Articolo metodologico

Sistema per l'efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare

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DOI:

10.3791/55273

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5 aprile 2017

 , 
1Department of Medicine, University of British Columbia

In questo articolo

Sommario

Abbiamo sviluppato un sistema di screening ad alto rendimento modulare per scoprire nuovi composti contro Mycobacterium tuberculosis, il targeting intracellulare e in brodo coltura di batteri e citotossicità contro la cellula ospite di mammifero.

Abstract

Il Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi (TB), è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Con l'aumento della diffusione della tubercolosi multiresistente ai farmaci (MDR-TB), c'è una reale urgenza di sviluppare nuove strategie terapeutiche contro le infezioni da M. tuberculosis. Tradizionalmente, i composti vengono valutati in base alla loro attività antibatterica in condizioni di crescita in vitro in brodo; tuttavia, i risultati sono spesso fuorvianti per i patogeni intracellulari come M. tuberculosis poiché le condizioni di screening fenotipico in brodo sono significativamente diverse dalle condizioni effettive della malattia all'interno del corpo umano. Lo screening per gli inibitori che agiscono all'interno dei macrofagi è stato tradizionalmente difficile a causa della complessità, della variabilità dell'infezione e del lento tasso di replicazione di M. tuberculosis. In questo studio, riportiamo un nuovo approccio per valutare rapidamente l'efficacia dei composti sulla vitalità di M. tuberculosis in un modello di infezione da macrofagi. Utilizzando una combinazione di un test di citotossicità e un test di vitalità di M. tuberculosis in brodo, siamo stati in grado di creare un sistema di screening che genera un'analisi completa dei composti di interesse. Questo sistema è in grado di produrre dati quantitativi a un costo contenuto, alla portata della maggior parte dei laboratori e tuttavia è altamente scalabile per adattarsi a grandi ambienti industriali.

Introduzione

Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi (TB), è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. TB Drug-sensibile è una malattia curabile che richiede più antibiotici per un periodo di 6 mesi. Pur essendo una malattia curabile, la mortalità TB è stato stimato a 1,5 milioni nel 2015 1. Negli ultimi 10 anni, ci sono stati crescenti preoccupazioni sulla prevalenza della farmaco-resistente M. tuberculosis. Multiresistente TB (MDR-TB) è definita come TBC che è resistente ad almeno isoniazide (INH) e rifampicina (RMP), e la maggior parte dei ceppi MDR-TB sono anche resistenti per selezionare farmaci di seconda linea TB, limitando così le opzioni di trattamento . Gli effetti della resistenza ai farmaci creano una sfida maggiore per il trattamento di pazienti co-infettati con il virus dell'immunodeficienza umana (HIV); 400.000 pazienti in tutto il mondo sono morte di tubercolosi associata ad HIV nel 2015 1. Purtroppo, gli Stati Uniti Food and Drug Administrazione ha approvato un solo nuovo farmaco contro la TB MDR-TB, bedaquiline, negli ultimi 40 anni 2. I progressi nella ricerca di una migliore e più brevi terapie TB sono urgentemente necessarie al fine di rimanere in testa nella lotta contro la tubercolosi e la MDR-TB.

Tradizionalmente, TB droga schermi vengono eseguite in vitro in condizioni di crescita in terreno di coltura, per cui i composti vengono aggiunti ad una coltura in crescita e la loro efficacia nel sradicare i microrganismi sono determinati dal conteggio delle unità formanti colonie (CFU) su terreno solido. Come conta CFU sono alta intensità di lavoro, che richiede tempo, e costoso, vari metodi indiretti sono stati sviluppati per alleviare questo problema. Tali metodi includono la vitalità dosaggio Alamar Blue 3, la determinazione della fluorescenza 4 dalla proteina verde fluorescente (GFP) o luminescenza 5 dai batteri luciferasi che esprimono, e la stima di adenosina trifosfato totale (ATP) 6, 7.

