Una procedura completa per valutare il In Vivo Prestazioni del Cancro nanomedicina

Sommario

La scarsa comprensione delle prestazioni in vivo delle nanomedicine ostacola la loro traduzione clinica. Qui sono descritte le procedure per valutare il comportamento in vivo dei nanofarmaci antitumorali a livello sistemico, tissutale, di singola cellula e subcellulare in topi immunocompetenti portatori di tumore. Questo approccio può aiutare i ricercatori a identificare promettenti nanofarmaci antitumorali per la traduzione clinica.

Abstract

Ispirato dal successo delle precedenti nanomedicina cancro nella clinica, i ricercatori hanno generato un gran numero di nuove formulazioni negli ultimi dieci anni. Tuttavia, solo un piccolo numero di nanomedicine sono stati approvati per l'uso clinico, mentre la maggior parte dei nanomedicine sotto sviluppo clinico hanno prodotto risultati deludenti. Uno dei principali ostacoli alla traduzione clinica di successo di nuovi nanomedicina cancro è la mancanza di una comprensione accurata delle loro prestazioni in vivo. Questo articolo presenta una procedura rigorosa per caratterizzare il comportamento in vivo della nanomedicina in topi portatori di tumore al sistemico, tessuti, cella singola, e livelli subcellulare tramite l'integrazione di emissione di positroni tomografia tomografia-computerizzata (PET-CT), metodi di radioattività di quantificazione , citometria a flusso, e microscopia a fluorescenza. Usando questo approccio, i ricercatori possono valutare con precisione le formulazioni su scala nanometrica romanzo in modelli murini pertinenti cator. Questi protocolli possono avere la capacità di identificare i nanomedicine cancro più promettenti ad alto potenziale o traslazionale per aiutare nella ottimizzazione della nanomedicine cancro per la traduzione futuro.

Introduzione

Nanomedicina si sta spostando il paradigma dello sviluppo trattamento del cancro ^1. Ispirato al tremendo impatto clinico di precedenti nanomedicina cancro, come liposome- e nanotherapies albumina a base di ^{2, 3,} molte nuove formulazioni sono state prodotte negli ultimi dieci anni. Tuttavia, recenti analisi del successo di traduzione clinica di questi nanomedicina cancro indicano che solo pochi di essi sono stati approvati per l'uso clinico ^{4, 5.} Uno dei principali ostacoli alla traduzione clinica di nuovi nanomedicina cancro è la loro limitata miglioramento dell'indice terapeutico rispetto alla gestione diretta dei composti terapeutici liberi ^6. Come tale, la valutazione accurata delle prestazioni in vivo di nanomedicine a sistemica, tessuti, e livello cellulare in modelli animali preclinici è essenziale per identify quelli con indici terapeutici ottimali per future Traduzione clinica.

I nanomateriali possono essere radioattivo per la caratterizzazione quantitativa in animali che vivono con la tomografia ad emissione di positroni (PET), che ha superba sensibilità e riproducibilità tra tutte le modalità di imaging clinico ^7. Ad esempio, ⁸⁹ Zr-etichettato lungo circolanti nanomedicine sono stati caratterizzati in modelli murini di cancro ^{8, 9, 10,} così come in altri modelli di malattia ^11. Inoltre, il sangue emivita e biodistribuzione delle nanomedicine possono essere valutate utilizzando ex vivo misure della radioattività in tessuti ^8. Pertanto, radiomarcatura consente la valutazione quantitativa delle nanomedicine a concentrazioni sistemiche e tissutali.

È importante sottolineare che, radiolabeled nanomedicine generalmente non possono essere analizzate a singola cella o livelli subcellulari causa della limitata risoluzione spaziale del segnale radioattivo. Pertanto, marcatura fluorescente rivela essere una modalità complementare per la valutazione delle nanoparticelle con tecniche di imaging ottico come citometria di flusso e microscopia a fluorescenza ^12. A tal fine, le nanoparticelle marcate con radioisotopi e tag fluorescenti possono essere quantitativamente valutati in vivo mediante imaging nucleare e ex vivo mediante conteggio della radioattività, e possono anche essere ampiamente caratterizzati a livello cellulare imaging ottico.

In precedenza, abbiamo sviluppato procedure modulari per incorporare etichette fluorescenti radioattive e varie nanoparticelle, tra lipoproteine ad alta densità (HDL) ^11, liposomi ^{9, 10,} nanoparticelle polimeriche, frammenti di anticorpi, e nanoemulsions ^{10, 13.} Queste nanoparticelle etichettati hanno consentito per la caratterizzazione quantitativa in modelli animali pertinenti a diversi livelli, che hanno guidato l'ottimizzazione di questi nanomateriali per le loro applicazioni specifiche. Nel corso di studio, l'obiettivo è quello di utilizzare le nanoparticelle-the liposomiali piattaforma di nanomedicina più affermati ¹⁴ -come un esempio per dimostrare le procedure complete per generare una nanoparticella dual-etichettati e per caratterizzare a fondo in un classico singenici melanoma B16-F10 modello di topo ¹⁵ . Dai risultati, siamo fiduciosi questo approccio caratterizzazione di nanoparticelle può essere adattato per valutare altre nanomedicine cancro in modelli murini rilevanti.

