Articolo metodologico

MitoCeption: Trasferimento isolato umana MSC mitocondri di Glioblastoma cellule staminali

DOI:

10.3791/55245

⸱

22 febbraio 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine and Biotherapy (IRMB), INSERM U1183, Montpellier University, 2Institute of Neurosciences of Montpellier (INM), INSERM U1051, Montpellier University

In questo articolo

Sommario

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Qui, un protocollo (MitoCeption) viene presentato per trasferire i mitocondri, isolato dalle cellule staminali mesenchimali umane (MSC), alle cellule staminali di glioblastoma (GSC), con l'obiettivo di studiare i loro effetti biologici sul metabolismo e le funzioni di GSC. Un protocollo simile può essere atto a trasferire mitocondri tra altri tipi di cellule.

Abstract

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I mitocondri hanno un ruolo centrale per il metabolismo cellulare, la produzione di energia e il controllo dell'apoptosi. Inadeguata funzione mitocondriale è stato trovato responsabile di malattie molto diverse, che vanno da patologie neurologiche al cancro. È interessante notare che i mitocondri sono stati recentemente dimostrato per visualizzare la capacità di essere trasferiti tra i tipi di cellule, in particolare da cellule staminali mesenchimali umane (MSC) per le cellule tumorali in condizioni di co-coltura, con metabolici e funzionali conseguenze per le cellule riceventi mitocondri, migliorando ulteriormente l'attuale interesse per le proprietà biologiche di questi organelli.

Valutazione degli effetti della mitocondri MSC trasferito nelle cellule bersaglio è di primaria importanza per comprendere l'esito biologica di tali interazioni cellula-cellula. Il protocollo MitoCeption qui descritto permette il trasferimento dei mitocondri isolati preventivamente dalle cellule donatrici alle cellule bersaglio, utilizzando MSC mitocondrie le cellule staminali di glioblastoma (GSC) come sistema modello. Questo protocollo è stato in precedenza utilizzato per trasferire i mitocondri, isolato da MSC, a aderenti cellule tumorali MDA-MB-231. Questo protocollo di trasferimento dei mitocondri è adattato qui per GSCs che presentano la particolarità specifica di crescere come neurosfere in vitro. Il trasferimento dei mitocondri isolati può essere seguita da cellule di fluorescenza-attivato (FACS) e confocale utilizzando mitocondri coloranti vitali. L'uso di cellule donatrici e di destinazione mitocondri con aplotipi distinte (SNP) consente anche il rilevamento dei mitocondri trasferiti in base alla concentrazione di DNA mitocondriale circolare (mtDNA) nelle cellule bersaglio. Una volta che il protocollo è stato convalidato con questi criteri, le cellule che ospitano mitocondri trasferiti possono essere ulteriormente analizzati per determinare gli effetti dei mitocondri esogeni sulle proprietà biologiche quali il metabolismo cellulare, la plasticità, la proliferazione e la risposta alla terapia.

Introduzione

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I mitocondri sono organelli presenti nelle cellule eucariotiche dove svolgono un ruolo centrale nel assorbimento dei nutrienti, nonché nella produzione di energia e metaboliti. Questi organelli contengono circolare DNA mitocondriale (mtDNA), lunga 16,6 kb, che codifica le proteine dei complessi della catena di trasporto degli elettroni, tRNA e rRNA 1. La funzionalità di questi organelli è fondamentale per l'omeostasi cellulare e diverse patologie sono stati associati con mitocondri disfunzioni 1, 2, 3. Lo stato mitocondri è ad esempio stato collegato a infiammazione, malattie infettive e cancro, in quest'ultimo caso con conseguenze per metastasi e la resistenza alla terapia 4, 5, 6, 7.

