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Articolo metodologico

Propagazione in piccola scala di iPSCs umano in siero-liberi Condizioni di routine Caratterizzazione immunocitochimica

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DOI:

10.3791/55260

⸱

18 febbraio 2017

 , 
1Department of Neurology, The University of Arizona

In questo articolo

Sommario

La caratterizzazione regolare delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), per accertare il mantenimento del loro stato pluripotente, è un passo importante prima che queste cellule vengano utilizzate per altre applicazioni. Qui descriviamo un metodo per la propagazione su piccola scala di iPSC umane specificamente progettato per consentire la loro facile e routinaria caratterizzazione tramite immunocitochimica.

Abstract

C'è un grande interesse nell'utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) per la modellazione di malattie e terapie cellulari a causa della loro specificità del paziente e della staminalità caratteristica. Tuttavia, la pluripotenza delle iPSC, che è essenziale per la loro funzionalità, deve essere confermata prima che queste cellule possano essere utilizzate in tali applicazioni. Sebbene sia necessaria una rigorosa caratterizzazione delle iPSC, attraverso diversi saggi cellulari e funzionali, per stabilirne la pluripotenza, la valutazione di routine del mantenimento della pluripotenza può essere ottenuta in modo più semplice ed efficace attraverso tecniche immunocitochimiche. Qui, presentiamo un protocollo sistematico per la coltura di hiPSCs, in modo ridotto, per facilitare in particolare la verifica del loro stato pluripotente utilizzando l'immunocitochimica. Più specificamente, questa metodologia comprende un mezzo efficiente ed economico per coltivare iPSC in condizioni prive di siero e placcarle su piccoli vetrini da camera o vetrini protettivi ideali per l'immunocitochimica.

Introduzione

Riprogrammazione delle cellule somatiche adulte umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) fornisce un modo per ottenere un approvvigionamento potenzialmente illimitata di cellule specifiche del paziente per studiare la malattia 1, 2. Ricapitolando un fenotipo malattia in vitro renderebbe plausibile per esaminare i meccanismi cellulari e molecolari associate alla malattia, e migliorare la scoperta di nuovi farmaci e la medicina personalizzata 3. Inoltre, iPSCs umane (hiPSCs) offrono la possibilità di derivare specifici tipi cellulari che possono essere utilizzati come una risorsa unica per sostituire le cellule morte o disfunzionali e funzione di ripristino nel contesto di diversi disturbi 4, 5.

Un importante prerequisito per utilizzare iPSCs nelle applicazioni di cui sopra è garantire che il loro pluripotenti e indifferenziato stato viene mantenuto durante l'espansione in coltura. Tipicamente, techniques come citofluorimetria, Western blotting, PCR e saggi funzionali, che richiedono grandi quantità di cellule e attrezzature specializzate, vengono utilizzati per l'analisi dettagliata dei COPSI pluripotency 6, 7, 8, 9, 10. Tuttavia, la valutazione di routine di stato indifferenziato delle iPSCs 'potrebbe effettivamente essere raggiunto attraverso la propagazione limitata di queste cellule specificamente per immunocitochimica (ICC), coinvolgendo così tempo e risorse ridotte.

I recenti progressi permettono la crescita di iPSCs in condizioni prive di siero definiti, che è un miglioramento significativo rispetto ai sistemi di coltura convenzionali che richiedono murine strati di alimentazione fibroblasti e mezzi di siero contenente. Tuttavia, la letteratura attuale non include i protocolli graduali chiare che descrivono come la transizione da iPSCs alimentatorelivello per sistemi privi di alimentazione.

In questo contesto, la presente protocollo dettagli sistematicamente come hiPSCs coltivati ​​topo irradiati fibroblasti embrionali (Imef) strati di alimentazione possono essere (1) atto a propagare in terreno privo di siero, e (2) coltivate su piccola scala per supportare specificamente robusta analisi immunocitochimica. Nel complesso, questa metodologia rappresenta una procedura tempestiva e conveniente per la propagazione iPSCs umani in condizioni di assenza di siero per la conferma della loro pluripotenza su una base di routine utilizzando immunocitochimica.

