Una camera per la migrazione delle cellule di misura personalizzabile

Summary

Dettagli Questo protocollo un metodo personalizzabile per misurare la migrazione delle cellule in risposta a fattori chemiotattici che possono anche essere utilizzati per determinare la velocità di diffusione di un farmaco da una matrice polimerica.

Abstract

La migrazione cellulare è una parte vitale della risposta immunitaria, la crescita e la guarigione delle ferite. La migrazione cellulare è un processo complesso che coinvolge interazioni tra le cellule, la matrice extracellulare, e fattori chimici solubile e non solubile (per esempio, fattori chemiotattici). Metodi standard per misurare la migrazione delle cellule, quali il test camera di Boyden, lavoro contando le cellule su entrambi i lati di un divisore. Queste tecniche sono facili da usare; tuttavia, offrono poche modifiche geometrico per diverse applicazioni. In contrasto, dispositivi microfluidici possono essere usati per osservare la migrazione delle cellule con gradienti di concentrazione personalizzabili di fattori solubili ^{1, 2.} Tuttavia, i metodi per fare test microfluidica a base possono essere difficili da imparare.

Qui, descriviamo un metodo semplice per la creazione di camere di coltura cellulare per misurare la migrazione delle cellule in risposta a gradienti di concentrazione chimica. Le nostre mi cellularimetodo della camera grazione può creare diversi gradienti di concentrazione lineare per studiare la migrazione delle cellule per una varietà di applicazioni. Questo metodo è relativamente facile da usare ed è normalmente eseguita da studenti universitari.

La camera di microcanali è stato creato inserendo un inserto acrilico nella forma della camera di microcanali finale e in una capsula di Petri. Dopo questo, poli (dimetilsilossano) (PDMS) è stata versata sopra dell'inserto. Il PDMS è stato permesso di indurire e poi l'inserto è stato rimosso. Questo ha permesso la realizzazione di pozzi in qualsiasi forma e dimensione desiderata. Le cellule possono essere aggiunti successivamente alla camera microcanali e agenti solubili possono essere aggiunti uno dei pozzi immergendo un blocco agarosio nell'agente desiderato. Il blocco agarosio viene aggiunto uno dei pozzi, e immagini time-lapse può essere preso della camera di microcanali per quantificare la migrazione cellulare. Modifiche a questo metodo possono essere fatte per una data applicazione, rendendo questo metodo higHLY personalizzabile.

Introduction

Affinché si verifichino processi vitali come la guarigione delle ferite, le risposte immunitarie e lo sviluppo embrionale, deve avvenire la migrazione cellulare. La migrazione cellulare coinvolge l'interazione tra le cellule e le cellule vicine, la matrice extracellulare e i segnali chimici solubili (attrattivi o repellenti). Ad esempio, nel processo di guarigione delle ferite, i fibroblasti svolgono un ruolo fondamentale nella fibrogenesi e nella contrazione delle ferite, in cui le cellule vengono reclutate nel sito della lesione per sintetizzare il collagene al fine di formare la matrice extracellulare³. Sono stati studiati numerosi meccanismi alla base della migrazione dei fibroblasti in un sito della ferita, che includono diversi fattori meccanici, fisici, elettrici e chemiotattici⁴. I fibroblasti rispondono particolarmente bene a diversi gradienti di concentrazione dei fattori di crescita. Questi diversi fattori di crescita lavorano insieme per ottimizzare la rigenerazione dei tessuti⁵. Osservando la risposta chemiotattica dei fibroblasti alle concentrazioni di fattori di crescita, è possibile studiare il modello di migrazione direzionale dei fibroblasti e come si orientano intorno agli ostacoli fisici per raggiungere la loro destinazione. Pertanto, gli obiettivi di questo studio erano in primo luogo sviluppare un sistema in cui la crescita dei fibroblasti potesse essere monitorata sotto la guida di barriere fisiche e in secondo luogo modellare la crescita dei fibroblasti mentre navigano attraverso il sistema.

Attualmente, il test della camera di Boyden è il sistema più utilizzato per misurare la migrazione delle cellule⁶. La camera di Boyden è costituita da una piastra multipozzetto a due camere in cui ogni pozzetto può contenere un mezzo con o senza chemioattrattivi⁷. Una membrana filtrante fornisce un'interfaccia porosa tra le due camere in ciascun pozzetto; Questo crea una barriera in modo che le cellule non possano passare a meno che non avvenga per migrazione attiva. Tipicamente, per la camera di Boyden, viene aggiunto un chemioattrattivo alla camera inferiore e il sistema viene lasciato equilibrare per formare un gradiente tra i pozzi superiore e inferiore⁴. Un problema con il saggio della camera di Boyden è che i gradienti ripidi finiscono per formarsi lungo un singolo asse perpendicolare alla superficie della membrana. Ciò fa sì che la differenza nella concentrazione di chemioattrattivo tra il pozzo superiore e quello inferiore sia inferiore a quanto originariamente previsto. A causa di questo vincolo, il saggio della camera di Boyden rende difficile correlare risposte cellulari specifiche con particolari caratteristiche del gradiente, come la pendenza e la differenza di concentrazione. Senza queste misurazioni, è difficile studiare l'integrazione del segnale multi-gradiente.