I mitocondri mostrano la notevole capacità di ottenendo trasferiti tra "donatore" e le cellule "target". Questo porta a cambiamenti nel metabolismo energetico delle cellule bersaglio così come in altre modifiche funzionali come riparazione dei tessuti e la resistenza agli agenti chemioterapici, come recentemente dimostrato da diversi laboratori 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Le cellule staminali mesenchimali umane (MSC) mostrano questa capacità di trasferire mitocondri per una grande varietà di cellule bersaglio, tra cui cardiomiociti, cellule endoteliali, polmonari alveolari cellule epiteliali, cellule tubulari renali e cellule tumorali, portando a modifiche delle proprietà funzionali di queste cellule 8,> 9, 10, 12, 17, 18.

scambio mitocondri ora appare come un meccanismo ampiamente diffuso che consente un certo numero di diversi tipi di cellule di comunicare tra loro e modificare le loro proprietà biologiche. Questo scambio mitocondri può avvenire attraverso la formazione di tunneling nanotubi (TNT), che coinvolge connessina 43 contenenti gap giunzioni 8 o M-Sec / TNFaip2 e la exocyst complessi 19. In alternativa, il trasferimento mitocondri è stato anche dimostrato di essere mediata da arrestina microvescicole dominio contenente la proteina 1-mediata (ARMMs) 20. È interessante notare che l'efficacia del trasferimento mitocondri era legato al tasso espressione della Rho GTPasi 1 MIRO1 21, un fattore chiave per spiegare le differenze di efficacies trasferimento mitocondri tra iPSC-MSC e adulti BM-MSC 22.

Nonostante questa ricchezza di dati riguardanti lo scambio mitocondri cella-a-cella, relativamente poco si sa circa il metabolismo e l'esito biologica di questo trasferimento mitocondri. Pertanto, si giustifica pienamente la creazione di strumenti adeguati per valutare appieno gli effetti biologici di questo trasferimento. Nel corso degli anni, vari approcci tecnici per trasferire mitocondri dal donatore al cellule accettori sono stati proposti. Ciò comprende iniezione diretta di mitocondri in ovociti 23, 24, 25, fusione cellulare per generare cibridi transmitocondriali 26, 27 e, più recentemente, il trasferimento di mitocondri isolati utilizzando fototermico nanoblades 28.

Noi e gli altri precedentemente dimostrato la capacità di mitochond isolatoria essere internalizzati dalle cellule viventi, come osservato sia in vitro che in vivo 29, 30, 31, attraverso meccanismi proposti di comportare macropinocitosi 32. Abbiamo sviluppato inoltre un metodo, chiamato MitoCeption, trasferire quantitativamente mitocondri isolati (da MSC) per colpire le cellule, come esemplificato con il (aderenti) MDA-MB-231 linea di cellule di cancro al seno 31. Questo protocollo è stato adattato qui per il trasferimento di isolati mitocondri MSC umani per le cellule staminali di glioblastoma (GSC).

Glioblastoma sono tumori maligni aggressivi del cervello che diventano rapidamente resistente al trattamento, soprattutto per le cellule staminali di glioblastoma (GSC) presenti all'interno del tumore 33. Questi GSCs crescere come neurosfere in vitro e generare tumori in modelli di xenotrapianto. Le cellule tumorali all'interno glioblastoma hanno lacapacità di effettuare connessioni cellula-cellula, come recentemente dimostrato per le cellule tumorali del cervello astrocitari che interconnettono con microtubi estesi, attraverso cui i mitocondri (così come nuclei di calcio e cellulari) possono migrare, con conseguente reti astrocitoma radioterapia resistenti 34. Glioblastoma può reclutare molte cellule diverse all'interno del microambiente tumorale, tra cui MSC 35, 36. Abbiamo dimostrato che cellule staminali mesenchimali possono effettuare connessioni cellula-cellula con GSCs in co-coltura e trasferire i loro mitocondri (dati non mostrati), che si prevede di modificare GSC proprietà funzionali. Il presente protocollo descrive come la tecnica MitoCeption può essere utilizzato per trasferire i mitocondri, preventivamente isolato da cellule staminali mesenchimali umane, a GSCs umani con lo scopo di determinare l'esito biologico funzionale. Il multipotenti e altamente oncogeno linea GB4 GSC 37 è stato utilizzato in questo studio.