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Protocollo

hiPSCs sono state derivate da fibroblasti dermici umani isolati da 4 mm biopsie della pelle e riprogrammato in casa tramite Sendai virus-mediata riprogrammazione 11. La University of Arizona Institutional Review Board ha approvato tutte le procedure per il reclutamento e la raccolta soggetto biopsia.

1. Preparazione della matrice extracellulare superficie rivestita per la Cultura iPSC

  1. Un giorno prima della confluenza di culture hiPSC che crescono su iMEFs, preparare matrice extracellulare (Matrigel) piastre rivestite.
  2. disgelo lento una aliquota della matrice extracellulare (molto dipendente, seguire le istruzioni sulla scheda tecnica) sul ghiaccio nel 4 ° C per 2 ore.
  3. In una cappa di biosicurezza, utilizzando puntali freddo (conservato a -20 ° C), aggiungere 1 aliquota di matrice extracellulare di Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture fredda Dulbecco F-12 (DMEM / F12 / HEPES) secondo la specifica fattore di diluizione lot .
  4. Dispensare 600 ~81; L di matrice extracellulare per pozzetto di ogni nuova coltura cellulare trattata 12-pozzetti necessari.
  5. Incubare la piastra a temperatura ambiente per qualche ora. Qui, utilizzare un tempo di incubazione di 3 h.
    NOTA: Le piastre possono essere utilizzate immediatamente o conservate a 4 ° C per un massimo di due settimane.

2. Trasferimento di hiPSCs Grown su cellule di alimentazione Imef sulla matrice extracellulare per la propagazione

  1. Il giorno della passaging, rimuovere la piastra rivestita matrice dal 4 ° C e lasciare che la piastra raggiunga la temperatura ambiente per 1 h in cappa coltura tissutale.
  2. Aspirare il medium dal 1 pozzetto di una piastra da 6 pozzetti della cultura hiPSC crescente sulla iMEFs e sostituire con 500 microlitri collagenasi dissociazione reagente (1 mg / ml in terreno di coltura).
  3. Incubare a 37 ° C per ~ 10 - 30 min fino a che i bordi delle colonie IPSC sembrano sollevare leggermente.
    NOTA: il tempo di incubazione è la linea dipendente e varia. Monitorare la dissociazione al microscopio.
  4. Autoefully aspirare il reagente di dissociazione e lavare delicatamente 2 volte con tampone fosfato (PBS, pH 7,4).
  5. Aggiungere 1 ml di temperatura ambiente mTeSR1 terreno completo con 10 ng / mL Rho-associata inibitore della proteina chinasi (Y-27632 inibitore ROCK) al pozzo.
    NOTA: l'utilizzo di una miscela 50:50 di media Imef condizionata e mTeSR1 durante questo passaggio iniziale è suggerito e può essere utile per la sopravvivenza delle hiPSCs durante questa transizione dei media.
  6. Usando un piccolo microscopio a contrasto di fase disposto parzialmente all'interno della cappa, segnare manualmente e prendere 1 - 2 colonie hiPSC (~ 700 - 1.000 micron di diametro) con una siringa e un ago (25 G, 1½ a). Spingere fuori i pezzi ottenuti della colonia in mezzo con una punta P200 pipetta.
  7. Aspirare e smaltire la matrice dal nuovo piatto, facendo attenzione a non disturbare il rivestimento.
  8. Trasferire 1 ml di sospensione cellulare dal vecchio pozzo contenente i iPSCs segnati nella nuova matrice rivestito bene.
  9. PlaCe la piastra in incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2. Rock the plate in vari rapido, avanti e indietro, e da lato a lato movimenti per diffondere uniformemente le cellule. Non disturbare la piastra per 24 h.
  10. Eseguire quotidiane modifiche piena media con mTeSR1 terreno completo (aggiunta di Y-27632 ROCK Inhibitor non è necessaria dopo la placcatura iniziale fase 2.5).