Per affrontare alcuni dei vincoli del tradizionale saggio della camera di Boyden, sono stati sviluppati saggi microfluidici per formare gradienti di concentrazione personalizzabili¹. I metodi standard per la creazione di sistemi microfluidici richiedono camere bianche per le tecniche litografiche. Queste tecniche possono essere difficili da imparare, soprattutto in un ambiente scolastico standard. Pertanto, abbiamo progettato un sistema a camera per misurare la migrazione cellulare che può essere effettuato senza l'utilizzo di una camera bianca. Utilizzando il nostro sistema, i pozzetti del saggio possono essere regolati alla dimensione preferita e può essere prodotto un gradiente di concentrazione lineare di pendenza personalizzata. Ciò consente una misurazione accurata della chemiotassi dal movimento casuale. Il design è un sistema economico e facile da usare per modellare la crescita cellulare in risposta a diversi stimoli chimici.

Protocol

1. Produrre una Camera Microchannel per creare un gradiente di concentrazione

1. Tagliare un pezzo muffa acrilica
   1. Ottenere un pezzo di acrilico della larghezza desiderata. Tipicamente utilizzare 1 lastre acriliche / 16 pollici di spessore. fogli più spessi sono difficili da tagliare bene e molto sottili fogli non hanno la resistenza meccanica, provocandone la rottura o ordito durante il processo.
   2. Creare un file CAD con la forma desiderata del pezzo acrilico per produrre una cavità all'interno del polidimetilsilossano (PDMS). Regolare la larghezza di canale e lunghezza per ottenere la sfumatura desiderato rilevante ai singoli protocolli sperimentali.
      1. Qui, utilizzare un pezzo acrilica delle seguenti dimensioni: due quadrati (0,254 cm x 0,254 centimetri) collegati da un canale largo 0,127 cm (lunghezza 0,254 cm) (Figura 1).
   3. Importare file CAD nell'apparecchiatura taglio laser e posizionare il pezzo acrilico in una taglierina laser secondo la manuil protocollo di costruttore.
      NOTA: In alternativa, 3D-stampa il pezzo dalla progettazione CAD. Il vantaggio di questo metodo è che i materiali alternativi possono essere utilizzati per lo stampo; Tuttavia, la risoluzione e riproducibilità possono essere diminuiti con stampa 3D rispetto a taglio laser.

Figura 1: Computer-Aided Design (CAD) Rappresentazione della Microchannel Camera. Questa immagine descrive il disegno CAD dell'inserto acrilico necessaria per creare la camera di microcanali. 1 A) Vista superiore di disegno CAD, 1B) Vista laterale del disegno CAD con dimensioni in pollici, 1C) vista dall'alto di disegno CAD con dimensioni in pollici Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Versare il polidimetilsilossano (PDMS)
   1. In una barca pesare, miscelare 10 parti in peso di elastomero base commerciale (Sylgard 184) con 1 parte in peso di elastomero commerciale Catalizzatore (es Sylgard 194). In genere, mescolare 10 g di elastomero base a 1 g di elastomero Catalizzatore.
   2. Mescolare per combinare la base e il catalizzatore con una micropipetta per 5 min.
   3. Impostare una campana a vuoto e posizionare la barca pesare con PDMS nel vuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle d'aria intrappolate.
   4. Spegnere il vuoto e rimuovere la barca pesare. Versare il PDMS sopra dell'acrilico cut-out in una piccola capsula di Petri. Assicurarsi che i PDMS copre completamente l'inserto.
   5. Lasciare le PDMS per curare notturno (almeno 18 ore) a temperatura ambiente.
3. Rimozione dell'inserto PDMS
   1. Dopo il trattamento il PDMS, rimuovere l'inserto tagliando attentamente le PDMS attorno al pezzo acrilico con un bisturi.