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Protocollo

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Giorno 1

1. Etichettatura della cellula staminali mesenchimali (MSC) mitocondri (opzionale)

  1. Due giorni prima della preparazione mitocondri, sementi MSC umane in un piatto di coltura 100 mm, in 10 ml αMEM / FBS 10%, in modo da avere 4 x 10 5 cellule staminali mesenchimali in coltura al giorno 1.
  2. Risciacquare con PBS MSC (4 ml) e aggiungere 4 ml αMEM / FBS 1% (preriscaldata a 37 ° C).
  3. Aggiungere la quantità necessaria di mitocondri colorante vitale e incubare le cellule per 30 min in incubatore a 37 °.
  4. Rimuovere la soluzione colorante mitocondri, lavare le cellule due volte con 4 ml preriscaldata (37 ° C) αMEM / FBS 1% e aggiungere di nuovo 4 ml αMEM / FBS 10%. Incubare le cellule a 37 ° C.
  5. Modificare il terreno di coltura (10 ml αMEM / FBS 10%) dopo 30 minuti e, un'altra volta, 2 ore più tardi.

Giorno 1

2. L'etichettatura delle cellule di glioblastoma staminali (GSC) (opzionale, vedere la sezione Discussione)

Terreno di coltura cellulare Composizione
GSC medio basale DMEM / F-12 integrato con
Insulin 20 mg / ml
1x supplemento N2
Glucosio 3 g / L
L-glutamina 2 mM
medio proliferazione GSC Aggiungere al terreno di base:
1x supplemento B27
EGF 10 ng / ml
bFGF 10 ng / ml
Fungino 10 mg / ml
Fungizone 0,25 mg / ml
Eparina 2 mg / ml
Ciprofloxacina 2 ug / ml
Gentamicina 2 ug / ml
medio proliferazione MSC & #945; MEM completato con
L-glutamina 2 mM
10% FBS
bFGF 2 ng / ml

Tabella 1: Culture Media.

  1. Dissociarsi GSCs (linea GB4 cella 32 (10 x 10 6 cellule) cresciuto come neurosfere di poli-HEMA fiasche di coltura cellulare rivestito (vedere i passaggi da 3.1 a 3.12).
  2. GSCs seme in una piastra a 48 pozzetti a 10 5 cellule / pozzetto in media la proliferazione GSC (500 microlitri) (vedi tabella 1).
  3. Centrifugare la piastra a 270 xg per 5 min a 20 ° C.
  4. Aggiungere la quantità di colorante vitale delle cellule e incubare per 30 min a 37 ° C.
  5. Aggiungere 500 ml di GSC medio basale (Tabella 1) per pozzetto della piastra 48 pozzetti.
  6. Centrifugare la piastra a 270 xga 20 ° C per 5 min. Aspirare il surnatante.
  7. Ripetere i passaggi 2,5-2,6.
  8. Aggiungere 500 pl di GSC medio basale e incubare a 37 ° C per 30 min.
  9. Centrifugare la piastra a 270 xga 20 ° C per 5 min. Aspirare il surnatante.
  10. Aggiungere 500 ml di mezzo di proliferazione GSC per pozzetto della piastra 48 pozzetti e incubare nel 37 ° C incubatore.
    Nota: La quantità di GSC indicato (10 x 10 6 cellule) consente di eseguire i diversi esperimenti dose-risposta e controlli FACS. Una volta che le condizioni sperimentali sono più definite con precisione tale importo può essere ridimensionato.