TB tipica è caratterizzata da un'infezione da M. tuberculosis del polmone, in cui i batteri risiedono e replicano all'interno dei fagosomi di macrofagi alveolari 8. Lo schermo semplice in brodo fenotipica può soddisfare patogeni extracellulari; tuttavia, in prospettiva storica, ha colpito composti contro M. tuberculosis individuati con questo metodo spesso non riescono a essere all'altezza delle aspettative durante le fasi di validazione a valle in modelli di infezione. Proponiamo che la tubercolosi farmaco è meglio eseguita in un modello di infezione cellula ospite intracellulare. Tuttavia, i modelli intracellulari possiedono molte barriere tecnologiche e biologiche di screening (HTS) sviluppo ad alta produttività. Un grande ostacolo è la complessità del processo di infezione, esemplificato da numerosi passaggi e la rimozione elaborato di batteri extracellulari da in-tra lavaggio. Un secondo ostacolo principale è il tempo lungo rigenze, il rilevamento crescita, normalmente svolto da CFU contando su piastre di coltura, è un processo che richiede più di 3 settimane per completare. Una soluzione per sostituire una conta è stata fornita mediante microscopia a fluorescenza automatizzata in combinazione con i batteri fluorescenti. Tuttavia, questa soluzione richiede un investimento iniziale che apparecchiatura è fuori portata per molti laboratori di ricerca. Un semplice, a basso costo, e il metodo HTS malattie rilevanti sarebbero migliorare notevolmente il processo di scoperta di nuovi farmaci.

In questo studio, riportiamo un nuovo sistema modulare HTS che mira a fornire un rapido e altamente scalabile, ma economica, saggio atto a determinare l'attività dei composti contro M. tuberculosis intracellulare. Questo sistema è composto da tre moduli: (i) intracellulari, (ii) citotossicità, e (iii) Prove in brodo. Il risultato finale combinato fornisce una descrizione completa delle proprietà dei componenti, con ulteriori informazioni riguardanti la modalità potenziale di azione. Questo scSistema reening è stato utilizzato in diversi progetti con varie librerie di composti modalità di azione che colpiscono, compresa l'analisi di sinergia farmaco 9, la stimolazione dell'autofagia 10, e l'inibizione di M. tuberculosis -secreted fattore di virulenza (non pubblicata). I composti di modalità sconosciuta di azione sono stati studiati 11. Una versione modificata di questo metodo è stato adottato anche dal nostro partner industriale come il metodo di screening primario di identificare nuovi composti contro intracellulare M. tuberculosis 11.

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Protocollo

1. ceppo batterico e crescita medio

  1. Rendere albumina destrosio e soluzione salina magazzino (ADS) solubilizzando 25 g di albumina di siero bovino, 10,0 g di destrosio, e 4,05 g di cloruro di sodio in 460 ml di acqua deionizzata. Filtro-sterilizzare ADS e conservare a 4 ° C.
  2. Rendere 7H9 brodo aggiungendo 4,7 g di polvere 7H9 e 2 mL di glicerolo a 900 ml di acqua purificata. Autoclavare il brodo 7H9 a 121 ° C per 10 minuti e lasciare raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere. Fare 7H9ADST aggiungendo 100 ml di ADS e 0,5 ml di Tween80 a 900 ml di brodo 7H9. Conservare a 4 ° C.
  3. Pesare 50 mg di kanamicina solfato e sciogliere in 1 ml di acqua deionizzata; la concentrazione finale è di 50 mg / mL. Filtro-sterilizzare e conservare a -20 ° C. Aggiungere 0,5 ml di kanamicina soluzione madre per 1 L di 7H9ADST.
    NOTA: Questo terreno deve essere fatta fresca, così scalare i volumi modo appropriato secondo la dimensione cultura.
  4. Crescere M. tuberculosis in 7H9ADST integrato con kanamicina nella cultura in piedi. Agitare la cultura quotidiana e diluirlo prima che la raggiunga OD600 1,0 per evitare grumi.
    NOTA: Il ceppo M. tuberculosis utilizzato per lo sviluppo di questo metodo è stato trasformato con H37Rv pJAK2.A plasmide 12. pJAK2.A è un plasmide integrativo basato sul vettore pMV361, che permette l'espressione ad alto livello del gene luciferasi di lucciola dal promotore HSP60 e può essere selezionata tramite kanamicina.

