14. Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
  15. Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
  16. Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
  17. de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
  18. de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
  19. Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
  20. Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
  21. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  22. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  23. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
  24. Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
  25. Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
  26. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  27. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  28. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
  29. Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
  30. Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
  31. Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182(2014).
  32. Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715(2011).
  33. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  34. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
  35. Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436(2013).
  36. Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
  37. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
  38. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  39. Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
  40. Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  41. Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
  42. Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378(2016).
  43. Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
  44. Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
  45. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  46. Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
  47. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  48. Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
  49. Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
  50. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  51. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
  52. Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57(2008).
  53. Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
  54. Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  55. Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
  56. de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
  57. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).

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