Giorno 2

3. Semina del glioblastoma cellule staminali

  1. Raccogliere le neurosfere GSC (10 x 10 6 cellule) mediante centrifugazione a 270 xg per 5 min a 20 ° C in un tubo da 50 ml.
  2. Lavare le cellule con 5 ml di HBSS e centrifugare a 270 xg per 5 min a 20 ° C.
  3. Aspirare il surnatante.
  4. Risospendere delicatamente il pellet GSC in 100 ml tripsina-EDTA (0,25%) (per 10 x 10 6 celle)
  5. Incubare a 37 ° C per 3 min.
  6. Aggiungere 10 ml CaCl 2 (20 mM) e 2 microlitri DNasi I (10 mg / ml).
  7. Dissociare il neurosfere pipettando gentilmente su e giù (30-50x) con una pipetta P200. Evitare le bolle. Controllare sotto il microscopio che tutti GSC sono dissociate.
  8. Aggiungere 10 ml inibitore di tripsina (5%) e 10 ml HBSS.
  9. Centrifuga GSCs a 270 xg per 7 minuti a 20 ° C.
  10. Eliminare il surnatante e aggiungere 10 ml di GSC medio basale (Tabella 1).
  11. Contare GSCs con una camera di conteggio Thoma e centrifugare le cellule a 270 xg per 7 minuti a 20 ° C.
  12. Aggiungere il volume appropriato di supporto proliferazione GSC (Tabella 1) per raggiungere la concentrazione cellulare di 10 6 GSC / ml.
  13. Seed 10 5 GSCs (100 microlitri della sospensione cellulare) per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
  14. Centrifugare le piastre a 270 xg per 7 minuti a 20 ° C per ottenere GSCs al bottom dei pozzi.
  15. Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C fino a quando la sezione 5.

Giorno 2

Isolamento 4. MSC mitocondri

  1. Regolare la temperatura microprovetta centrifuga a 4 ° C.
  2. Preparare due provette da 1,5 ml "A" e "C" contenente i reagenti per l'estrazione mitocondri (200 pl di reagente A e 400 microlitri di reagente C, contenenti entrambi gli inibitori della proteasi-EDTA). Preparare 2 altri tubi, etichettati "MSC" e "Mito". Mantenere tutte le provette su ghiaccio. Anche preparare tubi per le diluizioni seriali mitocondri.
  3. Lavare MSC con 10 ml preriscaldata (37 ° C) PBS.
  4. Lavare MSC con 2 ml tripsina (senza EDTA) per 10 secondi e aggiungere 1 ml di tripsina (senza EDTA). Incubare le cellule per 5-10 minuti a 37 ° C.
  5. Recuperare le MSC con l'aggiunta di 10 ml αMEM / FBS 10%, il trasferimento di un tubo da 50 ml.
  6. cellule centrifugare a 270 xg per 5 minuti a 20 ° C.
  7. Eliminare il surnatante e aggiungere10 ml αMEM / FBS 10% al pellet.
  8. Contare le cellule staminali mesenchimali con una camera di conteggio Malassez.
  9. Centrifuga MSC (4-5 x 10 5) a 270 xg per 5 min a 20 ° C.
  10. Eliminare il surnatante, aggiungere 1 m αMEM ghiacciata / FBS 10% per il pellet cellulare e trasferire le cellule a tubo "MSC" -labeled (preparato al punto 4.2). Mantenere la provetta in ghiaccio.
  11. Centrifugare la provetta contenente le cellule staminali mesenchimali a 900 xg per 5 minuti, a 4 ° C.
  12. Rimuovere tutti i media residua dal tubo.
  13. Aggiungere 200 ml di mitocondri Isolation Reagent A (contenente gli inibitori della proteasi senza EDTA). Vortex a velocità media per 5 secondi e lasciare i tubi in ghiaccio per esattamente 2 minuti.
  14. Aggiungere 2,5 ml di mitocondri Isolation reagente B. Vortex alla massima velocità per 10 secondi, e poi lasciare i tubi in ghiaccio. Ripetere ogni 30 sec per 5 min.
  15. Aggiungere 200 ml di mitocondri Isolation Reattivo C (contenente gli inibitori della proteasi senza EDTA). Mescolare inclinando il tubo (roughly 30 volte, non vortex). Centrifugare la provetta a 700 xg per 10 min a 4 ° C.
  16. Trasferire il surnatante (contenente i mitocondri MSC) per il tubo "Mito" (preparato al punto 4.2).
  17. Centrifugare a 3000 xg, 15 min a 4 ° C, per ottenere il pellet mitocondri. Eliminare il surnatante. Il pellet contiene i mitocondri isolati.
  18. Lavare il pellet mitocondri con 200 microlitri di Reagente C. Poi, centrifugare a 12.000 xg, 5 min a 4 ° C, per ottenere il pellet mitocondri.