2. THP-1 Medium e manutenzione

  1. Aggiungere 50 ml di siero inattivato al calore fetale bovino (FBS) e 5 ml di 200 mM di L-glutammina a 500 ml di RPMI 1640 per fare mezzo RPMI incompleta (circa il 10% FBS e 2 mM glutammina).
  2. Mantenere una coltura cellulare THP-1 secondo protocollo standard 13. Brevemente, crescere cellule THP-1 in mezzo RPMI incompleta mantenendo una densità cellulare da 0,2 a 1 milione per mL di terreno tra passaggi.

3. Screening intracellulare high-throughput Utilizzando luciferasi che esprimono M. tuberculosis H37Rv

  1. Misurare la densità ottica di una sospensione batterica attiva crescita in uno spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 600 nm. Calcolare la densità batterica utilizzando il fattore di conversione di 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 batteri per mL.
  2. Pipettare i batteri sufficienti per una molteplicità di infezione (MOI) di 10: 1 in una nuova provetta da centrifuga. Pellet a 3.000 xg per 10 minuti e aspirare il liquido. Aggiungere 50 ml di siero umano a 450 ml di RPMI1640. Scala il volume di appropriarsi dei valori per l'esperimento.
  3. Per opsonize i batteri, risospendere il pellet ad una densità di 1 x 10 8 batteri per 500 ml di RPMI1640 contenente 10% di siero umano. Lasciare la miscela a incubare a 37 ° C per 30 min. Determinare la THP-1 cellule densità coltura contando con un emocitometro e un microsco invertitape.
  4. Agglomerare le cellule in provette da centrifuga sterili a 100 xg e 37 ° C per 10 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in RPMI incompleta ad una densità di 1 milione di cellule per ml. Aggiungere forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) per un 40 ng ml di concentrazione / finale.
    NOTA: Questo sarà indicato come il mix di differenziazione.
  5. Combinare opsonizzati M. tuberculosis con THP-1 mix differenziazione ad una MOI di 10: 1 e aliquota della miscela finale a 100 microlitri per pozzetto in una piastra bianca 96 pozzetti a fondo piatto. Regolarmente agitare la miscela per assicurare uniformità. Permettono la differenziazione e l'infezione di procedere notte a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2.
  6. Lavare i pozzetti due volte con 100 ml di RPMI ciascuno. Aggiungere composti diluiti alle concentrazioni desiderate in RPMI incompleta ed incubare per 3 giorni.
  7. Aspirare il terreno dai pozzi. Aggiungere 50 ml di reagente saggio luciferasi in ciascun pozzetto. Sigillare le piastre con transparent sigillanti piastra adesivi. Consentire 5 min di incubazione a 22 ° C e quindi ottenere una lettura in un luminometro a 1 s per pozzetto.

4. Analisi citotossicità usando un 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) 14

  1. Differenziare le cellule THP-1 in RPMI incompleta completato con 40 ng / ml di PMA in chiaro piastre da 96 pozzetti. Mantenere una densità cellulare di 1 milione per mL e un'aliquota di 100 microlitri per pozzetto. Lasciare differenziazione di procedere notte a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2.
  2. Aspirare il terreno dai pozzetti e lavarli due volte con RPMI 1640. Aggiungere composti diluite in RPMI incompleti ai pozzetti. Incubare per 3 giorni.
  3. Sciogliere 0.5 g di MTT in 100 mL di tampone fosfato salino (PBS) per ottenere una soluzione stock di 5 mg / mL. filtro sterile e conservare a -20 ° C, al riparo dalla luce; è meglio per rendere questa soluzione fresca.
  4. 2.5 h before la fine del periodo di incubazione di 3 giorni, aggiungere 25 ml di soluzione di MTT ad ogni pozzetto e completare il periodo di incubazione.
  5. Preparare 50% N, N-dimetil formammide (DMF) miscelando 250 ml di DMF con 250 mL di acqua deionizzata.
  6. Preparare tampone di estrazione MTT come segue: Pesare 100 g di SDS in una bottiglia da 500 ml e aggiungere 300 ml di DMF al 50%. Applicare a fuoco basso per permettere al SDS sciogliere. Aggiungere 10 ml di acido acetico puro e 12,5 ml di 1 M HCl. Riempire fino al segno da 500 ml con il 50% DMF; la composizione finale del tampone di estrazione è del 50% DMF, 20% SDS, 2,5% di acido acetico e 2,5% 1 M di acido cloridrico.
  7. Al termine del periodo di trattamento, aggiungere 100 ml di tampone di estrazione (riscaldato a 45 ° C per sciogliere i cristalli) a ciascun pozzetto. Lasciare la miscela a incubare durante la notte a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2. Leggere l'assorbanza a 570 nm.
    NOTA: Il test di citotossicità migliore viene eseguita in parallelo con un'intracellularischermo lare con persone dello stesso lotto e l'età di cellule THP-1.