Protocollo

La procedura consiste nella etichettatura duplice radioattiva e fluorescenti di nanoparticelle, imaging in vivo PET-CT, ex vivo misure biodistribuzione, e ex vivo immunostaining e citometria a flusso analisi. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali del Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

1. Preparazione di liposomi Dual-etichettati

NOTA: singenico B16 melanoma può essere indotta da iniezione di 300.000 cellule B16-F10 nei fianchi posteriori di topi C57BL / 6 sotto anestesia da inalazione di 2% di ossigeno -isoflurane contenenti. Utilizzare reagenti e strumenti sterili in un'area di lavoro sterile durante l'intervento chirurgico. Dopo l'intervento chirurgico, osservare attentamente gli animali fino al loro recupero dall'anestesia. Mettere gli animali nel loro gabbie solo quando riacquistano piena coscienza e la mobilità. li ospitare in camere sterili per animali con tumori xenotrapiantati. Tumori con una dimensionedi 300 mm ³ sono ideali per la caratterizzazione di nanoparticelle a causa delle loro pronunciate permeabilità e ritenzione effetti migliorati (EPR), che possono aumentare l'accumulo di nanoparticelle. I protocolli dettagliati sono forniti di seguito.

1. In un pallone a fondo tondo, dissolvere una miscela di 20 mg di lipidi in 2 mL di cloroformio contenente 1,2-dipalmitoyl- sn -glycero-3-phophocholine (DPPC), colesterolo, 1,2-disearoyl- sn -glycero- 3-fosfoetanolamina-poli (glicole etilenico) 2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-deferoxamina (DSPE-DFO) ^8, e l'acido 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-disolfonico ( DiIC12 [5] -ds) in rapporti molari di 61,3%, 33,4%, 5, 0,2% e 0,1% rispettivamente.
   NOTA: Questa composizione lipidica è molto simile alla formulazione liposomiale di doxorubicina attualmente utilizzati in clinica ^2. I liposomi risultanti dalla nostra procedura sarà strettamente imitare la performance in vivo del nanomedic clinicaine.
2. Utilizzare un evaporatore rotante per rimuovere il solvente organico e formare un film lipidico sottile a temperatura ambiente. Aggiungere 20 ml di PBS e ultrasuoni per 30 minuti per generare nanoparticelle liposomiali utilizzando una punta sonicazione 3,8 mm e un'ampiezza di 30 W, con sufficiente raffreddamento sul ghiaccio.
3. Centrifugare la soluzione di liposomi a 4.000 g per 10 minuti per rimuovere gli aggregati e lavare le nanoparticelle con PBS usando filtrazione centrifuga (peso molecolare di cut-off (MWCO:. 100 kDa) per rimuovere i lipidi liberi e solvente organico residuo concentrare il liposomi, che sarà rimangono nella camera superiore, e trasferirli in una nuova provetta. i liposomi possono essere memorizzati in un frigorifero in PBS fino a 1 settimana prima delle fasi successive.
4. Per il controllo di qualità, caratterizzare i liposomi dalla dispersione della luce dinamica (DLS). In particolare, mescolare 50 ml di liposomi con 950 ml di PBS, e poi trasferire il composto nella cuvetta dimensionamento. Posizionare la cuvetta nell'analizzatore e misurare la particelladimensioni e la loro distribuzione dimensionale. Le dimensioni delle particelle e la loro distribuzione delle dimensioni (indice di polidispersità (PDI)) dovrebbero essere 90-120 nm e 0.1 - 0.2, rispettivamente.
5. Per radiomarcatura, miscelare i liposomi purificati, pari a 2 mg di lipidi, in PBS a pH compreso tra 6,9 e 7,1 con 1 mCi ⁸⁹ Zr-ossalato a 37 ° C per 2 h in una provetta da 1,5 mL, (volume totale: ~ 100 ml). Rimuovere la libera, che non ha reagito ⁸⁹ Zr mediante filtrazione centrifuga (MWCO = 100 kDa), simile al punto 1.3. Lavare il retentato con PBS sterile e diluire al volume desiderato. La resa radiochimica dovrebbe essere 80-95%.
   ATTENZIONE! Lavorare con materiali radioattivi è altamente regolamentato. Le istituzioni devono essere certificati e di fornire i servizi necessari, formazione del personale, e rigoroso monitoraggio dell'uso della radioattività. I ricercatori hanno bisogno di ricevere una formazione adeguata e indossare dispositivi di protezione individuale e anelli dosimetria / badge durante la manipolazione di radioattività.
6. Determinare la purezza radiochimica dei liposomi radiomarcati per dimensione esclusione radio-HPLC, che in genere dovrebbe essere superiore al 98% ^10. purezze radiochimici inferiori al 95% sono indicativi di un lavaggio insufficiente nel passaggio 1.5.
7. Dopo radiomarcatura, determinare le dimensioni delle nanoparticelle di dispersione della luce dinamica. La dimensione e la PDI dovrebbero essere all'interno dello stesso intervallo come le misure in fase 1.4 ^10.
   NOTA: Se i campioni radioattivi non sono ammessi nel citofluorimetro o microscopio a fluorescenza, ^NAT non radioattivo Zr-ossalato può essere usato per etichettare liposomi nella fase 1.5. Questi liposomi non radioattive hanno caratteristiche identiche a loro analoghi radioattivi. Una rappresentazione di questa procedura è fornito in Figura 2.