Passaging 3. piccola scala di hiPSCs su piastre rivestite Matrix

NOTA: Generalmente, dopo il trasferimento iniziale dei hiPSCs alla matrice piastre rivestite, le cellule devono essere diversi passaggi ancora una volta in maniera simile per garantire che tutti iMEFs sono stati eliminati e le cellule sono adattati a alimentatore-Free condizioni.

  1. Un giorno prima della confluenza iPSC Preparare freschi rivestito lastre matrici come discusso nella sezione 1.
  2. Il giorno di passaggio, rimuovere la piastra rivestita matrice dal C incubazione 4 ° e lasciare che la piastra raggiunga la temperatura ambiente per 1 h nel cul tessutiCappuccio tura.
  3. Aspirare il medium dal 1 pozzetto di una piastra da 6 pozzetti di hiPSCs (originariamente la transizione da alimentatore a matrice) e sostituire con 500 microlitri di buffer di dissociazione cellulare.
    NOTA: Il buffer di dissociazione cellulare commerciale utilizzato qui (vedi Materiali Tavolo) è più adatto per l'utilizzo con il mezzo mTeSR1 rispetto alla collagenasi.
  4. Incubare a temperatura ambiente per 3 - 7 min fino a che i bordi delle colonie IPSC sembrano sollevare leggermente. Come accennato prima, il tempo di incubazione è retta dipendente e variabile. Pertanto, monitorare la dissociazione cellulare al microscopio per determinare il tempo ottimale.
  5. Con attenzione aspirare il buffer di dissociazione e lavare delicatamente 2 volte con PBS.
  6. Aggiungere 500 ml di temperatura ambiente mTeSR1 terreno completo con 10 ng / mL Y-27632 inibitore ROCK al pozzo.
  7. Invece di colonie di punteggio come al punto 2.6, premere il numero desiderato di colonie nei media con una punta P200 e triturare delicatamente la sospensione cellulare 2 volte against un angolo del pozzo per rompere le colonie hiPSC in ciuffi di ~ 50 - 200 micron di dimensione. Ad esempio, per un 12-pozzetti, selezionare 1 - 2 colonie di trasferire in ogni 1 nuovo pozzo. Trasferire la sospensione cellulare dal vecchio pozzo in un'unica nuova pozzetto di una piastra 12 pozzetti.
  8. Rock the plate in vari rapido, avanti e indietro, e movimenti da lato a lato per diffondere uniformemente le cellule, e lasciate riposare piastra per 24 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
  9. Eseguire quotidiane modifiche piena media con mTeSR1 terreno completo. Come accennato in precedenza, non è necessario aggiungere Y-27632 ROCK Inhibitor dopo fasciame iniziale.
    NOTA: non utilizzate colonie IPSC dal punto 3.7 possono essere facilmente crioconservati a questo punto.

4. Preparazione della Camera diapositive e lamelle per semina di hiPSCs per Immunocitochimica

NOTA: Il seguente protocollo utilizza 4-ben camera di diapositive di plastica e 12 mm coprioggetto di vetro con appropriate volumi di supporti nel multi-pozzi per supportare immunocitochimica costo-efficacia. Tuttavia, i volumi dei supporti possono essere aumentate se l'uso del bene e coprioggetto di dimensioni maggiori si desidera.

