La caratterizzazione regolare delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), per accertare il mantenimento del loro stato pluripotente, è un passo importante prima che queste cellule vengano utilizzate per altre applicazioni. Qui descriviamo un metodo per la propagazione su piccola scala di iPSC umane specificamente progettato per consentire la loro facile e routinaria caratterizzazione tramite immunocitochimica.
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Articolo metodologico
Propagazione in piccola scala di iPSCs umano in siero-liberi Condizioni di routine Caratterizzazione immunocitochimica
In questo articolo
Sommario
Abstract
C'è un grande interesse nell'utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) per la modellazione di malattie e terapie cellulari a causa della loro specificità del paziente e della staminalità caratteristica. Tuttavia, la pluripotenza delle iPSC, che è essenziale per la loro funzionalità, deve essere confermata prima che queste cellule possano essere utilizzate in tali applicazioni. Sebbene sia necessaria una rigorosa caratterizzazione delle iPSC, attraverso diversi saggi cellulari e funzionali, per stabilirne la pluripotenza, la valutazione di routine del mantenimento della pluripotenza può essere ottenuta in modo più semplice ed efficace attraverso tecniche immunocitochimiche. Qui, presentiamo un protocollo sistematico per la coltura di hiPSCs, in modo ridotto, per facilitare in particolare la verifica del loro stato pluripotente utilizzando l'immunocitochimica. Più specificamente, questa metodologia comprende un mezzo efficiente ed economico per coltivare iPSC in condizioni prive di siero e placcarle su piccoli vetrini da camera o vetrini protettivi ideali per l'immunocitochimica.
Introduzione
Riprogrammazione delle cellule somatiche adulte umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) fornisce un modo per ottenere un approvvigionamento potenzialmente illimitata di cellule specifiche del paziente per studiare la malattia 1, 2. Ricapitolando un fenotipo malattia in vitro renderebbe plausibile per esaminare i meccanismi cellulari e molecolari associate alla malattia, e migliorare la scoperta di nuovi farmaci e la medicina personalizzata 3. Inoltre, iPSCs umane (hiPSCs) offrono la possibilità di derivare specifici tipi cellulari che possono essere utilizzati ....
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Protocollo
hiPSCs sono state derivate da fibroblasti dermici umani isolati da 4 mm biopsie della pelle e riprogrammato in casa tramite Sendai virus-mediata riprogrammazione 11. La University of Arizona Institutional Review Board ha approvato tutte le procedure per il reclutamento e la raccolta soggetto biopsia.
1. Preparazione della matrice extracellulare superficie rivestita per la Cultura iPSC
- Un giorno prima della confluenza di culture hiPSC che crescono su iMEFs, preparare matrice extracellulare (Matrigel) piastre rivestite.
- disgelo lento una aliquota della matrice extracellulare (molto dipen....
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Risultati
Questo protocollo fornisce una descrizione graduale di come iPSCs umana possono essere trasferiti da feeder layer di alimentatore-Free condizioni, e successivamente propagato in modo limitato per consentire specificamente immunocitochimica conveniente per la conferma di manutenzione pluripotenza. La figura 1 mostra una rappresentazione schematica di questo protocollo. La figura 2A mostra colonie hiPSC crescono sulle iMEFs a 6 pozzetti. Queste colonie mos.......
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Discussione
Il protocollo sistematica qui presentata offre un risparmio di tempo e metodo conveniente, sotto forma di una tecnica di coltura in scala ridotta, appositamente progettato per supportare efficace analisi pluripotenza tramite immunocitochimica.
I principali vantaggi del metodo descritto sono i seguenti. Tradizionalmente più di 3 o 4 passaggi sono necessari per la transizione iPSCs da strati di alimentazione per alimentatore-Free condizioni di coltura per eliminare iMEFs residui rimanenti dopo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Fonti di finanziamento: L'Università dell'Arizona, la Jim Himelic Foundation e l'Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Siero knockout sostitutivo | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutammina | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoetanolo | Life Technologies | 21985023 | |
| Scienze cellulari umane ricombinanti FGF-Basic | CRF001B | ||
| Inibitore ROCK Y-27632 R | & D | 1254 | |
| Collagenasi di tipo IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel Matrice qualificata hESC | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Cellule | staminali | 05850 | |
| mTeSR1 5x Integratore | StemCell Technologies | 05850 | |
| Tampone delicato per dissociazione cellulare | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Tampone | interno | n/a | |
| Paraformaldeide, prill | Microscopia elettronica Scienze | 19202 | |
| 1x Soluzione salina tamponata con fosfato | n/a | n/a | |
| Siero di capra normale | Life Technologies | 16210072 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Corpo monoclonale di coniglio, Sox2 (D6D9) Corpo monoclonale di coniglio, SSEA4 (MC813) Corpo monoclonale di topo, TRA-1-60(S) < | BR/> Cellula di segnalazione > Segnalazione cellulare | 2840 3579 4755 4746 | In alternativa, una combinazione di 6 anticorpi primari pluripotenti può essere acquistata insieme come kit nel catalogo #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Piastre | per colture cellulari multipozzettoFisher Scientific | 0720080/0720081 | Disponibile in 6, 12, 24, 48, 96 pozzetti |
| Vetrini per camera | Fisher Scientific | 12 565 21 | Disponibile in vetro o plastica Permanox in 1, 2, 4, 8, 16 pozzetti |
| Coverglass per la crescita | Fisher Scientific | 12 545 82 | Disponibile nelle misure da 12, 15, 18, 22 e 25 mm |
Riferimenti
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, ....
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Ristampe e permessi
