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Articolo metodologico

Misurazione e l'alterazione di accoppiamento Drive a Maschio

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⸱

DOI:

10.3791/55291

⸱

15 febbraio 2017

 ,  ,  , 
1F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, 2Harvard NeuroDiscovery Center, Harvard Medical School, 3Department of Neurobiology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive un test comportamentale che utilizza unità di accoppiamento maschio in Drosophila melanogaste R per studiare la motivazione. Utilizzando questo metodo, i ricercatori possono utilizzare mosca avanzate tecniche neurogenetiche per scoprire i meccanismi genetici, molecolari e cellulari che sono alla base questa motivazione.

Abstract

Nonostante decenni di ricerca, le basi neuronali e molecolari degli stati motivazionali rimangono misteriose. Abbiamo recentemente sviluppato un nuovo, riduzionista, e il sistema scalabile per un'indagine approfondita della motivazione utilizzando l'unità di accoppiamento del maschio Drosophila melanogaster (Drosophila), i metodi per la quale abbiamo dettaglio qui. Il paradigma comportamentale centra sulla constatazione che l'unità di accoppiamento maschio diminuisce la fertilità a fianco nel corso di accoppiamenti ripetuti e recupera oltre ~ 3 d. In questo sistema, gli strumenti potenti neurogenetici disponibili nei fly convergono con l'accessibilità genetica e schema elettrico putativo disponibile per comportamento sessuale. Questa convergenza consente un rapido isolamento e l'interrogatorio di piccole popolazioni neuronali con specifiche funzioni motivazionali. Qui si dettaglio la progettazione e l'esecuzione del test sazietà che viene utilizzato per misurare e modificare la motivazione di corteggiamento nel moscerino maschio. l'utilizzo di questotest, abbiamo anche dimostrato che rasoterra accoppiamento maschio può essere superata attraverso la stimolazione dei neuroni dopaminergici. Il saggio sazietà è semplice, economico e robusto per le influenze di background genetico. Ci aspettiamo che il saggio di sazietà per generare molte nuove intuizioni nella neurobiologia degli stati motivazionali.

Introduzione

Il lavoro in Drosophila ha fornito una visione profonda e pionieristico in molti fenomeni biologici, compresa la natura del gene 1, i principi dello sviluppo embrionale 2, ritmi circadiani 3, e lo sviluppo e il cablaggio del sistema nervoso 4, 5, 6. La motivazione resta molto meno ben compreso che questi fenomeni, forse a causa delle limitazioni sui sistemi che sono stati studiati finora. La motivazione e la mosca è studiato principalmente nel contesto della fame, che presenta molte sfide a causa della loro irrisorio assunzione di cibo per attacco di alimentazione e di esoscheletro che esclude i segni evidenti di deposizione di grasso. Di conseguenza, vi è la necessità di ampliare i sistemi utilizzati per studiare motivazione in volo.

Descriviamo un quadro comportamentale per lo studio di azionamento accoppiamento inDrosophila. Questo sistema sfrutta gli strumenti neurogenetic in volo e l'accessibilità 7, 8, 9, 10, 11, 12 e la connettoma putativo del suo circuito dimorfismo sessuale 8, 13. Inoltre, gran parte della innata 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e ho imparato 22, 23, 24 circuiti senso-motorio che controlla il corteggiamento è stato elaborato in dettaglio, offrendo una rara opportunitàper individuare il nodo circuitale esatta su cui incide motivazione. Abbiamo recentemente riportato che, nel volo, come negli esseri umani, i livelli di dopamina sono fondamentali per unità di accoppiamento 25, 26, 27. Abbiamo ottenuto l'accesso genetica al relativo dettagliata a livello di circuito molecular- e che producono la dopamina e la ricezione di neuroni al volo, facilitando l'analisi di questo fenomeno conservato utilizzando i saggi che descriviamo qui 25.

Aggiungiamo ai test comportamentali nei Zhang et al. 25 una nuova arena comportamentale piatta che permette di video di punteggio, che noi chiamiamo un test di sazietà a 2 dimensioni (2-D), un importante miglioramento rispetto ai metodi precedenti. Di conseguenza, il nuovo saggio è più scalabile e quantificabile e quindi più adatto per schermi genetiche di geni e neuroni coinvolti nella motivazione. Usiamo questo nuovo test, insieme a saggi di corteggiamento e neurogemanipolazioni tiche, per dimostrare come misurare e modificare unità di accoppiamento in volo.