  1. Un giorno prima hiPSC confluenza, preparare le diapositive da camera appena rivestiti con matrice extracellulare come discusso nella sezione 1. Aggiungere la soluzione di matrice sufficiente (~ 300 - 500 ml per pozzetto di una diapositiva camera 4-bene) per rivestire completamente ogni bene senza alcuna preoccupazione di evaporazione. In alternativa, dopo aver piazzato 1 puliti e sterilizzati vetrino in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti, cappotto con 500 microlitri matrice extracellulare e assicurarsi che il vetrino non galleggia sulla parte superiore della soluzione.
  2. Il giorno di passaggio, rimuovere le diapositive rivestiti camera / coprioggetto da 4 ° C e consentire acclimatazione a temperatura ambiente per 1 h in cappa coltura tissutale.
  3. Aspirare il medium dal 1 pozzetto di una 12-pozzetti di hiPSCs e sostituire con 500 microlitri di buffer di dissociazione.
  4. Incubare a Temperatura per ~ 3 - 7 min fino a che i bordi delle colonie IPSC sembrano sollevare leggermente.
  5. Con attenzione aspirare il buffer di dissociazione e aggiungere 1 ml di temperatura ambiente mTeSR1 terreno completo con 10 ng / mL Y-27632 ROCK inibitore al pozzo.
  6. Utilizzando un microscopio a contrasto di piccola fase collocato all'interno della cappa coltura tissutale, scegliere manualmente 1 colonia / nuovo pozzo di una diapositiva camera 4-bene o 1 nuova vetrino da rivestire (~ 1.000 - 1.500 micron di diametro) con una punta P200 pipetta premendo fuori la superficie della lastra nel mezzo.
  7. Aspirare la matrice della nuova diapositiva camera / vetrino, facendo attenzione a non disturbare il rivestimento.
  8. Delicatamente triturare la sospensione cellulare 2 volte contro un angolo del pozzo per rompere le colonie hiPSC in ciuffi di ~ 50 - 200 micron di dimensioni. Trasferire 250 microlitri della sospensione cellulare dal vecchio pozzo in ogni nuovo pozzetto di una 4-ben scorrevole camera / coprioggetto.
  9. Portare il volume di ogni nuovo pozzo fino a 500 ml con mTeSR1 containing 10 ng / mL Y-27632 ROCK inibitore.
  10. Posizionare la camera di scorrimento / coprioggetto nel termostato a 37 ° C, 5% di CO 2.
  11. Dopo 24 ore, eseguire quotidianamente le modifiche piena media con mTeSR1 terreno completo. Anche come menzionato in precedenza, l'aggiunta di Y-27632 ROCK Inhibitor non è necessaria dopo il fasciame iniziale.

5. Preparazione di iPSCs per Immunocitochimica

  1. Una volta confluenti, di preservare le colonie hiPSC tramite la fissazione rimuovendo il materiale dai pozzi e l'aggiunta di pre-riscaldato ATTENZIONE paraformaldeide al 4% (~ 300 ml / pozzetto di una ben 4 vetrino da camera / vetrino). Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
  2. Eliminare la paraformaldeide in modo appropriato in base al rischio biologico istituzionale e le linee guida sulla sicurezza chimica.
  3. Lavare le cellule 3 volte per 5 minuti ciascuno su un agitatore da banco con PBS.
    Nota: le celle in camera di diapositive / coprioggetto possono essere memorizzati con ampio PBS a 4 ° C a tempo indeterminato in questa fase.In alternativa, possono essere immediatamente utilizzati per ICC.

6. Immunocolorazione di hiPSCs con pluripotenza marcatori

NOTA: hiPSCs Immunostain con anticorpi pluripotenza standard. A titolo di esempio, ecco le cellule sono a doppio macchiato con anticorpi mira una superficie 1 e 1 antigene intracellulare in maniera sequenziale come segue: Anti-Stage-Specific Antigen embrionali-4 (SSEA4) con proteine ​​4 (da ottobre anti-Octamer vincolante 4) e anti-Tra-1-60 con anti-SRY HMG legati BOX gene 2 (SOX2) (vedere la tabella dei materiali per i dettagli di anticorpi).

