Qui, presentiamo un protocollo per una tecnica di etichettatura mosaico che permette la visualizzazione dei neuroni derivati da una cellula progenitrice comune in due colori distinti. Questo facilita l'analisi lignaggio neurale con la capacità di singoli neuroni nascita aggiornamento e la funzione del gene studiando negli stessi neuroni di diversi individui.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Le analisi delle cellule lignaggio e studi la funzione del gene Impiegando doppi loco MARCM
In questo articolo
Sommario
Abstract
M osaic un nalisi con una r epressible c ell m Arker (MARCM) è un sistema di etichettatura mosaico positivo che è stato ampiamente applicato in Drosophila studi neurobiologici per descrivere morfologie intricate e di manipolare la funzione dei geni in sottoinsiemi di neuroni all'interno altrimenti non marcato e imperturbabile organismi. mosaici genetici generati nel sistema MARCM sono mediati attraverso la ricombinazione sito-specifica tra cromosomi omologhi all'interno di divisione delle cellule precursori per la produzione di entrambi marcati (cloni marcm) e cellule figlie non marcate durante la mitosi. Una estensione del metodo MARCM, chiamato twin-spot MARCM (tsMARCM), etichette sia delle cellule gemelle derivate da un progenitore comune con due colori distinti. Questa tecnica è stata sviluppata per consentire il reperimento di informazioni utili da entrambe le emi-linee. Con completo Analizzando diverse coppie di cloni tsMARCM, il sistema consente di tsMARCM ad alta risoluzione neurale lignaggio Mapping di rivelare l'esatto nascita ordine dei neuroni marcati prodotte dalle cellule progenitrici comuni. Inoltre, il sistema tsMARCM estende anche studi di funzione genica consentendo l'analisi fenotipica dei neuroni identici di diversi animali. Qui, descriviamo come applicare il sistema tsMARCM per facilitare gli studi di sviluppo neurale in Drosophila.
Introduzione
Il cervello, costituito da un vasto numero e diversi tipi di neuroni, dota gli animali con la capacità di percepire, di processo e rispondere alle sfide provenienti dal mondo esterno. I neuroni dell'adulto Drosophila cervello centrale sono derivati da un numero limitato di cellule staminali neurali, chiamati neuroblasti (NBS), durante lo sviluppo 1, 2. La maggior parte di NBS partecipare a neurogenesi cerebrale in Drosophila sottoposti divisione asimmetrica per generare NBs auto-rinnovamento e cellule madri gangliari (GMC), e le GMCs poi passare attraverso un altro giro di divisione per ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Costruire tsMARCM-ready mosche Uso del Required transgeni 11, 13
- Generare la versione originale di mosche tsMARCM-ready da transgeni che vengono effettuate da singoli mosche 11 (vedi tabella 1). Condurre programmi di incrocio standard di mosca genetiche, che sono stati descritti in precedenza, mettendo più transgeni nelle stesse scorte Fly 13.
- In una linea parentale, assemblare i transgeni di FRT 40A, UAS-mCD8 :: GFP (primo giornalista, mCD8 :: GFP, espressione del transgene è sotto il controll....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il sistema tsMARCM è stato utilizzato per facilitare neurale lignaggio analisi e studi la funzione del gene per il recupero delle informazioni importanti sui neuroni derivati da NBs comuni. Il sistema è stato utilizzato per identificare la maggior parte (se non tutti) i tipi neuronali, determinare il numero di cellule di ogni tipo neuronale, e accertare la nascita di ordine di questi neuroni 11, 12,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
I passaggi critici all'interno del protocollo
I passi 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 e 3.2 sono fondamentali per ottenere buoni risultati tsMARCM. Driver -GAL4 tessuto-specifica che non esprimono GAL4 in progenitori neurali sono preferiti per passi 1.1.1 e 1.2.1. Evitare di sovraffollamento gli animali cresciuti in fiale fly-alimentari nella fase 2.3. Poiché la latenza di induzione, il livello di espressione di FLP upon heat-shock, e il tempo medio di divisione dei progenitori neurali .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST 104-2311-B-001-034) e l'Istituto di Biologia Cellulare e organismica, Academia Sinica, Taiwan.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anidride carbonica (CO2)Fornitore | locale | n.a.Anestetizzare | le mosche |
| CO2 pad | Fornitore locale | n.a.Selezionare | , incrociare e trasferire le mosche |
| 10x PBS pH 7.4 | Uniregion Bio-Tech (o altri fornitori) | PBS001 | Sezionare, risciacquare, lavare e immunocolorare i cervelli delle mosche |
| Formaldeide | Sigma-Aldrich | 252549 | Fix cervelli di mosca |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Risciacquare, lavare e immunocolorare cervelli di mosca |
| Capra normale | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Immunostain fly brains |
| serum | |||
| Rat anti-mouse CD8 anticorpo | Invitrogen | MCD0800 | Immunostain fly brains |
| Coniglio anti-DsRed anticorpo | Clonetech | 632496 | Immunostain fly brains |
| Topo anticorpo anti-Brp | Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank | nc82 | Immunostain fly brains |
| Anticorpo IgG anti-ratto di capra coniugato con Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11006 | Cervello di mosca Immunostain Anticorpo |
| IgG anti-coniglio di capra coniugato con Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Cervello di mosca Immunostain Anticorpo |
| IgG anti-topo di capra coniugato con Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Cervello di mosca Immunostain |
| Reagente antidissolvenza oro SlowFade | Sonde molecolari | S36936 | Monta i cervelli delle mosche e protegge l'estinzione della fluorescenza |
| Piastra spot in vetro a depressione PYREX 9 | Corning | 7220-85 | Sezionare, risciacquare, lavare e immunocolorare i cervelli delle mosche Kit di elastomeri siliconici |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments | SYLG184 | Realizza piatti Sylgard neri per proteggere le pinze durante la dissezione cerebrale |
| Carbone attivo | Sigma-Aldrich | 242276-250G | Realizza piatti Sylgard neri |
| Pinze Dumont #5 | Fine Science Strumenti | 11252-30 | Sezionare e montare cervelli di mosca |
| Micro vetrino | Corning | 2948-75x25 | Montare cervelli di mosca Micro |
| vetro di copertura n. 1.5 | VWR International | 48366-205 | Montare cervelli di mosca |
| Smalto per unghie | Fornitore locale | non disponibile | Sigillare il vetro di copertura micro su micro vetrini Incubatore |
| La coltura LTI603 | Kansin Instruments | vola a 25 gradi C | |
| (o altri fornitori) | |||
| Bagno d'acqua | Kansin Instruments | WB212-B2 | Induce shock termico nelle mosche a 37 ° C |
| (o altri fornitori) | |||
| Agitatore orbitale | Kansin Instruments | OS701 | Lavaggio e immunocolorazione cervelli di mosca |
| (o altri fornitori) | |||
| Microscopio di dissezione | Leica | EZ4 | Seleziona, incrocia e trasferisce mosche; Sezionare, risciacquare, lavare e immunocolorare cervelli di mosca |
| Microscopio confocale | Zeiss (o altri fornitori) | LSM 700 (o altri modelli) | Cloni di immagini Image tsMARCM |
| software di elaborazione delle immagini 1 (ad es. , browser di immagini Zeiss LSM) | Zeiss | non disponibile | Pile di progetti di immagini confocali |
| Software di elaborazione delle immagini 2 (ad es., ImageJ) | non disponibile | non disponibile | Conteggio numero di celle di cloni tsMARCM |
Riferimenti
- Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain. Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).
- Yu, H. H., et al. Clonal development and organization of the adult....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