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Protocollo

NOTA: Questo protocollo descrive la preparazione (sezioni 1 - 3), esecuzione (sezione 4), e le analisi (sezione 4) di saggi sazietà 2-D. Quindi, utilizzando la stimolazione dopaminergica come esempio, la sezione 5 mostra come combinare la stimolazione thermogenetic con saggi sazietà 2-D per indurre ipersessualità. Sezione 6 descrive 3 modi per verificare i risultati dei dosaggi sazietà 2-D. Infine, la sezione 7 mostra come misurare il recupero delle unità di accoppiamento nei moscerini maschi.

1. Realizzazione 8- e 32-camera Arenas comportamentali

NOTA: Ogni ambito comportamentale costituita da più strati di fogli di plastica tagliati al laser tenuti insieme da viti esagonali e dadi ad alette a ciascuno dei quattro angoli (Figura 1A).

  1. Realizzare gli strati della scena. Realizzare ogni strato con un cutter laser per tagliare fogli di plastica acrilica alla forma appropriata (vedere Figura 1B, 1C per prodotti).
    NOTA: Molte ricerche Institutions hanno taglio laser nelle loro officine meccaniche o spazi creatore. Se l'istituzione ha accesso ad un taglio laser, continuare con i seguenti passaggi. In caso contrario, seguire le istruzioni nella fase 1.2 invece.
    1. Per ogni strato, aprire il modello di progettazione nel software del taglio laser.
      NOTA: I disegni possono essere trovati nei file PDF in modo appropriato nome (ad esempio, 8-Camera Arena - Layer 2 - Doors.pdf) in materiale supplementare 1. Questo file contiene anche le annotazioni per il tipo di plastica da utilizzare (ad esempio, 1 / 8 pollici (vale a dire 3,175 millimetri) acrilico trasparente). L'esatto spessore di ciascuno strato non è critica. Il requisito principale è quello di permettere 0,12 pollici (3 mm) o più di spazio verticale libero nelle camere.
    2. Regolare le impostazioni laser (potenza, fuoco, ecc) per il tipo e lo spessore di plastica da utilizzare. Plastica posto nel letto laser cutter ed eseguire il taglio laser.
      NOTA: Queste impostazioni variano ampiamente basato sulla cutte laserr modello e la forza della sua laser. Trova impostazioni appropriate basate su esperienze passate o effettuando tagli di prova su plastica di scarto. Le incisioni esagonali profonde sono inclusi nel disegno di recesso le teste delle viti esagono. Questa funzione consente una sola mano serraggio dei dadi in e permette arene di riposare piatta sulla panca (senza sporgere testa delle viti). Tuttavia, rendendo incisioni profonde è spesso difficile da realizzare, e che richiede tempo, con un cutter laser. Questo passaggio è facoltativo e può essere saltato senza influenzare i risultati comportamentali.
    3. Quando si taglia il telaio della porta (Layer 2, Figura 1A), utilizzare anche le impostazioni appropriate laser per incidere i numeri da camera incluse nel disegno (come in Figura 1B, 1C).
  2. Un ordine con un costruttore taglio laser in linea. Caricare tutti i file di progetto in formato PDF per l'arena 8 e / o 32-camera e specificare il tipo di materiale (ad esempio, 1/8 di pollice (vale a dire 3,175 millimetri) CLEAR acrilico) sulla base delle annotazioni nei file. I risultati appariranno come nelle figure 1B (Arena 8-camera) e 1C (Arena 32-camera).
  3. Montare arene usando quattro viti a testa esagonale e quattro dadi in per allineare e tenere insieme gli strati di plastica (Figura 1A). Le arene appariranno come in figura 1D, 1E (8-camera) e la Figura 1F, 1G (32-camera).
    NOTA: La parete cibo (Layer 4 in Figura 1A) è usata solo per dosaggi sazietà 2-D e viene omesso in arene 32 a camera, che vengono utilizzati in saggi corteggiamento.