2. In Vivo PET-CT Imaging e Biodistribuzione di liposomi Dual-etichetta

1. Iniettare circa 100 ml di liposomi dual-marcato Wesimo circa 300 pCi di radioattività in topi di melanoma trattenuto (C57BL / 6, di sesso femminile, 10 - 16 settimane) nelle loro vene coda, a circa 10 mCi ⁸⁹ Zr / kg di peso corporeo.
2. Per determinare il tempo di dimezzamento, prelevare il sangue dalla vena della coda da animali anestetizzati di sotto del 2% isoflurano contenenti ossigeno utilizzando 28-G siringhe da insulina. Raccogliere il sangue (10-20 ml) in tubi pre-pesato a 2 min, 15 min, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, e 48 ore dopo l'iniezione. Pesare il sangue per differenza, determinare il contenuto di radioattività in un contatore gamma, e calcolare la concentrazione di radioattività come percentuale della dose iniettata per grammo (% ID / g).
   NOTA: Eseguire la procedura in una stanza dotata di un sistema di anestesia, gabbie di recupero, riscaldamento, e un cappuccio a rischio biologico. Assicurarsi che gli animali recuperano completamente e contare su una mobilità normale dopo la procedura prima del trasferimento dalle gabbie di recupero a tenere gabbie. Casa gli animali portatori di tumore in camere apposite per gli animali somministrato conmateriali radioattivi.
3. 24 o 48 ore dopo l'iniezione del liposomi, immagine i topi in un piccolo animale microPET-CT scanner ^10. Posto l'animale anestetizzato orizzontalmente sulla sua pancia e tenerlo anestetizzato. Somministrare 2% isoflurano-ossigeno attraverso un cono di naso. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi prima della scansione per impedire loro di essiccazione.
4. Eseguire un corpo intero PET registrazione scansione statica di almeno 50 milioni di eventi coincidenti, con una durata approssimativa di 15 minuti. Impostare la finestra di temporizzazione energia e coincidenza a 350-700 keV e 6 ns rispettivamente. Successivamente, eseguire una scansione a 5 min tomografia computerizzata (CT). Impostare il tubo a raggi X ad una tensione di 80 kV e una corrente di 500 μA; la TAC utilizza 120 gradini di rotazione per un totale di 220 gradi, con circa 145 ms per frame ^10.
5. Dopo la scansione PET-CT, sacrificare subito i topi di anidride carbonica per asfissia e confermare le morti per Pinching le zampe degli animali. Una volta confermata, eseguire lussazioni cervicali.
6. Rimuovere il sangue nei tessuti di topo dal primo Tagliando l'atrio destro e poi iniettando 20 ml di PBS nel ventricolo sinistro, e successivamente raccogliere i tessuti rilevanti come tumore, fegato, milza, polmone, rene, muscolo, altri ^16.
7. Pesare i tessuti, misurare il loro contenuto radioattività gamma contando ^{8, 9,} e calcolare l'accumulo di tessuto radioattività come percentuale della dose iniettata per g (% ID / g).

3. Ex Vivo Citometria a Flusso e Immunocolorazione

NOTA: Iniettare circa 100 ml di liposomi fluorescenti in topi di melanoma attraverso la vena della coda alla dose di 0,5 mg di colorante per kg di peso corporeo. Se i campioni radioattivi non sono ammessi nel citofluorimetro e microscopio a fluorescenza, devono essere utilizzati liposomi non radioattivi.

