Metodi per la Self-integrazione di Megamolecular biopolimeri sul asciugatura ad aria-LC Interfaccia

Sommario

Procedimento per l'essiccazione indotta autointegrazione di biopolimeri megamolecular sull'interfaccia cristallina aria-liquido viene fornito qui. Questa metodologia sarà utile non solo per comprendere i potenziali macroscopiche di biopolimeri, ma anche come un metodo di valutazione per materiali morbidi in campo biomedico e ambientale.

Abstract

Gli organismi viventi che utilizzano l'acqua sono sempre inclini a essiccazione nell'ambiente. Le loro attività sono guidati da micro biopolimero a base di e macro-strutture, come si è visto nei casi di acqua in movimento in fasci vascolari e idratante di acqua negli strati cutanei. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo per valutare l'effetto delle soluzioni (LC) liquido acquoso cristallini costituiti da biopolimeri all'essiccamento. Come biopolimeri LC hanno peso megamolecular, abbiamo scelto di studiare polisaccaridi, proteine ​​del citoscheletro, e DNA. L'osservazione delle soluzioni biopolimeri durante essiccamento sotto luce polarizzata rivela milliscale autointegrazione partendo dall'interfaccia aria LC instabile. La dinamica delle soluzioni acquose biopolimeri LC possono essere monitorati facendo evaporare l'acqua da una cellula di un lato aperto. Analizzando le immagini scattate utilizzando luce polarizzata trasversale, è possibile riconoscere le variazioni spazio-temporali nel parametro ordine orientativo. Questometodo può essere utile per la caratterizzazione non solo materiali artificiali in vari campi, ma anche tessuti viventi naturale. Noi crediamo che fornirà un metodo di valutazione per materiali morbidi in campo biomedico e ambientale.

Introduzione

Concentrandosi sui rigidi, strutture a forma di asta dei biopolimeri, materiali morbidi dinamiche sono stati utilizzati per varie applicazioni, comprese le matrici polisaccaride biofilm ^1, "gel attivi" composta da proteine del citoscheletro ^2, e "DNA origami" di forme desiderate ^3. Per chiarire le proprietà strutturali, molte strategie sono state esplorate, come la microscopia elettronica a trasmissione, microscopia elettronica a scansione, microscopia a forza atomica e microscopia confocale. Tuttavia, poiché questi metodi sono per lo più svolte in uno stato secco o statico, è difficile da spiegare i comportamenti dinamici in scala macroscopica, come si è visto nei sistemi viventi attuali. Recentemente, abbiamo osservato con successo il comportamento dinamico del biopolimeri sull'interfaccia aria LC acquosa attraverso la luce polarizzata ^4. Durante la visualizzazione della struttura orientata durante l'asciugatura biopolimerosoluzione, le variazioni temporali indicati autointegrazione di biopolimeri sull'interfaccia aria LC instabile.

Qui, descriviamo un protocollo per l'asciugatura di soluzioni LC biopolimeri all'interfaccia aria-LC con strumenti polarizzati. Al contrario di altre analisi della fase LC che prescindono essiccazione ^{5, 6,} le dinamiche LC durante il processo di essiccazione sono stati esaminati qui valutando il parametro ordine orientazionale nella vista laterale della fase fluida in una cella un lato aperto . La combinazione di evaporazione cellulare e l'utilizzo di strumenti polarizzati abilitate al monitoraggio macroscopico con direzione evaporazione controllata. Inoltre, è stato possibile per convalidare i record asciugatura concentrandosi sulle strutture cristalline dei microdomini adsorbite, che hanno risentito peso molecolare, concentrazione, ecc Per dimostrare l'efficacia del metodo, l'essiccazione processi di biopolimeri base con forme un'asta rigida, quali polisaccaridi, microtubuli (MT), e il DNA, sono stati studiati. Abbiamo scelto questi biopolimeri perché sono tipici esempi di macromolecole gerarchici con pesi megamolecular, e le loro interazioni intermolecolari permettono loro di formare LC stati.

Protocollo

1. Strumenti

1. dispositivo polarizzazione
   1. Per costruire un dispositivo di polarizzazione, fornire una sorgente di luce con una lampada alogena, una guida di luce, polarizzatori, una fase di esempio, una guida ottica, canna, si e una fotocamera digitale reflex (vedere Figura 1C e Materiali Elenco per la polarizzazione parti del dispositivo).