2. Preparazione del cibo per 2-D sazietà Assay

NOTA: Perché un saggio sazietà 2-D estende 4,5 h, volare cibo viene utilizzato in campo per fornire nutrimento e acqua. Questo protocollo utilizza, ma non è limitato a, la farina di mais convenzionale-agar cibo volare.

  1. Parzialmente assemblare la sazietà Arena 2-D (8-camera) con i livelli 3-6(si veda la Figura 1A per le assegnazioni di livello) e serrare con i dadi ad alette e le viti esagonali.
  2. Mettete il cibo fresco volare in una bottiglia pulita, al microonde. Aggiungere acqua quanto basta per coprire la superficie inferiore della bottiglia (Figura 2A).
  3. cibo a microonde in alto per 30 - 45 s. Controllare il progresso e mescolare ogni 15 s fino al fuso (Figura 2B). ATTENZIONE! Vola alimentare bolle facilmente sopra.
  4. Utilizzare un smussato 1.000 microlitri pipetta punta (Figura 2C) per trasferire lentamente ~ 1 ml fuso cibo in ciascuna camera (Figura 2D).
  5. Lasciare cibo per resolidify a 4 ° C per ~ 10 minuti (Figura 2E) prima del montaggio completamente l'arena (Figura 2F).
  6. Utilizzare l'arena completata per esperimenti (vedi sezione 4) o conservare a 4 ° C.
  7. Conservare il cibo avanzato a 4 ° C e il riutilizzo.

3. Preparazione Virgin femmine per comportamentali Assays

NOTA: 2-D saggi di sazietà utilizzano un gran numero di mosche femmine vergini (~ 120 - 160 per un'arena comportamentale completo) che sono difficili da raccogliere utilizzando metodi standard. Questa sezione descrive un approccio alternativo utilizzando il transgene hs-HID sul cromosoma Y 28, che è stato usato con successo in saggi corteggiamento 25, 29. Il magazzino utilizzato per generare femmine vergini bianchi dagli occhi ha il genotipo w1118 (X) / HS-HID (Y); + / +; + / + (Bloomington magazzino Numero 24638).

  1. Flip vola in una nuova bottiglia, una volta 20 - 50% delle pupe hanno eclosed (vedi Figura 3A per esempio) e ci sono abbastanza maschi (5 - 10) per propagare il brodo.
  2. Heat Shock bottiglia originale in un bagno di acqua calda a 37 ° C per 1 h per attivare sufficientemente hs-HID uccidere maschi (Figura 3B). Dopo lo shock termico, solo femmine ECLOSE da queste bottiglie e così rimarrà vergine fino alsaggi.
    NOTA: Assicurarsi che tutti i lati della bottiglia sono riscaldati in modo uniforme (vedi Figura 3A per linea di galleggiamento). Estendere questa volta per un massimo di 2 ore se 1 h non è sufficiente per tutti i maschi eutanasia.
  3. Isolare le femmine raccolti per almeno 3 d prima di esperimenti per garantire che essi siano abbastanza vecchio per essere sessualmente recettiva 25, 29.
    NOTA: i maschi del cromosoma Y-less di tanto in tanto nascono da questo stock. Questi maschi hanno gli occhi bianchi e non sono influenzati dal calore shock, perché non contengono il transgene hs-HID. Non possono produrre spermatozoi e pertanto non può diminuire ricettività nelle femmine 30, 31.

4. Esecuzione e segnando 2-D sazietà saggi

NOTA: È importante controllare l'età del maschio vola mentre al disco di accoppiamento con l'età. Questo protocollo utilizza i maschi che sono 3 - 4 d vecchio 25 .