2. placcatura le cellule in una Camera Microchannel

1. La camera di sterilizzazione per la placcatura cellule.
   NOTA: Mentre PDMS possono essere sterilizzati con ossido di etilene o di altre tecniche, un trattamento UV rapido è veloce, poco costoso, e sufficiente per gli studi di coltura cellulare. La durata del trattamento UV breve non ha compromesso la struttura meccanica o l'integrità del pezzo PDMS.
   1. In un armadio standard di coltura cellulare, coprire completamente la camera con il 70% di etanolo.
   2. Mettere la piastra di Petri in cappa a flusso laminare con i coperchi off.
   3. Chiudere il cofano e accendere la luce UV. Esporre alla luce UV per 1-2 ore.
   4. Aprire la cappa a flusso laminare e attendere 15 minuti per ristabilire il flusso.
   5. Rimuovere l'etanolo al 70%.
   6. Lavare le camere due volte con sterile tampone fosfato salino (PBS). Usare 1 ml di PBS per ogni lavaggio. Rimuovere PBS e consentono camere per asciugare tutta la notte con i coperchi off.
      NOTA: In alternativa, invecedi utilizzare una cappa a flusso laminare, utilizzare una casella di camera UV per la sterilizzazione, se disponibile. Fare una scatola UV collocando una sorgente di luce UV nella parte posteriore di una scatola di cartone rivestito con un foglio di alluminio. Il foglio di alluminio riflette la luce per consentire un'illuminazione uniforme del campione.
2. Placcatura cellule in Camera
   1. Contare le cellule utilizzando Trypan blu e un emocitometro.
      1. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare a 400 ml di 0,4% Trypan blu e mescolare delicatamente. Applicare 100 ml di questa soluzione per l'emocitometro compilando delicatamente entrambe le camere sotto il vetrino di vetro.
      2. Utilizzare un microscopio con un obiettivo 10X per concentrarsi sulla griglia sul emocitometro. Utilizzare un contatore del riscontro della mano per contare le cellule senza macchia dal vivo all'interno di un set di 16 quadrati sul emocitometro.
      3. Contare le celle in tutte le 4 serie di 16 quadrati. Prendere il conteggio medio delle cellule dai 4 gruppi di 16 quadrati e moltiplicare per ⁴ 5x10. Questo numero finale è il number di cellule / ml in sospensione cellulare.
   2. Aggiungere 2.500 cellule ad un pozzetto su ciascuna camera. Questo si traduce in una densità quasi confluenti di cellule di ~ 30.000 / cm ^2.
   3. Consentono alle cellule di sedersi nella camera per 60 minuti prima di aggiungere supporti (Modified mezzo di Eagle Dulbecco, il 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina).

3. Blocchi Agarose Destrano Soaked

1. Creazione di un blocco di agarosio
   1. Versare 3% agarosio nello stampo 3D stampata (2 mm x 2 mm x 2 mm).
   2. Consentire l'agarosio solidificare in una camera a vuoto per 30 minuti per rimuovere eventuali bolle.
   3. Rimuovere il blocco di agarosio dallo stampo.
      NOTA: In alternativa, versare il 3% agarosio in piccola scatola di Petri con uno spessore di 2 mm. Tagliare un blocco 2 x 2 mm x 2 mm con un bisturi o altro utensile da taglio. Questo non è preciso come il sistema di stampo ma può essere un po 'più facile da fare.
2. completamente submerge il blocco di agarosio in una soluzione di concentrazione desiderata del fattore chemiotattico. Per valutare la formazione gradiente di concentrazione, lavare la camera di prima con destrano fluorescente. La concentrazione ed il peso molecolare di destrano dovrebbe corrispondere a quella di un fattore solubile o farmaco di interesse.
3. Mettere a bagno durante la notte il blocco di agarosio.

4. Time-lapse della diffusione Destrano di valutare la concentrazione Gradient Factor Solubile

1. Posizionare il destrano intriso blocco agarosio in un piccolo pozzo piazza della camera di microcanali.
2. Posizionare la camera di microcanali in un sistema di imaging cellulare o utilizzare un altro microscopio a fluorescenza con una capacità di time-lapse. Iniziare il time-lapse in base alle istruzioni del produttore.
   Nota: i risultati mostrati sono prese con filtro GFP, la luce del 50%, 4/10 pH, e l'ingrandimento 4X.