5. Il trasferimento di isolato MSC mitocondri di GSC (MitoCeption)

  1. Aggiungere 200 ml di (0 ° C) medio pre-raffreddato GSC proliferazione al pellet mitocondri isolati da cellule staminali mesenchimali (4 x 10 5).
  2. Diluire la preparazione mitocondri (in media proliferazione GSC) per aggiungere costantemente 20 microlitri di sospensione mitocondriale ai GSC.
  3. Aggiungere il volume dei mitocondri isolati nei pozzetti della 96-wPiastra ell contenente i GSC (dal punto 3.15), alla concentrazione desiderata (da 0,1 a 10 mg). Aggiungere mitocondri lentamente, vicino al fondo del pozzo, che copre tutta la superficie almeno una volta.
  4. Per il controllo di MSC mitocondri perdite colorante vitale, aggiungere la stessa quantità di preparazione mitocondri (da 0,1 a 10 mcg) per pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente GSC medio proliferazione soli (non GSC) (vedi parte 6.2 per il rilevamento di perdite colorante vitale).
  5. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti contenenti le GSCs destinatario mitocondri con mitocondri MSC (passo 5.3) e la piastra di controllo (passo 5.4) a 1.500 xg per 15 min a 4 ° C.
  6. Posizionare le piastre di coltura nell'incubatrice cella C 37 ° subito dopo la centrifugazione.
    Nota: Il protocollo di trasferimento mitocondri si basa sulla centrifugazione della sospensione mitocondri delle cellule coltivate al un'adeguata forza centrifugazione, con una serie di centrifugazioni che può essere regolato a seconda del system di cellule del donatore / ricevente mitocondri.

3 ° giorno

6. Analisi della mitocondri da FACS e confocale Imaging

  1. Preparazione dei campioni per l'analisi FACS GSC
    Nota: Se mitocondri MSC sono state marcate con un colorante vitale anticipo (sezione 1), l'efficienza può essere monitorata mediante FACS, 24 ore dopo il trasferimento mitocondri.
    1. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti con le GSCs MitoCepted a 270 xg per 5 min a 20 ° C.
    2. Eliminare il surnatante.
    3. Aggiungere 100 microlitri tripsina (senza EDTA) in ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C per 3 min. Pipettare su e giù per dissociare le neurosfere formatisi nel periodo di tempo di 24 ore.
    4. Aggiungere 100 ml di GSC terreno di base.
    5. Centrifugare la piastra a 270 xg per 5 min a 20 ° C e scartare il surnatante.
    6. Risospendere GSCs in 300 ml GSC terreno di base e trasferimento al FACS adattato tubi.
    7. Eseguire l'un FACSANALISI.
  2. Controllo per perdite mitocondri colorante vitale dai mitocondri isolati (FACS)
    Nota: Lo scopo di questa fase è quello di determinare il segnale FACS sfondo che non riflettere un trasferimento genuino MSC mitocondri, ma, piuttosto, la semplice perdita di colorante vitale dai mitocondri MSC marcato usato per MitoCeption (passo 5.3).
    1. Seed cellule GSC come descritto nei punti 3.1 a 3.15.
    2. Incubare le cellule a 37 ° C per 1 ora.
    3. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti contenente mitocondri solo (dal punto 5,4-5,6) a 1.500 xg per 5 minuti a 20 ° C.
    4. Aspirare il terreno di coltura dal GSC piastra a 96 pozzetti (fase 6.2.2) e sostituirlo con il medium incubato con mitocondri solo (surnatante dal punto 6.2.3).
    5. Incubare la piastra a 96 pozzetti contenenti le GSCs a 37 ° C per 2 ore.
    6. Procedere come nei passaggi 6.1.1 a 6.1.7 per l'analisi FACS.
  3. Preparazione di GSC SAMPles per l'imaging confocale
    Nota: Se il trasferimento di MSC mitocondri per GSCs deve essere analizzato per imaging di fluorescenza, sia MSC e GSCs devono essere etichettati in anticipo, rispettivamente, con i mitocondri (fase 1) e cellule (fase 2) coloranti vitali.
    1. Preparare GSCs come nei passaggi 6.1.1 a 6.1.5.
    2. Risospendere GSCs in 2 ml di mezzo proliferazione GSC contenente il 2% FBS e le sementi in capsule di Petri 35 mm (fondo di vetro).
    3. Eseguire confocale sulle GSCs con i mitocondri MSC fluorescenti trasferiti 24 ore successive.