  1. Impostare l'incubatore alla temperatura desiderata (ad esempio, 23 ° C per il campione, esperimenti RT) e umidità (> 30%). Per incubatrici senza controllo dell'umidità, lasciando una tazza di acqua in incubatrice è sufficiente.
  2. Inserire un 2-D assay sazietà scena in incubatrice per ~ 30 minuti per equilibrare la temperatura e per evitare la condensazione nelle camere durante il corso dell'esperimento. Le porte rotanti devono essere in posizione aperta.
  3. Utilizzare una mosca aspiratore 32 per aspirare 15 - 20 femmine vergini in ciascuna camera dell'arena (figura 4).
    NOTA: È importante che le femmine e maschi non vengono anestetizzati lo stesso giorno come il test. Nella nostra esperienza, ciò potrebbe avere un impatto ricettività femminile e comportamento di accoppiamento maschio.
  4. Aspirare 1 maschio in ciascuna camera.
  5. Posizionare l'arena caricato in incubatrice sotto una videocamera consumer standard (Figura 5) e il film per 4.5 h.
  6. Punteggio video notando quando ogni Male vola inizia e finisce ogni accoppiamento (cioè copulazione). Questo passaggio potrebbe richiedere molto tempo in un primo momento. Con la pratica, si possono segnare i video a velocità 5x o superiore.
    NOTA: Dal momento che le mosche si accoppiano per ~ 20 min a ~ 23 ° C (durata inferiore a temperature più elevate) 29, si può sfogliare i primi 15 minuti di ogni accoppiamento.
  7. Dopo l'accesso tutti i tempi di accoppiamento, sommare il numero di accoppiamenti per ogni volo (vedi risultati rappresentativi).
  8. Utilizzare il codice fornito per generare un etogramma. Vedere supplementare Materiale 2 per il codice, le istruzioni e dati di esempio.
  9. Usare CO 2 o la temperatura fredda per anestetizzare le mosche prima di rimuoverli.

5. Utilizzo di manipolazione thermogenetic per invertire sazietà in 2-D sazietà Assays

NOTA: Questo protocollo test se la stimolazione thermogenetic di una popolazione neuronale definito può superare sazietà. Il fli sperimentalees esprimere il canale cationico termosensibile TRPA1 in popolazioni di neuroni definiti (UAS-TRPA1). I passaggi riportati di seguito valgono per la stimolazione dei neuroni dopaminergici (TH-GAL4), che hanno dimostrato di promuovere unità di accoppiamento 25. Questi passaggi possono essere utilizzati in combinazione con altri piloti neuronali per scoprire altre popolazioni che promuovono unità di accoppiamento.

  1. Per indurre thermogenetically comportamenti di accoppiamento in linea sazi, aumentare la temperatura nell'incubatrice (ad esempio, da 23 ° C a 28,5 ° C) dopo aver completato un completo 4.5 h 2-D esperimento sazietà.
  2. Dopo l'incubatore raggiunge la temperatura desiderata, continuare la stimolazione di calore e segnare gli accoppiamenti (es. Copulazioni) dei maschi per 1 ora (vedi Rappresentante dei risultati).
    NOTA: La temperatura e la durata della stimolazione può variare a seconda del genotipo per cui è necessario risolvere le condizioni ottimali che impediscono sovrastimolazione dei neuroni pur continuando a produrre un Robust fenotipo.

6. Utilizzando Corteggiamento e Locomotion per verificare sazietà

NOTA: Questa sezione descrive 3 metodi opzionali che possono essere utilizzati per verificare i risultati delle analisi sazietà 2-D. Essi non sono necessari per ogni test.

  1. Utilizzare saggi di corteggiamento per verificare la sazietà.
    1. Aspirare un maschio e una femmina vergine in ciascuna delle 32 camere in un'arena corteggiamento.
    2. Filmare le mosche per ~ 20 minuti utilizzando una videocamera consumer standard.
    3. Punteggio l'indice di corteggiamento (CI) per quantificare il corteggiamento 25; questa è la frazione di tempo impiegato corteggiamento (canto, in seguito, ecc.) e l'accoppiamento (cioè copulazione) su una finestra 5 min. Questa finestra inizia dalla prima istanza di corteggiamento. Se una mosca maschio non inizia il corteggiamento nei primi 15 minuti, la sua CI è 0. Naïve WT mosche dovrebbero mostrare un CI superiore a 0,9, mentre una mosca completamente sazi dovrebbe avere un CI below 0.2. Altre misure di corteggiamento possono essere considerati 23, 33.
  2. Segnando il corteggiamento in saggi sazietà 2-D
    1. Nota la quantità di tempo che una mosca maschio trascorre corteggiare, per un periodo di un saggio sazietà 2-D (per esempio, la prima h). Corteggiamento è definito come il maschio eseguendo qualsiasi fase del rituale (canto, in seguito, etc.). A differenza nella sezione 6.1.3, questo passaggio non include il tempo trascorre il maschio di accoppiamento.
    2. Dividere il tempo di corteggiamento sopra per il tempo totale il maschio non è stato corrispondente (cioè non copulare) nello stesso periodo di tempo. Ad esempio, se un maschio vola giudice 15 min e compagni per 20 min sul primo h, il rapporto è 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. Il rapporto viene visualizzato come "Frazione di nonmating tempo nel corteggiamento" di Rappresentante dei risultati.
  3. Utilizzando test di locomozione per valutare esaurimento
    1. Parzialmente assemblare il 32-Arena da camera con tutte le parti, ma il foglio di contrasto.
    2. Aspirare un moscerino maschio (mosche femmine) in ciascuna delle 32 camere in un'arena corteggiamento.
    3. Filmare le mosche per ~ 10 minuti utilizzando una videocamera consumer standard.
    4. Traccia le mosche con il plugin MTrack2 in ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).