5. Time-lapse di crescita delle cellule

1. cellule placca nella camera di microcanali a un'estremità dellaCamera. Qui, usare 3T3 fibroblasti. Aggiungere 2.500 cellule ad un pozzetto nella camera microcanali. Contare le celle come descritto al punto 2.2.1.
   1. Consentono alle cellule di sedersi nella camera per 60 minuti prima di aggiungere supporti (Modified mezzo di Eagle Dulbecco, il 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina). Mantenere la camera di microcanali con cellule piastrate a 37 ° C in 5% CO _2. La migrazione cellulare attraverso il canale può essere visto con un microscopio.
   2. Aggiungere un marcatore o utilizzare un difetto microscopica nella camera come marcatore per servire come punto di partenza per quantificare la distanza mosse anteriori cellule.
2. Stabilire una sfumatura inserendo un gel di agarosio (8 mm ³ blocco) contenente il fattore di crescita concentrata, chemio-attrattivo, farmaci o altri fattori in prova (qui, 40% FBS viene utilizzato come esempio) ad una estremità del microcanale Camera.
3. Prendere immagini time-lapse del fronte delle cellule in movimento. Qui, i risultati mostrano immagini del cellulare front che sono state scattate ogni 12 h utilizzando un sistema di imaging.
4. Utilizzare le immagini del fronte delle cellule di quantificare il tasso di crescita delle cellule. Calcolare il tasso di crescita dapprima utilizzando la funzione polyfit MATLAB (roipoly) per creare una maschera poligonale definito dal fronte cellulare, le pareti del canale, e il marcatore di riferimento. Le dimensioni di questa maschera producono la distanza di migrazione del fronte del quale si calcola la velocità media front cellule. Altri studi hanno utilizzato un metodo simile ^8.
   NOTA: Confrontare il bordo frontale crescita cellulare su ciascun fotogramma alla concentrazione del fattore solubile oggetto alla stessa distanza. Il gradiente di concentrazione fattore solubile è calcolato utilizzando un modello di diffusione 1D approssimazione.
5. Prendere immagini fluorescenti delle cellule usando falloidina e colorazione DAPI.
   1. Fissare le cellule prima di colorazione con falloidina.
      1. Warm 4% paraformaldeide a 37 ° C.
      2. Aggiungere abbastanza 4% paraformaldeide per coprire cellule. Mantenere le cellule inparaformaldeide per 10 min.
      3. Sciacquare due volte con PBS per 15 minuti ogni volta. Usi abbastanza PBS per coprire le cellule.
   2. Rimuovere PBS da cellule e aggiungere la soluzione permeabilizzante sufficiente (0,1% Triton X-100 in PBS) per coprire le cellule. Lasciare soluzione per 10 min.
   3. Lavare due volte con PBS per 5 minuti ogni volta. Usi abbastanza PBS per coprire le cellule.
   4. Rimuovere PBS da cellule e aggiungere una soluzione bloccante (1% di siero albumina bovina in PBS) per 20 min.
   5. Rimuovere la soluzione di bloccaggio e lavare 2 volte con PBS per 5 minuti ogni volta. Usi abbastanza PBS per coprire le cellule.
   6. Da questo punto, proteggere le cellule dalla luce con un foglio di alluminio quando non viene utilizzato. Rimuovere PBS dalle cellule e aggiungere falloidina 488 diluito 1:50 in PBS per 1 ora.
   7. Lavare 2 volte in PBS per 5 minuti per ogni lavaggio. Usi abbastanza PBS per coprire le cellule. Quindi rimuovere PBS dalle cellule.
   8. Aggiungere DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) diluito 1: 1000 in PBS alle cellule per 15 min.
   9. Rimuovere DAPI elavare le cellule due volte con PBS per 5 minuti per ogni lavaggio.
   10. Rimuovere ultimo lavaggio e aggiungere abbastanza PBS per coprire le cellule. Le cellule possono ora essere ripreso con un microscopio a fluorescenza.

Results

La Figura 2 mostra il movimento del fronte cellulare attraverso il canale in risposta ad un gradiente di siero bovino fetale posto all'estremità opposta del canale da cui sono placcati le cellule. La parte anteriore cella è indicato a 48 ore (Figura 2A), 72 ore (Figura 2B), 96 ore (Figura 2C), e 120 h (Figura 2D) post placcatura. Il movimento del fronte delle cellule è stato rintracciato con queste immag...

Discussion

La nostra camera di microcanali può essere utilizzato per una moltitudine di scopi, tra cui la determinazione del tasso di migrazione delle cellule in risposta a fattori di crescita e fattori chemiotattici e misurando la velocità di diffusione di un farmaco da una matrice polimerica. È possibile utilizzare la nostra camera di microcanali per crescere le cellule e mettere un chemiotattico ad una estremità della camera. Le cellule crescono in risposta al chemiotattico, e la migrazione delle cellule possono essere quantifi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di elastomeri siliconici Sylgard 184	Kit di 2 parti Sigma-Aldrich	761036	poli(dimetilsilossano) che include base di elastomero siliconico e agente indurente in elastomero siliconico
Fogli acrilici	Plastica USA	44200
Piastre di Petri monouso	Falco	25373-041
Isotiocianato di fluoresceina– destrano	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Agarosio, Tipo I, Basso EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Fisher Scientific	11965092	Componenti dei terreni cellulari
Fetal Bovine Serium	Fisher Scientific	Fisher Scientific	16000036 Componenti dei mezzi cellulari
Penicillina-streptomicina	Fisher Scientific	15140148	Componenti dei terreni cellulari
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Fisher	Scientific BP24384
EVOS XL	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Strumento utilizzato per l'acquisizione di immagini time-lapse
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	Numero di modello VLS2.30	Taglierina laser utilizzata per il taglio della plastica