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Risultati

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Le fasi procedurali che delinea l'isolamento dei mitocondri da cellule staminali mesenchimali (MSC) e il loro trasferimento alle cellule staminali di glioblastoma mirati (GSC) da MitoCeption sono mostrati in Figura 1. GSCs sono le cellule staminali tumorali coltivate come neurosfere di preservare la loro proprietà delle cellule staminali. Per il protocollo, GSCs vengono seminati come singole cellule di un paio d'ore prima del trasferimento dei mitocondri (punto 3) per co...

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Discussione

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Un numero crescente di studi dimostrano che le cellule possono scambiare i mitocondri e che questi mitocondri avere effetti profondi sul metabolismo delle cellule bersaglio e funzioni. Pertanto, è indispensabile la conoscenza dei mezzi per trasferire quantitativamente mitocondri delle cellule del donatore a queste cellule bersaglio per consentire uno studio accurato dei loro effetti biologici.

Il protocollo qui descritto è stato originariamente elaborato per trasferire i mitocondri isolati d...

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Dichiarazioni

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INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), con la quale CJ e ML.V. sono affiliati, ha depositato una domanda di brevetto sulla tecnica MitoCeption (EP14306154.7).

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Andrea Parmeggiani (L2C e DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), così come i membri del laboratorio per le discussioni utili, Christophe Duperray per un aiuto con l'analisi FACS, l'impianto di imaging RIO Montpellier (MRI) per la fornitura del ambiente adeguato per FACS e microscopia confocale. BNM è stato sostenuto da una borsa di studio di laurea dal LABEX Numev (convenzione ANR-10-LabX-20). AB è stato sostenuto da una borsa di studio di laurea presso l'Università di Varsavia e dell'Unione Europea (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV è uno scienziato del personale del Centro nazionale per la ricerca scientifica (CNRS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit di isolamento dei mitocondri per i tessuti Fisher Scientific 
Integratore N-2 (100x)Fisher Scientific11520536
B-27 Integratore W/O VIT A (50x)Fisher Scientific 
HBSS senza Ca2+ senza Mg2+  SigmaH4385
poli eme Sigma P3932
aMEM senza glutamminaOzymeBE12-169F
DMEM / F-12 senza glutamminaFisher Scientific
L-glutamminaInvitrogen Codice 25030-024 
Glucosio Sigma G7021
InsulinaSigma I 1882 
Umano  bFGF R& D Systems233-FB-025
EGF umano Peprotech AF-100-15 
EparinaSigmaH3149 
CaCl2MERCK2382
Inibitore della tripsinaSigma T9003
DNase ISIGMA 
tripsina 0,25% / EDTA 1  mMInvitrogen 
TripsinaGibco 15090-046
Inibitori della proteasi Senza EDTASigma4693159001
Ciprofloxacine Sigma17850-5G-F
Fungine Invivogenant-fn-1
Fungizone Thermofisher15290018
GentamicinaEuromedexEU0410
MitoTracker SondemolecolariM7514
Sonde molecolariCMXRos rosse  M7512
MitoTracker Sonde molecolari FM rosso intenso  M22426 
Sonde molecolariCMFDA verdiC7025
Sonde molecolariCMF2HC bluC12881
RIPASanta Cruzsc-24948
FluoroDish Piatto di coltura sterile WorldPrecision InstrumentsEmatocitometro FD35-100
Fisher Scientific267110
Tubi FACSBeckman Coulter2.523.749
Apparecchio FACSGallios   3L 10C
LC AVVIO RAPIDO DNA MASTER PLUSRoche3515885001
1057966311500446115405661010415900125200056 FM verdi MitoTracker CellTracker CellTracker

Riferimenti

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