2. Preparazione della Soluzione Biopolymer

1. soluzioni polisaccaridi
   1. Sciogliere sacran ⁷ (0,5 g) in acqua pura (100 mL) mediante agitazione a ~ 80 ° C per più di 12 ore. Durante lo scioglimento, coprire il contenitore con pellicola trasparente per evitare l'evaporazione. Preparare una soluzione acquosa di xanthan gum nello stesso modo.
   2. Raffreddare le soluzioni a ~ 25 ° C per ottenere soluzioni acquose 0,5% in peso.
   3. Centrifugare la soluzione sacran per rimuovere le impurità (48.400 xg, a 4 ° C, 1 h, 3 Times).
2. soluzione MT
   1. Preparare una soluzione tubulina 0,5% (1 ml) in tampone Britton-Robinson (80 mM piperazine- N, N '-bis (acido 2-etansolfonico) (tubi), 1 mM etilenglicol-bis (β-amminoetil etere) - N, N, N 'N' acido -tetraacetic (EGTA), e 5 mM MgCl _2, pH 6,8) su ghiaccio ^8.
   2. Usare la soluzione tubulina 0,5% (50 mL) e guanosina-5' - [(α, β) -methyleno] trifosfato (GpCpp) (5 mL) per preparare una soluzione tubulina GpCpp contenente (50 mL). Incubare a 37 ° C per 3 ore per ottenere un nucleo MT stabile.
      NOTA: Il ruolo della GpCpp è quello di sostenere la formazione di MT e di sopprimere completamente la depolimerizzazione di MT a tubulina.
   3. Miscelare la soluzione allo 0,5% in peso tubulina (950 mL) e la soluzione tubulina GpCpp contenente (50 mL) a ~ 25 ° C per 1 giorno per ottenere una soluzione stabile MT 0,5% in peso.
3. soluzione di DNA
   1. Preparare una soluzione di DNA 0,5% (1 ml) in soluzione tampone Tris-EDTA (10 mM Tris, pH 8,0, con 1 mM EDTA).
4. Mantenere le soluzioni campione biopolimero 0,5% in peso a 25 ° C per l'esperimento di essiccazione.

3. Esperimenti di essiccazione e di osservazione sotto la luce Cross-polarizzata

1. Soluzioni in una cella di un lato aperto (Figura 1A)
   1. Tagliare un foglio di silicio (vedi Elenco materiali) in una forma appropriata con uno spessore di 1 mm (dimensione interna di 5-15 mm, 1 mm, e ~ 20 mm; Figura 1A).
      1. Montare una cella di un lato aperto composto da un distanziatore di silicio con dimensione interna di 5-15 mm, 1 mm, e ~ 20 mm e due vetrini non modificati (76 mm x 1 mm × 26 mm). Fissare entrambi i lati della cella con doppia clip in anticipo per mantenere la soluzione del campione di fuoriuscire.
   2. Aggiungere lentamente ciascuna della soluzione di biopolimero 0,5% in peso (100-300 mL) utilizzando un ~ 1 mm dimensione dei pori pipettaTE punta a ciascuna cella a ~ 25 ° C. Rimuovere le bolle d'aria dalle cellule utilizzando un ago da siringa.
   3. Collocare le cellule in un forno con un circolatore aria a 60 ° C sotto pressione atmosferica per evaporazione; direzione evaporazione è opposta a quella di gravità.
2. Osservazioni sotto luce polarizzata trasversale (Figura 1B-1C)
   1. Fornire luce visibile dritto con una lampada alogena da 100 W con una sorgente di luce a superficie piana su una vasta area (80 mm x 80 mm). Regolare i polarizzatori a 45 ° e 135 ° con i supporti (Figura 1C).
   2. Fissare le posizioni della sorgente luminosa, polarizzatori, fase del campione, e la telecamera utilizzando una guida ottica e stand asta (Figura 1C). Posizionare la fase del campione tra i due polarizzatori (la distanza tra i polarizzatori dovrebbe essere ~ 5 cm). Collocare la fotocamera ~ 20 cm dalla fase di campionamento per consentire di messa a fuoco.
   3. A orari stabiliti, collocare i campioni dal punto 3.1.3 tra la polarizers sul palco parallelo al piano XZ e coprire il dispositivo con una tenda nera; dispositivo reale è mostrato nella Figura 1C.
   4. Fotografare i campioni attraverso polarizzatori lineari attraversato utilizzando una fotocamera digitale reflex con un obiettivo zoom standard (vedi Lista dei materiali). Controllare le impostazioni della fotocamera, come la distanza focale, utilizzando il software del computer (vedi Materiali List).
3. Analisi spazio-temporale del dell'intensità della luce trasmessa (Figura 1C)
   1. Per valutare la variazione del parametro d'ordine orientativo nel processo di essiccazione, raccogliere fotografie oraria per 24 h.
   2. Misurare l'intensità della luce trasmessa lungo la linea centrale nella direzione Z come un valore di grigio con un programma di elaborazione di immagini (ad esempio, ImageJ).
   3. Tracciare un grafico del valore di grigio in funzione della distanza dal lato superiore aperta.
4. Osservazioni al microscopio sotto ligh cross-polarizzatat (Figura 1D)
   1. Per controllare i metodi, fare osservazioni al microscopio con un microscopio di polarizzazione dotato di una fotocamera CCD ^9. Mantenere una piastra ritardo del primo ordine nel percorso ottico. Controllare le condizioni per le foto utilizzando un software per PC.