1. Sacrifica l'iniezione dopo 24 ore i topi, come al punto 2.5, e raccogliere i tumori, che devono essere memorizzati in PBS freddo.
2. Per citometria a flusso, attenersi alla seguente procedura ^17:
   1. Preparare un cocktail enzimatico costituito da una miscela di purificato collagenasi I e II (4 U / mL), ialuronidasi (60 U / mL), e DNasi I (60 U / ml) in citometria a flusso tampone (PBS con 0,5% BSA e 1 mM EDTA).
   2. Miscelare 100 mg di tessuto tumorale con 200 ml di tampone cocktail di enzimi in una provetta da 1,5 ml e dadi tessuto a piccoli pezzi con forbici sottili. Aggiungere un altro 1,3 ml di cocktail di enzimi nel tubo e trasferire il contenuto di un 6-pozzetti.
   3. Agitare la piastra da 6 pozzetti su un agitatore orizzontale posta all'interno di un forno 37 C ° per 60 min a 60 rpm.
   4. Lavare il tessuto omogenato con citometria a flusso buffer di 3 volte per ottenere una sospensione singola cella.
   5. Colorare le cellule con un cocktail di anticorpi specifici per biomarcatori tra cui CD45, CD11b, Ly6C, CD11c,CD64, CD3, MHCII, e CD31 (diluizione 1: 200 per tutti gli anticorpi; informazioni clone è fornita nel foglio di calcolo dei materiali). Identificare i tipi di cellule rilevanti e determinare la loro intensità di fluorescenza media (MFI) di DiIC12 (5) -ds in ogni popolazione di cellule con un flusso adeguato di citometria software di analisi.
3. Per immunostaining, attenersi alla seguente procedura:
   1. Mettere un tumore in una cassetta piena di medio taglio ottimale (OCT) e congelarlo in ghiaccio secco.
   2. Fare 6-micron sezioni congelate di tessuto tumorale e metterli su vetrini istologici; sezioni dovrebbero coprire più grandi sezioni di tumore, che forniscono le informazioni più rappresentative sul tessuto.
   3. Macchiare le biomarcatori (ad esempio, CD31 per le cellule endoteliali) di interesse con i corrispondenti anticorpi (ad esempio, anti-CD31, clone MEC13.3). Fissare le sezioni con paraformaldeide; bloccarli con siero corrispondenza dell'origine delle specie degli anticorpi secondari; incubmangiato con anticorpi primari per 12 ore a 4 ° C e quindi con anticorpi secondari per 2 h; e, infine, lavare con PBS e coprire con coprioggetto. Immagine i vetrini colorati con una Leica confocale in posizione verticale SP5 microscopio ^{13, 16.}

Risultati

La Figura 1 mostra una panoramica della procedura. Figura 2 presenta la procedura di sintesi schematica dei liposomi dual-marcato descritte nel passaggio 1 ^10. La figura 3 mostra un rappresentante PET-CT immagine (Figura 3a), la radioattività quantificazione da immagini PET (figura 3b), il sangue emivita (Figura 3c), e biodistribuzione (figura 3d)...

Discussione

I passaggi critici all'interno del protocollo:

La qualità dei liposomi dual-marcato è la chiave per produrre risultati costanti per un lungo periodo di tempo. Coloranti fluorescenti liberi o ⁸⁹ ioni Zr possono generare totalmente diversi modelli di targeting e devono essere completamente rimosso durante la fase di purificazione. Inoltre, se il sistema immunitario influisce significativamente sperimentale prestazioni cancro nanomedicina, l'utilizzo di modelli di topo immunocom...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DPPC	Avantilipids	850355
Colesterolo	Sigma-Aldrich	C8667
DSPE-PEG2000	Avantilipids	880120P
DSPE-DFO	Fatto in casa	110634	Perez-Medina et al., JNM, 2014
DiIC12[5]-DS	AAT Bioquest	22051
Filtro centrifugo	Vivaproducts	VS2061
Evaporatore rotante	Buchi	R-100
Radio-HPLC	Shimadzu HPLC con 2 pompe LC-10AT	N/A
89Zr-ossalato	MSKCC	Sintetizzato in casa	TR19/9 ciclotrone a fascio variabile (Ebco Industries Inc.)
Micro PET-CT	Siemens	Inveon Micro-PET/CT
Contatore gamma	PerkinElmer	2470-0150
Citometria a flusso	BD Biosciences	Fortessa	Qualsiasi analizzatore di citometria a flusso multiparametrico sarebbe sufficiente
Topi C57BL/6	Jackson Laboratories
melanoma B16-YFP	Fatto in casa	N/A	Salmone et al., Immunità, 2016
Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7	128025	Biolegend
MHCII (M5/114/152)--APC	107613	Biolegend
CD45 (30-F11)--BV510	103137	Biolegend
CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7		139313 Biolegend
CD11b (M1/70)--BV605	101237	Biolegend
CD3 (17A2)--BV711	100241	Biolegend
CD31 (13.3)--PE		561073 Biolegend
CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5	117327	BD Biosciences
CD31 (13.3) senza fluoroforo	550274	BD Biosciences