Abbiamo sviluppato un sistema di screening ad alto rendimento modulare per scoprire nuovi composti contro Mycobacterium tuberculosis, il targeting intracellulare e in brodo coltura di batteri e citotossicità contro la cellula ospite di mammifero.
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Articolo metodologico
Sistema per l'efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi (TB), è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Con l'aumento della diffusione della tubercolosi multiresistente ai farmaci (MDR-TB), c'è una reale urgenza di sviluppare nuove strategie terapeutiche contro le infezioni da M. tuberculosis. Tradizionalmente, i composti vengono valutati in base alla loro attività antibatterica in condizioni di crescita in vitro in brodo; tuttavia, i risultati sono spesso fuorvianti per i patogeni intracellulari come M. tuberculosis poiché le condizioni di screening fenotipico in brodo sono significativamente diverse dalle condizioni effettive della malattia all'interno del corpo umano. Lo screening per gli inibitori che agiscono all'interno dei macrofagi è stato tradizionalmente difficile a causa della complessità, della variabilità dell'infezione e del lento tasso di replicazione di M. tuberculosis. In questo studio, riportiamo un nuovo approccio per valutare rapidamente l'efficacia dei composti sulla vitalità di M. tuberculosis in un modello di infezione da macrofagi. Utilizzando una combinazione di un test di citotossicità e un test di vitalità di M. tuberculosis in brodo, siamo stati in grado di creare un sistema di screening che genera un'analisi completa dei composti di interesse. Questo sistema è in grado di produrre dati quantitativi a un costo contenuto, alla portata della maggior parte dei laboratori e tuttavia è altamente scalabile per adattarsi a grandi ambienti industriali.
Introduzione
Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi (TB), è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. TB Drug-sensibile è una malattia curabile che richiede più antibiotici per un periodo di 6 mesi. Pur essendo una malattia curabile, la mortalità TB è stato stimato a 1,5 milioni nel 2015 1. Negli ultimi 10 anni, ci sono stati crescenti preoccupazioni sulla prevalenza della farmaco-resistente M. tuberculosis. Multiresistente TB (MDR-TB) è definita come TBC che è resistente ad almeno isoniazide (INH) e rifampicina (RMP), e la maggior parte dei ceppi MDR-TB sono anche resistenti per....
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Protocollo
1. ceppo batterico e crescita medio
- Rendere albumina destrosio e soluzione salina magazzino (ADS) solubilizzando 25 g di albumina di siero bovino, 10,0 g di destrosio, e 4,05 g di cloruro di sodio in 460 ml di acqua deionizzata. Filtro-sterilizzare ADS e conservare a 4 ° C.
- Rendere 7H9 brodo aggiungendo 4,7 g di polvere 7H9 e 2 mL di glicerolo a 900 ml di acqua purificata. Autoclavare il brodo 7H9 a 121 ° C per 10 minuti e lasciare raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere. Fare 7H9ADST aggiungendo 100 ml di ADS e 0,5 ml di Tween80 a 900 ml di brodo 7H9. Conservare a 4 ° C.
- Pesare 50 mg di kanamicina solfato e sciogliere in ....
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Risultati
High-Throughput Screening intracellulare con M. tuberculosis che esprime il gene della luciferasi
Figura 2A e 1 contengono i dati grezzi raccolti dal luminometro, espressi in unità luminescenti relativa (RLU), che mostra l'effetto di un aumento di concentrazione di TB rifampicina farmaco su M. tuberculosis all'interno cellule THP-1. La figura 2A è un dia.......
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Discussione
L'obiettivo di questo studio era quello di creare un metodo semplice e conveniente HTS utilizzando un modello di infezione intracellulare umana per M. tuberculosis. La tubercolosi è una malattia umana caratterizzata da infezione di macrofagi alveolari di M. tuberculosis. A causa di problemi di biosicurezza, ricerca che coinvolgono modelli biologici sia del batterio e le cellule ospiti è stata utilizzata in passato. Tuttavia, è stato dimostrato che l'uso di batteri surrogate e modelli non umani .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti per questo lavoro.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da BC Lung Association e Mitacs.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutammina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumina, pH bovino 7 | Affymetrix | 10857 | |
| Destrosio | Fisher Scientific | BP350 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamicina solfato | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N- Dimetilformammide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Acido idrocolorico (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acido acetico | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurina | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tubercolosis H37Rv | |||
| Piastra bianca a fondo piatto a 96 pozzetti | Corning | 3917 | |
| Piastra trasparente a fondo piatto a 95 pozzetti | Corning | 3595 | |
| Sigillante per lastre trasparente | Spettrofotometro Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spettrofotometro | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Luminometro | Biotek | Epoch | |
| Applied | Biosystems Tropix | TR717 |
Riferimenti
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric m....
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