Risultati

Utilizzo del dispositivo come mostrato in figura 1, l'auto-integrazione da microdomini a macrodomain su un essiccamento all'interfaccia aria-LC è stata valutata (Figura 2A). Come la prima dimostrazione dell'esperimento essiccazione, due tipi di polisaccaridi megamolecular, sacran (M _w = 1,9 x 10 ⁷ g mol ^-1) e gomma xantano (4,7 x 10 ⁶ g mol ^-1), sono stati confrontati. La Figura 2B

Discussione

Talvolta era difficile per la messa a fuoco sul campione per l'intensità della luce trasmessa troppo bassa. In tali casi, ponendo una pellicola di plastica trasparente esteso sul palco aiutato a organizzare la messa a fuoco. La limitazione della risoluzione osservabile dipendeva dalla lente della fotocamera, ~ 10 micron in questo caso. La limitazione osservabile lo spessore del campione, Ay, dipendeva dalla massima intensità luminosa della lampada, ~ 10 mm in questo caso.

Il vantaggio de...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
sacran	Green Science Materials Inc., Giappone		Da Aphanothece sacrum. Mw = 1.9 × 107 g mol-1
xanthan gum	Taiyo Kagaku Co., Giappone	Neosoft XC	Da Xanthomonas campestris. Mw = 4.7 × 106 g mol-1
tubulina	Cytoskeleton, Inc., USA	T240	Dal cervello suino.
GpCpp	Jena Bioscience, Germania	NU405L
piperazina-N,N′ -bis(acido 2-etansolfonico)	Sigma-Aldrichi, Co. LLC.	P6757-500G	TUBI
glicole etilenico-bis(β-amminoetiletere)-N,N,N',N'acido tetraacetico	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	342-01314	EGTA
MgCl2-6H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	135-15055
KOH	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	162-21813	pellet
DNA	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	D1626	Da salmone testes. Mw = 1,3 &volte; 106 Da (~2.000 bp)
Soluzione tampone Tris-EDTA	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	T9285-100ML	10 mM Tris, pH 8.0, con vetrino scorrevole EDTA 1 mM
	Matsunami Glass Ind., Ltd., Giappone	Foglio di gomma siliconica S1111
	Asone Co.	6-611-32	Spessore: centrifuga da 1 mm
	Beckman-Coulter, Inc., USA	Avanti J-25	dotato di una sorgente luminosa rotore JA-20
	Sumita Optical Glass, Inc., Giappone	LS-LHA
	Sumita Optical Glass, Inc., Giappone	GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)	80 mm & volte; 80 mm
lampada alogena	Ushio Inc., Giappone	JCR 15V150WBN
titolare	Sigmakoki, Co., Ltd.	KMH-80
stadio di campionamento	Sigmakoki, Co., Ltd.	TARW-25503L
supporto del campione	Sigmakoki, Co., Ltd.	Asta SHA-25RO
	Sigmakoki, Co., Ltd.	ROU-12-40
pali titolare	Sigmakoki, Co., Ltd.	RS-6-40
pali titolare	Sigmakoki, Co., Ltd.	RS-12-60
pali titolare	Sigmakoki, Co., Ltd.	RS-12-80
pali titolare	Sigmakoki, Co., Ltd.	RS-12-130
vettore	Sigmakoki, Co., Ltd.	CAA-25LS
supporto per fotocamera	Sigmakoki, Co., Ltd.	CMH-2
guida ottica media	Sigmakoki, Co., Ltd.	OBA-500SH
	Tomytech, tubo	per lenti BORG BK	80φ, L25 mm
tubo per lenti	Tomytech, tubo	per lenti BORG BK	80φ, L50 mm
	multibanda Tomytech, BORG		80φ
Piastra a V	Tomytech, BORG	Piastra a V 60S
Portatarga	Viexen, Co., Ltd.	portatarga SX
EOS Kiss X7i	Canon Inc., Giappone	8594B001	con un obiettivo zoom standard,  Software fotografico EFP 18-55 mm
	Canon Inc., Giappone	EOS Utility
PC	Microsoft	Microscopio
	Olympus	BX51
piastra di ritardo del primo ordine	Olympus	U-TP530	λ = fotocamera CCD da 530 nm
	Software fotografico Olympus	DP80
	Olympus	cellSens Programma di
basato su Java	del National Institutes of Health	ImageJ