7. Recupero accoppiamento rigido dopo 2-D sazietà Assay

  1. Eseguire un test sazietà 2-D, come descritto al punto 4, ma aspirare il maschio vola al termine del test.
  2. Isolare le mosche maschio a 23 ° C per il numero desiderato di giorni.
  3. Eseguire un test di sazietà 2-D con i maschi recuperati e segnare i loro accoppiamenti (cioè accoppiamenti) per appena 1 ora (vedi Rappresentante dei risultati).

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Risultati

Per caratterizzare unità di accoppiamento Drosophila, 3 giorni di età, maschi WT Canton-S sono stati testati in un saggio sazietà 2-D. Nel corso del test (4.5 h), i maschi si accoppiano una media di 4,8 ± 0,3 (media ± errore standard della media, SEM) volte. Accoppiamenti iniziano soprattutto nei primi 2 h (78%) (Figura 6A, 6B) e diventano meno frequenti come il saggio progredisce (Figura 6A, 6B). Questa diminuzione non è dovuta alla mancanza di...

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Discussione

Stati motivazionali possono essere saziati, mantenuti e recuperati 34. Vi presentiamo un test sazietà 2-D che misura in modo rapido e robusto tutti questi aspetti di accoppiamento auto in tempo reale. Questo test apre la possibilità di utilizzare mosca advanced manipolazioni genetiche per studiare le componenti molecolari e circuitali di un comportamento motivato.

Il test si basa sulla capacità di sazietà del maschio in tribunale con successo e copulare, e di interrom...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Mike Crickmore, Dragana Rogulja e Michelle Frank per i commenti sul manoscritto. Pavel Gorelik ha fornito supporto tecnico per la produzione delle arene comportamentali. Questo lavoro è stato condotto nel laboratorio di Mike Crickmore ed è supportato anche dalla Whitehall Foundation (Principal Investigator: Dragana Rogulja). S.X.Z. è Stuart H.Q. e Victoria Quan Fellow presso la Harvard Medical School.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1/16 di pollice acrilico trasparenteMcMaster-Carr8589K12Utilizzato per realizzare arene; vedere il materiale supplementare 1 per i disegni.
1/8 di pollice acrilico trasparenteMcMaster-Carr8589K42Utilizzato per realizzare arene; vedere il materiale supplementare 1 per i disegni.
3/16 pollice acrilico trasparenteMcMaster-Carr8560K219Utilizzato per realizzare arene; vedere il materiale supplementare 1 per i disegni.
1/32 pollice nero delrinMcMaster-Carr8575K132Utilizzato per realizzare arene; vedere il materiale supplementare 1 per i disegni.
Viti esagonali, lunghe 1 pollice (50x)McMaster-Carr92314A115 Usato per fare arene. Può essere sostituito con viti da 3/4 di pollice (92314A113, McMaster-Carr) per arene a 32 camere.
Dadi a testa zigrinata (25x)McMaster-Carr92741A100Utilizzato per fare arene. Può essere sostituito con dadi esagonali normali (90480A005, McMaster-Carr).
VideocameraCanonVixia HF R700Può essere sostituita da qualsiasi comcorder consumer.

Riferimenti

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