  1. Aspirare il PBS dai pozzetti e aggiungere 500 microlitri / soluzione ben Blocco senza Triton-X-100. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
  2. Preparare una concentrazione predeterminata (qui, usare 1: 200) degli anticorpi di superficie, sia SSEA4 o Tra-1-60, diluendo in Blocking Solution senza Triton X-100.
    1. Per le diapositive da camera, preparare 300 ml / pozzetto di una diapositiva camera 4-benemescolando 298,5 ml di Blocking Solution sopra e 1,5 ml di anti-SSEA4 o Tra-1-60 anticorpo primario.
    2. Per coprioggetto, preparare 40 ml / vetrino mescolando 199 ml di Blocking Solution e 1 ml di anti-SSEA4 o Tra-1-60 anticorpo primario.
  3. Aspirare la soluzione di saturazione dalla diapositiva da camera ed erogare l'anticorpo primario in pozzetti. Per coprioggetto, inserire un pezzo di parafilm saldamente all'interno di una capsula di Petri e dispensare 40 ml dell'anticorpo primario in cima come una goccia. Utilizzando un ago della siringa piegato e pinze, sollevare con cura il vetrino di cultura ben e posizionarlo lato della cella verso il basso sulla goccia di anticorpi sul parafilm. Incubare per una notte a 4 ° C.
  4. La mattina successiva, lavare le cellule per 3 volte, 5 - 10 minuti ciascuno, rimuovendo l'anticorpo dalla diapositiva camera e aggiungendo in PBS. Per coprioggetto, sollevare ognuno fuori dal parafilm e rimetterla in un pozzo di 24 pozzetti, lato della cella fino. Aggiungere con cautela PBS.
  5. Preparare opportuni anticorpi secondari a 1: 500 in soluzione di saturazione.
    1. Per le diapositive da camera, preparare 300 ml / pozzetto di una diapositiva camera 4-ben mescolando 499 ml di soluzione di saturazione e 1 ml di capra anti-topo IgG3 Alexa Fluor 488 (per SSEA4) o 1 ml di capra anti-topo IgM Alexa Fluor 488 (per Tra-1-60).
    2. Per coprioggetto, preparare 40 ml / vetrino mescolando 499 ml di Blocking Solution e 1 ml di capra anti-topo IgG3 Alexa Fluor 488 (per SSEA4) o 1 ml di capra anti-topo IgM Alexa Fluor 488 (per Tra-1-60 ).
  6. Aspirare il PBS dalla diapositiva da camera ed erogare l'anticorpo secondario in pozzetti. Per coprioggetto, dopo il punto 6.2, invertire i coprioggetti sulla soluzione di anticorpi immesso sul parafilm a temperatura ambiente per 2 h.
    NOTA: Se si utilizza fluorescenza tagged anticorpi secondari, le cellule devono essere protetti dalla luce. Porre i vetrini da camera e il coprioggetto in un ENV scuroironment durante l'incubazione e lavaggi.
  7. Lavare le cellule 3 volte per 5 - 10 minuti ciascuna rimuovendo l'anticorpo dalla diapositiva camera e aggiungendo in PBS. Per coprioggetto, sollevare ogni uno con attenzione dalla parafilm e mettere di nuovo in un pozzo di 24 pozzetti, lato della cella fino. Delicatamente aggiungere PBS durante i lavaggi.
  8. Prima di rilevamento della seconda antigene intracellulare OCT-4 o SOX2 in questo caso, incubare nuovamente in Blocking Solution fornito con permeabilizzazione reagente (Triton-X-100) per 1 ora a temperatura ambiente.
  9. Per immunostain per OCT-4 o SOX2, è sufficiente seguire la metodologia descritta nei passi 6.1-6.6 per applicare gli anticorpi primari e secondari. Ai fini di questo protocollo, utilizzare OCT-4 e SOX2 ad una concentrazione di 1: 200 e l'anticorpo secondario di capra anti-IgG di coniglio Alexa Fluor 594 a 1: 500.
  10. Dopo i suddetti trattamenti anticorpi primari e secondari, lavare le cellule 3 volte per 5 - 10 min ciascuno con PBS e colorazione di contrasto con 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI) seguendo i protocolli standard se la visualizzazione nucleare si desidera.