5. In brodo di attività di analisi Utilizzando un resazurina Assay 3

  1. Crescere M. tuberculosis in 7H9ADST alla fase di mid-log (~ 0,5-0,8 OD 600). Diluire la cultura con la 7H9ADST a 0,01 OD 600. Diluire i composti in 7H9ADST a 2x le concentrazioni di prova e un'aliquota di 100 microlitri di ciascun composto diluito in ciascun pozzetto.
  2. Trasferire 100 microlitri della sospensione batterica diluita in ciascun pozzetto. Lasciare le piastre di incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato per 5 giorni. Sciogliere 10 mg di resazurina in 100 mL di acqua deionizzata e filtro sterile.
  3. Aggiungere 30 ml di soluzione di resazurina e monitorare il cambiamento di colore dopo 48 ore; la crescita batterica è indicato da una conversione di colore dal blu al rosa.
    NOTA: Un'analisi quantitativa può essere eseguita misurando sia la fluorescenza a 590 nm con eccitazione a 530 - 560nm o l'assorbanza a 570 nm e 600 nm 15.

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Risultati

High-Throughput Screening intracellulare con M. tuberculosis che esprime il gene della luciferasi

Figura 2A e 1 contengono i dati grezzi raccolti dal luminometro, espressi in unità luminescenti relativa (RLU), che mostra l'effetto di un aumento di concentrazione di TB rifampicina farmaco su M. tuberculosis all'interno cellule THP-1. La figura 2A è un dia...

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Discussione

L'obiettivo di questo studio era quello di creare un metodo semplice e conveniente HTS utilizzando un modello di infezione intracellulare umana per M. tuberculosis. La tubercolosi è una malattia umana caratterizzata da infezione di macrofagi alveolari di M. tuberculosis. A causa di problemi di biosicurezza, ricerca che coinvolgono modelli biologici sia del batterio e le cellule ospiti è stata utilizzata in passato. Tuttavia, è stato dimostrato che l'uso di batteri surrogate e modelli non umani ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti per questo lavoro.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da BC Lung Association e Mitacs.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RPMI 1640Sigma-AldrichR5886
L-glutamminaSigma-AldrichG7513
Siero fetale bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific12483020
Middlebrook 7H9Becton, Dickinson and Company271210
Tween80Fisher ScientificT164
Albumina, pH bovino 7Affymetrix10857
DestrosioFisher ScientificBP350
Cloruro di sodioFisher ScientificBP358
kanamicina solfatoFisher ScientificBP906
PMASigma-AldrichP8139
MTTSigma-AldrichM2128
N,N- Dimetilformammide (DMF)Fisher ScientificD131
1 M Acido idrocolorico (HCl)Fisher Scientific351279212
Acido aceticoFisher Scientific351269
SDSFisher ScientificBP166
ResazurinaAlfa AesarB21187
DMSOSigma-AldrichD5879
GlycerolFisher ScientificBP229
THP-1Type Culture CollectionTIB-202
M. tubercolosis H37Rv
Piastra bianca a fondo piatto a 96 pozzettiCorning3917
Piastra trasparente a fondo piatto a 95 pozzettiCorning3595
Sigillante per lastre trasparenteSpettrofotometro Thermo Fisher ScientificAB-0580
SpettrofotometroThermo Fisher ScientificBiomate 3
LuminometroBiotekEpoch
AppliedBiosystems TropixTR717
American per micropiastre

Riferimenti

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