7. Preparazione per la visualizzazione

  1. Per camera di diapositive, rimuovere con attenzione la camera superiore dalla diapositiva, seguendo le istruzioni del produttore. Poi, sciacquare in acqua distillata, e aggiungere mezzo e un coprioggetti montaggio abilitare microscopia.
  2. Per coprioggetto, invertire i coprioggetti su di una goccia di mezzo di montaggio posto su un vetrino da microscopio in vetro.
  3. Immagine al microscopio a fluorescenza o confocale.

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Risultati

Questo protocollo fornisce una descrizione graduale di come iPSCs umana possono essere trasferiti da feeder layer di alimentatore-Free condizioni, e successivamente propagato in modo limitato per consentire specificamente immunocitochimica conveniente per la conferma di manutenzione pluripotenza. La figura 1 mostra una rappresentazione schematica di questo protocollo. La figura 2A mostra colonie hiPSC crescono sulle iMEFs a 6 pozzetti. Queste colonie mos...

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Discussione

Il protocollo sistematica qui presentata offre un risparmio di tempo e metodo conveniente, sotto forma di una tecnica di coltura in scala ridotta, appositamente progettato per supportare efficace analisi pluripotenza tramite immunocitochimica.

I principali vantaggi del metodo descritto sono i seguenti. Tradizionalmente più di 3 o 4 passaggi sono necessari per la transizione iPSCs da strati di alimentazione per alimentatore-Free condizioni di coltura per eliminare iMEFs residui rimanenti dopo...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Fonti di finanziamento: L'Università dell'Arizona, la Jim Himelic Foundation e l'Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM-F12/HEPESLife Technologies11330032
Siero knockout sostitutivoLife Technologies10828028
L-GlutamminaLife Technologies25030081
MEM-NEAALife Technologies11140050
2-mercaptoetanoloLife Technologies21985023
Scienze cellulari umane ricombinanti FGF-BasicCRF001B
Inibitore ROCK Y-27632 R& D1254
Collagenasi di tipo IVLife Technologies17104019
Matrigel Matrice qualificata hESCCorning354277
mTeSR1 Cellulestaminali05850
mTeSR1 5x IntegratoreStemCell Technologies05850
Tampone delicato per dissociazione cellulareStemCell Technologies07174
0.1 M PO4 Tamponeinternon/a
Paraformaldeide, prillMicroscopia elettronica Scienze19202
1x Soluzione salina tamponata con fosfaton/an/a
Siero di capra normaleLife Technologies16210072
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA2153
Triton-X-100Sigma-AldrichX100
Oct-4A (C30A3) Corpo monoclonale di coniglio,
Sox2 (D6D9) Corpo monoclonale di coniglio,
SSEA4 (MC813) Corpo monoclonale di topo,
TRA-1-60(S) <		BR/> Cellula di segnalazione
> Segnalazione cellulare		2840
3579
4755
4746		In alternativa, una combinazione di 6 anticorpi primari pluripotenti può essere acquistata insieme come kit nel catalogo #9656
Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21042
Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21151
Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11037
Piastreper colture cellulari multipozzettoFisher Scientific 0720080/0720081Disponibile in 6, 12, 24, 48, 96 pozzetti
Vetrini per cameraFisher Scientific 12 565 21Disponibile in vetro o plastica Permanox in 1, 2, 4, 8, 16 pozzetti
Coverglass per la crescitaFisher Scientific 12 545 82Disponibile nelle misure da 12, 15, 18, 22 e 25 mm
medie basali

Riferimenti

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